药学学报  2016, Vol. 51 Issue (6): 972-978   PDF    
特征含硫衍生物对硫熏牡丹皮检控的意义
李秀杨1,2, 段素敏2, 刘欢欢1,2, 徐金娣1,2, 孔铭1,2, 刘红权3, 李松林1,2     
1. 南京中医药大学附属中西医结合医院中药质量研究室, 江苏 南京 210028;
2. 江苏省中医药研究院中药代谢组研究室, 江苏 南京 210028;
3. 南京中医药大学附属中西医结合医院神经内科, 江苏 南京 210028
摘要: 二氧化硫残留量是当前硫熏药材检控的法定指标,但该指标能否客观反映药材硫熏程度有待深入研究。牡丹皮硫熏后会产生特征含硫衍生物。本文采用UPLC-QTOF-MS/MS对硫熏牡丹皮中特征含硫衍生物进行确证,并对贮藏前后特征含硫衍生物的量与二氧化硫残留量进行统计学分析。发现贮藏可导致药材中二氧化硫残留量显著下降,但特征含硫衍生物含量没有明显改变,说明二氧化硫残留量不一定能真正反映牡丹皮的硫熏程度,以特征含硫衍生物作为硫熏药材的检控指标更具适用性。
关键词: 牡丹皮     硫熏     二氧化硫残留     特征含硫衍生物     UPLC-QTOF-MS/MS    
Sulfur-containing derivatives as characteristic chemical markers in control of sulfur-fumigated Moutan Cortex
LI Xiu-yang1,2, DUAN Su-min2, LIU Huan-huan1,2, XU Jin-di1,2, KONG Ming1,2, LIU Hong-quan3, LI Song-lin1,2     
1. Department of Pharmaceutical Analysis, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210028, China;
2. Department of Metabolomics, Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nangjing 210028, China;
3. Department of Neurology, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210028, China
Abstract: The amount of sulfur dioxide residue is currently employed by Chinese Pharmacopoeia (CP) as an index to screen sulfur-fumigated herbs, but it is unclear if this index can objectively reflect the quality of sulfur-fumigated herbs. In the present study, sulfur-containing derivatives were confirmed in sulfur-fumigated Moutan Cortex (MC) by UPLC-QTOF-MS/MS analysis, and the contents of sulfur-containing derivatives and sulfur dioxide residues were statistically analyzed both in self-made and commercially available sulfur-fumigated and non-fumigated MC as well as the samples thereof before and after eight-month storage. The amount of sulfur dioxide was significantly decreased, but that of the newly-generated sulfur-containing markers was not, after eight-month storage of the sulfur-fumigated MC samples, indicating that the amount of sulfur dioxide residue may not be positively correlated with the quality of sulfur-fumigated MC. Therefore, sulfur dioxide residue index alone may not objectively reflect the sulfur-fumigation extent (quality change extent) of MC, more specific method using characteristic sulfur-containing derivatives as chemical markers should be developed to supplement the sulfur dioxide residue determination in the quality control of sulfur-fumigated MC.
Key words: Moutan Cortex     sulfur-fumigation     sulfur dioxide residue     sulfur-containing derivative     UPLCQTOF- MS/MS    

硫熏不仅可致药材二氧化硫等有害物残留,而且可致某些药材固有活性成分结构、组成和含量发生改变[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]以及体内过程和药效变化[8, 9],并存在潜在安全隐患。二氧化硫残留检测法是当前中国药典采用的硫熏药材检控方法[10],规定天麻等10味药材及其饮片不得超过400 mg·kg-1,牡丹皮等其他药材及其饮片不得超过150 mg·kg-1 [11]。然而有研究显示,二氧化硫会随着药材贮藏时间的延长不断逸失[12]。因此,二氧化硫残留量能否真正反映药材的硫熏程度以及对药材内在品质的影响程度亟待深入研究。

牡丹皮为毛茛科植物牡丹 (Paeonia suffruticosa Andr.) 的干燥根皮,秋季采挖根部,除去细根和泥沙,剥取根皮,晒干,或刮去粗皮,除去木心,晒干[10]。本课题组在产地调研时发现,为便于根皮的剥取,在产地初加工过程中牡丹根常被非法采用硫磺熏蒸。进一步研究发现,硫熏可导致牡丹皮产生特征含硫衍生物,药材内在质量发生了变化[13]

本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS和中国药典二氧化硫残留检测法,考察不同硫熏时间和贮藏8个月前后牡丹皮样品以及部分商品牡丹皮中二氧化硫残留量与其特征含硫衍生物含量的变化规律,比较二氧化硫残留量和特征含硫衍生物作为硫熏牡丹皮检控指标的适用性,为客观评价硫熏牡丹皮二氧化硫残留量指标的合理性和创建以特征含硫衍生物为指标的更专属的检控方法提供科学依据。

材料与方法 仪器与材料

Waters ACQUITY UPLCTM,配备双元溶剂梯度泵,自动进样器,二级阵列管检测器,Waters QTOF SYNAPT G2-S质谱仪 (美国Waters公司); Microfuge 16台式微量离心机 (美国贝克曼库尔特); AT201十万分之一电子天平 (瑞士梅特勒公司); KQ-250E型医用超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司); DJ-02灵巧型粉碎机 (上海淀久中药机械制造有限公司); 美国Milli-Q纯水器。调温电热碗 (DW-2,江苏省通州市张芝山镇决心化工电器厂),二氧化硫残留测定装置 (泰康医疗)。

新鲜药用牡丹采自安徽亳州 (编号: JSPACM- 13-C),由江苏省中医药研究院李松林研究员鉴定为毛茛科植物牡丹 (Paeonia suffruticosa Andr.)。商品牡丹皮药材购自国内药店 (表 1)。所有样品标本存江苏省中医药研究院中药代谢组研究室。

Table 1 Commercial Moutan Cortex samples

对照品芍药苷 (paeoniflorin,110736-200934)、没食子酸 (gallic acid,0831-9501) 购自中国食品药品 检定研究院; 没食子酸甲酯 (methyl gallate) 购自成都普菲德生物技术有限公司; 芍药苷亚硫酸酯 (paeoniflorin sulfonate) 购自上海友思生物技术有限公司; 氧化芍药苷 (oxypaeoniflorin)、丹皮酚原苷 (paeonolide)、丹皮酚新苷 (apiopaeonoside)、五没食子酰葡萄糖 (pentagalloyl glucose)、牡丹皮苷C (mudanpioside C)、苯甲酰氧化芍药苷 (benzoyloxy­paeoniflorin)、槲皮素(quercetin)、苯甲酰芍药苷 (benzoylpaeoniflorin)、儿茶素(catechin)、山柰酚 (kaempfero) 购自四川省维克奇生物科技有限公司,供含量测定用,纯度 > 98%。

甲醇(色谱纯,默克公司); 甲酸 (质谱纯,美国Sigma-Aldrich公司); 超纯水取自Milli-Q纯水器。

不同硫熏时间牡丹皮样品的制备及放置条件

取新鲜牡丹根,按药典规定加工方法,加工成1~2 mm的薄片,摊于纱布包裹的筛网上,静置30 min后,置于密闭容器中进行硫磺熏蒸 (药材与硫磺用量质量比为250:1),分别于0、1/6、1/4、1/3、1/2、2/3、1、26 h各取出牡丹皮150 g,置于烘箱中,于50 ℃下干燥2 h。将自制硫熏牡丹皮药材装于自封袋内,于室内阴凉干燥处保存。

供试品溶液的制备

取自制不同硫熏时间牡丹皮和商品牡丹皮样品,粉碎,过3号筛,精密称定约0.5 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入50% 甲醇50 mL,密塞,称定重量,25 ℃超声 (功率400 W,频率45 kHz) 提取60 min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失重量,摇匀,于9 600×g离心10 min,离心两次,取上清液,用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

二氧化硫残留量检测

取不同牡丹皮样品,粉碎为细粉,依2010版中国药典第一增补版中二氧化硫残留测定法[10],测定各样品的二氧化硫残留量。各样品平行测定3份,求平均值。

色谱条件

Waters ACQUITY HSS T3色谱柱 (100 mm × 2.1 mm,1.8 µm)。流动相为 (A) 0.1% 甲酸-甲醇,(B) 0.1% 甲酸-水,梯度洗脱,5% A (0~1 min),5%~17% A (1~4 min),17%~30% A (4~9 min),30%~70% A (9~16 min),70%~100% A (16~17 min)。流速0.3 mL·min-1,柱温35 ℃,样品室温度15 ℃,进样量为2 μL。

质谱条件

电喷雾离子源采用负离子ESI- 扫描模式,以氮气为雾化气和锥孔气,雾化气温度400 ℃,毛细管电压2.5 kV,锥孔电压30 V,离子源温度100 ℃,脱溶剂气温度450 ℃,反向锥孔气流50 L·h-1,脱溶剂气流800 L·h-1,低电压6 V,高电压30~60 V,扫描时间0.02 s。采用亮氨酸-脑啡肽 (leucine-enkephalin) 锁定质量数554.261 5 (-)。将UPLC-QTOF-MS/MS获得的原始数据采用Waters公司UPLC-QTOF-MS系统的商业软件MassLynx 4.1分析处理。

精密度

取硫熏2/3 h牡丹皮样品溶液,在上述色谱质谱条件下连续进样6次,记录各组分色谱峰的峰面积,并计算其RSD值。

重复性

精密称取硫熏2/3 h牡丹皮样品粉末6份,按“供试品溶液的制备”项下方法平行制备6 份供试液,在上述色谱质谱条件下进样分析,记录各组分色谱峰的峰面积,并计算其RSD值。

稳定性

取同一份供试品溶液,室温放置,分别于0、2、4、8、10和12 h进样分析,测定各组分的峰面积,并计算其RSD值。

数据统计分析

牡丹皮二氧化硫残留量与特征含硫衍生物含量的关联性用SPSS11.5软件进行相关性分析,相关性以Pearson相关系数来评价,相关系数P值采用双尾t检验。

结果 1 特征含硫衍生物的确证

采用UPLC-QTOF-MS成分表征方法对硫熏牡丹皮中特征含硫衍生物进行确证。牡丹皮中大部分成分在负离子模式下灵敏度较高。图 1为硫熏前后牡丹皮药材50%甲醇提取物UPLC-QTOF-MS/MS负离子模式下的BPI图。在现有色谱及质谱条件下,共鉴定了11个单萜苷、9个没食子苷、6个苯乙酮、4个黄酮、2个其他类成分以及3个含硫衍生物 (化合物101340)。其中,没食子酸、儿茶素、芍药苷亚硫酸酯、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、槲皮素、苯甲酰芍药苷和山柰酚根据对照品保留时间和特征碎片并结合文献信息确认,其他成分依据精确质量数、质谱特征并结合文献信息推断[14, 15, 16, 17, 18]。3个含硫衍生物仅在硫熏牡丹皮药材样品中检测到。

Figure 1 BPI chromatograms in negative mode of sulfur- fumigated and non-fumigated Moutan Cortex samples. S0: Non- fumigated; S26: Sulfur-fumigated for 26 h. Compound 10,13 and 40 were found in sulfur-fumigated samples. Peaks 1-46 are listed in Table 2

化合物13负离子模式下质谱图中存在m/z 543.117 8的[M-H]-峰,提示它的经验分子式为C23H28O13S,表明其为芍药苷加一分子二氧化硫。m/z 421.08碎片离子与[M-H]-相比减少了122 Da,对应丢失一分子苯甲酸,m/z 121.02的碎片离子进一步证实了该推断。m/z 259.02碎片离子与m/z 421.08离子相比少了162 Da,推测其为m/z 421.08丢失一分子葡萄糖产生。此外,m/z 497.11为[M-H]-失去CH2O2 (46 Da) 得到的碎片离子,m/z 497.11又可产生碎片 离子m/z 375.07以及m/z 213.02。将上述碎片离子信息结合对照品保留时间、QTOF精确质量信息以及文献[17, 18]进行对照,化合物13鉴定为芍药苷亚硫酸酯,其主要质谱裂解规律见图 2

高能量质谱碎片信息显示,化合物10和化合物40与芍药苷亚硫酸酯 (化合物13) 具有相似的裂解规律 (图 2),依据类似方法分别鉴定为氧化芍药苷亚硫酸酯 (oxypaeoniflorin sulfonate)和苯甲酰芍药苷亚硫酸酯 (benzoylpaeoniflorin sulfonate)[17, 18]。氧化芍药苷亚硫酸酯未见m/z 513.10的碎片离子 (图 2中虚线结构式),可能是该离子迅速碎裂成了其他碎片离子。

Figure 2 Major fragmentation pathways proposed for ions observed in the MS/MS spectra of three sulfur-containing derivatives
2 方法学考察 2.1 精密度 芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷亚硫酸

酯和苯甲酰芍药苷亚硫酸酯的RSD值分别为3.02%、2.92% 和2.51%,表明仪器的精密度良好。

2.2 重复性

芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷亚硫酸酯和苯甲酰芍药苷亚硫酸酯的RSD值分别为5.68%、3.93% 和3.15%,表明方法的重复性良好。

2.3 稳定性

芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷亚硫酸酯和苯甲酰芍药苷亚硫酸酯的RSD值分别为6.80%、4.22% 和5.67%,表明供试品溶液在室温下12 h内 稳定。

3 商品药材检测

对收集的部分商品牡丹皮药材二氧化硫残留量和特征含硫衍生物的量进行测定,特征含硫衍生物的量用BPI色谱峰面积进行半定量。如图 3A所示,除1号样品外,其他能检测到二氧化硫残留的商品牡丹皮样品,也能在其中检测到特征含硫衍生物,但二氧化硫残留量与特征含硫衍生物的量无明显对应关系。例如,2号样品二氧化硫残留量为53 ± 6 mg·kg-1,在中国药典限量范围内 (150 mg·kg-1),按中国药典限量标准评判为合格,而8号样品二氧化硫残留量为695 ± 29 mg·kg-1,远高于中国药典限量,评判为不合格,但2号样品中特征含硫衍生物的量却明显高于8号样品。商品牡丹皮二氧化硫残留量与特征含硫衍生物峰面积相关性分析结果见图 3B,各点呈无规则分布,Pearson相关系数为0.286,相关系数检验的概率P值为0.176 (显著性水平为0.01),认为两者总体为零相关。

Figure 3 Content of sulfur dioxide residue and sulfur-containing derivatives in commercially available Moutan Cortex samples (A) and correlation analysis of sulfur dioxide residue contents and peak area of sulfur-containing derivatives in commercial available Moutan Cortex samples (B)
4 自制硫熏牡丹皮药材贮藏前后比较

对同一批自制硫熏牡丹皮药材贮藏8个月前后样品中二氧化硫残留量和特征含硫衍生物的量进行对比,结果见图 4。随着硫熏时间延长,药材中二氧化硫残留量与3个特征含硫衍生物的含量也随之增加。硫熏1/6 h时,二氧化硫残留 (67 ± 6 mg·kg-1) 虽符合中国药典限量标准,但已检测到特征含硫衍生物 (图 4A)。放置8个月后,所有样品中二氧化硫残留量显著降低,但特征含硫衍生物的量无明显变化。例如,硫熏1 h样品在放置8个月后二氧化硫残留量从841 ± 10 mg·kg-1 (按中国药典限量标准判为不合格) 降低到131 ± 11 mg·kg-1 (按中国药典限量标准判为合格),但特征含硫衍生物的量并未发生明显改变 (图 4B)。将贮藏前后二氧化硫残留量的变化同特征含硫衍生物含量的变化进行相关性分析,Pearson相关系数为0.171,相关系数检验的概率P值为0.459 (显著性水平为0.01),认为两者总体为零相关 (图 4C)。

Table 2 Components identified from non-fumigated and sulfur-fumigated Moutan Cortex. Identified by reference compounds

Figure 4 Contents of sulfur dioxide residue and sulfur- containing derivatives in Moutan Cortex samples with different sulfur-fumigation and storage duration (A: Before storage; B: After storage for eight months; P < 0.05,**P < 0.01 vs A) and correlation analysis of sulfur dioxide residue declination and sulfur-containing derivatives peak area declination in different sulfur-fumigation and storage duration Moutan Cortex samples (C)
讨论

硫熏不但导致牡丹皮药材二氧化硫残留,而且诱导活性成分转化为含硫衍生物,明显影响了药材的内在质量。目前对于硫熏药材药理毒理研究尚不足,小鼠和人体肝细胞及小鼠体内急性毒性实验均表明芍药苷亚硫酸酯无明显毒性[19],长期毒性暂无报道,但芍药苷亚硫酸酯在大鼠体内不会完全转化为芍药苷[20],初步研究证明芍药苷亚硫酸酯不具有芍药苷的药理活性[21],提示硫熏对牡丹皮的有效性会带来潜在影响。因此,对硫熏牡丹皮进行检控很有必要。

硫熏牡丹皮放置后,特征含硫衍生物的量未明显改变,二氧化硫逸失量与特征含硫衍生物的量不成正相关,商品牡丹皮二氧化硫残留量与特征含硫衍生物的量也无明显正相关,主要原因可能是由于市售硫熏药材放置时间不同,二氧化硫逸失但特征含硫衍生物量基本不变所致。特征含硫衍生物的量可以真正反映牡丹皮药材的硫熏程度[13],因此,在硫熏牡丹皮评控指标的重现性和专属性方面,特征含硫衍生物比二氧化硫残留更具有优势。

总之,特征含硫衍生物作为硫熏牡丹皮的检控指标更具适用性,可以考虑作为药典硫熏牡丹皮检控方法的补充。目前研究还发现,硫熏也会导致其他药材[1, 9, 17, 22, 23]产生含硫衍生物,绝大部分为亚硫酸酯类物质,本研究也可为其他硫熏药材专属性检控指标的确定提供借鉴。

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