药学学报  2016, Vol. 51 Issue (6): 954-960   PDF    
噁二唑类黄嘌呤氧化酶抑制剂的设计合成及活性评价
严定安1, 张蕾1, 田金英2, 叶菲2, 肖志艳1     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 活性物质发现与适药化研究北京市重点实验室, 北京 100050;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室, 北京 100050
摘要: 黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)是治疗高尿酸血症及痛风的重要靶标。本文基于已上市的非嘌呤类XO抑制剂非布索坦(febuxostat)和托匹司他(topiroxostat),采用分子拼接和电子等排原理,设计合成了14个噁二唑类化合物并评价了它们对黄嘌呤氧化酶的抑制作用,其中5个化合物在10 μmol·L-1浓度下具有明显的体外酶抑制活性。
关键词: 黄嘌呤氧化酶     高尿酸血症     噁二唑衍生物    
Design, synthesis and biological evaluation of oxadiazole derivatives as xanthine oxidase inhibitors
YAN Ding-an1, ZHANG Lei1, TIAN Jin-ying2, YE Fei2, XIAO Zhi-yan1     
1. Beijing Key Laboratory of Active Substance Discovery and Druggability Evaluation, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;
2. Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Xanthine oxidase (XO) is an important target for the treatment of hyperuricemia and gout. Based on the two known non-purine xanthine oxidase inhibitors, febuxostat and topiroxostat, 14 oxadiazole derivatives have been designed and synthesized. These compounds have been evaluated against XO and five of them exhibited significant inhibitory activities at the concentrations below 10 μmol·L-1.
Key words: xanthine oxidase     hyperuricemia     oxadiazole derivative    

尿酸是嘌呤类化合物在人体中的最终代谢产物,人体尿酸合成过多或尿酸排泄过少都有可能造成血尿酸水平增高,引起高尿酸血症。近年来研究表明,持续的高血尿酸水平 (sUA > 6 mg·dL-1) 不仅是痛风的主要诱因[1],而且与高血压、2型糖尿病、肥胖症、慢性肾病、心血管疾病[2, 3]等多种疾病密切相关。

黄嘌呤氧化酶 (XO) 是一种黄素蛋白酶,它存在于各种生物体中,催化生物体内由嘌呤底物生成尿酸的过程。XO的晶体结构表明[4],它由两个完全对称的结构单元组成,每个结构单元为145 kD,其催化中心分为3个结构域: N端域的两个铁-硫氧化还原中心 (iron-sulfur centers,Fe/SI,Fe/SII)、中间域的黄素腺嘌呤二核苷酸 (flavin adenine dinucleotide,FAD)、C端域的钼辅因子 (molybdenum cofactor,Mo-co) 结合部位,即钼喋呤中心 (molybdopterin,Mo-Pt)。其中钼喋呤中心是XO催化次黄嘌呤和黄嘌呤分别生成黄嘌呤和尿酸的关键位点。

XO抑制剂作为小分子降尿酸药物具有作用机 制明确、疗效显著等优点,一直备受关注。目前已 经上市的XO抑制剂主要有嘌呤类抑制剂别嘌醇 (allopurinol) 和非嘌呤类抑制剂非布索坦 (febuxostat)、托匹司他 (topiroxostat) (表 1)。

Table 1 Small-molecule xanthine oxidase inhibitors as therapeutic drugs

作为酶底物类似物,别嘌呤醇虽然在临床上得到了广泛的应用,但由于其对XO的抑制活性并不显著,而且存在较多的不良反应,尤其是可能发生危及生命的别嘌呤醇超敏反应综合征[5],因此,自别嘌呤醇1966年上市至今,尚未有新的嘌呤类抑制剂应用于高尿酸血症的临床治疗。而非嘌呤类XO抑制剂则由于其抑酶活性显著、不良反应较少的优势受到广泛关注。

非布索坦和托匹司他是分别于2009年及2013年上市的非嘌呤类XO抑制剂。二者与XO复合物的晶体结构表明,非布索坦 (PDB ID: 1N5X) 占据了酶的疏水空腔,与周围氨基酸发生相互作用 (图 1a),其结构中噻唑环上的甲基距钼喋呤中心最近 (约4.9 Å),但与钼离子并无直接作用[6]。而托匹司他 (PDB ID: 1V97) 作用于通往钼离子的疏水通道,与活性部位的氨基酸残基有多种相互作用 (图 1b),并且其结构中的吡啶环可以与钼离子形成Mo-O-C配位作用[7]

Figure 1 The interaction modes of febuxostat (a) and topiroxostat (b)

将晶体结构中的非布索坦与托匹司他叠合发现: 二者均占据 XO酶的疏水通道,非布索坦中的噻唑环、氰基取代苯环分别与托匹司他中的三氮唑环、氰基取代吡啶环重合 (图 2)。而非布索坦中的烷氧基、托匹司他三氮唑环上的吡啶基则分别与XO 的疏水腔及钼离子存在相互作用。为了寻找结构新颖XO小分子抑制剂,本文以非布索坦 (1) 和托匹司他 (2) 为模板分子,依据二者与XO的结合特征,采用分子拼接和电子等排原理设计了一系列噁二唑类化合物 (图 3)。

Figure 2 Overlap of febuxostat (blue) and topiroxostat (red) in the active site of XO

Figure 3 Molecular design of oxadiazole derivatives

Scheme 1 Synthesis of compounds 5a-5n. Reagents and conditions: (a) R2Br,K2CO3,KI,DMF,80 ℃; (b) NH2OH∙HCl,NaHCO3,EtOH,95 ℃; (c) TBTU,HOBt,DMF,r.t.; (d) DMF,110 ℃

采用合成路线1所示方法,合成了14个噁二唑类化合物 (5a5n)。2位取代的对羟基苯甲腈1与 卤代烷烃反应得到2,然后氰基经盐酸羟胺还原得到肟中间体3。化合物3与吡啶羧酸在缩合剂TBTU [O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N ',N '-tetramethyluronium­tetrafluoroborate] 和HOBt (N-hydroxybenzotriazole) 的作用下得到缩合产物4a4n,后者以DMF作溶剂,加热缩合生成噁二唑衍生物 (5a5n)。

化合物5a5n的设计旨在探究苯环上取代基R1 (5a5c)、烷氧基侧链OR2 (5d5i) 以及吡啶环与噁二唑的连接位置及取代基R3 (5j5n) 对噁二唑类化合物抑制XO酶活性的影响。

结果与讨论 1 目标化合物的结构确证

采用上述合成路线,共合成了14个目标化合物, 结构均经1H NMR和LC-MS确证且未见文献报道,其理化性质和谱学数据见表 2表 3

Table 2 Physical data ofcompounds 5a-5n

Table 3 Spectral data of compounds 5a-5n
2 目标化合物的XO酶抑制活性及初步结果讨论

在10 μmol·L-1浓度下,测定了全部目标化合物5a5n对XO酶的抑制活性,其中5个化合物在测试浓度下,对XO酶的单浓度抑制率超过30%。化合物5a的体外酶抑制活性显著,在10 μmol·L-1浓度下对XO的抑制率达到74.6% (表 4)。

Table 4 Inhibitory activity of selected compounds against XO. The percentage inhibition was measured under the concentration of 10 μmol·L-1

化合物5a5n的活性结果表明: 苯环上取代基R1、烷氧基侧链中R2以及吡啶环与噁二唑的连接位置及环上取代基R3对化合物的XO酶抑制活性有明显影响。具有不同苯环间位取代基R1的各化合物的活性顺序为: NO2 > Br > Cl,提示取代基R1的吸电子能力及体积均可能影响抑酶活性; 化合物5d5i的活性结果显示: 烷氧基侧链中的R2为异丁基时活性最好 (5a),为C3~C4烷基时,活性在一定程度上保持 (5d,5e vs 5a),但R2体积进一步增大时,活性显著降低 (5f5i vs 5a); 而化合物5j5n的活性结果则表明: 吡啶环上R3为甲基或氯取代时,抑酶活性下降(5j,5l vs 5a; 5k vs 5c),但吡啶环由4位连接变为3位连接时,活性亦下降 (5m vs 5a; 5n vs 5c)。

化合物5a的分子对接研究结果显示: 苯环上的硝基与Asn768、Glu802形成氢键相互作用,噁二唑环和吡啶环则与Phe1009、Phe914形成π-π相互作用 (图 4)。但由于化合物5a在结合腔内的位置和取向与托匹司他略有不同,吡啶环并未如预期与钼离子形成配位,同时,又缺失了非布索坦中羧基与活性腔形成的氢键相互作用,因此,化合物5a的抑酶活性弱于非布索坦。

Figure 4 The interaction mode of 5a suggested by docking study. Hydrogen bonding interactions are showed with green broken lines,and π-π stacking are showed with purple broken lines
3 小结

依据上市药物非布索坦和托匹司他与XO的结合特征,采用分子拼接和电子等排原理设计了14个噁二唑类化合物,评价了它们对黄嘌呤氧化酶的抑制活性,获得了5个具有明显抑酶活性的新化合物。初步探讨了该类化合物抑制XO活性的构效关系,并通过分子对接,研究了其与XO可能的作用模式,为进一步结构改造优化提供了参考。

实验部分

熔点采用Fisher Scientific 显微熔点仪测定,温度未校正,核磁氢谱采用Varian Mercury 400型核磁共振仪测定,TMS为内标。质谱采用LC/MDC-MS 串联质谱仪 (Thermo,USA) 测定。柱色谱分离采用硅胶H (200~300目),薄层色谱硅胶为烟台江友硅胶开发有限公司所产的HSGF 254型硅胶板。实验所用试剂为化学纯或分析纯,购买后未作进一步处理,直接使用。所用溶剂均为分析纯,其中无水溶剂均经美国创新科技 (Innovative Technology) 所产的无水溶剂纯化系统除水后使用,其他溶剂未特别指出则未经处理。

1 化学合成 1.1 N-(异烟酰氧基)-4-异丁氧基-3-硝基苄胺肟

(4a) 的制备 将1(2.0 g,12.0 mmol) 溶于30 mL DMF中,加入溴代烷 (13.2 mmol)、碳酸钾 (3.3 g,24.0 mmol)、碘化钾 (39.8 mg,0.24 mmol),80 ℃加热搅拌10 h。待反应完全后,蒸除DMF,乙酸乙酯萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂后柱色谱分离 (石油醚-乙酸乙酯=10:1) 得到化合物2,收率66%~84%。

将碳酸氢钠 (1.3 g,15.8 mmol) 溶于10 mL水 中,加入盐酸羟胺 (1.10 g,15.8 mmol),再加入2 (7.9 mmol) 溶于20 mL乙醇的溶液中,95 ℃下加热回流12 h。待反应完全后,蒸除乙醇,加入乙酸乙酯和水萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂得到黄色固体。硅胶柱色谱分离 (石油醚−乙酸乙酯,5:1) 得到化合物3,收率73%~95%。

将异烟酸 (246.0 mg,2.0 mmol)、TBTU (642.2 mg,2.0 mmol)、HOBt (55 mg,0.4 mmol) 及DIEA (517.2 mg,4.0 mmol) 溶于15 mL无水DMF中,室温搅拌5 min后,加入3(506.2 mg,2.0 mmol),室温搅拌8 h。待反应完全后,向反应液中加入乙酸乙酯和水萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂后柱色谱分离 (石油醚-乙酸乙酯,3:1~1:1) 得到白色固体4a,收率53%。

4a: mp 145~147 ℃; 1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 8.82 (d,J = 5.3 Hz,2H,ArH),8.20 (d,J = 2.1 Hz,1H,ArH),7.99 (dd,J = 8.8,2.1 Hz,1H,ArH),7.88 (d,J = 5.8 Hz,2H,ArH),7.11 (d,J = 8.8 Hz,1H,ArH),5.33 (s,2H,NH2),3.91 (d,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH),2.23~2.11 (m,1H,OCH2CH),1.06 (d,J = 6.6 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 359.134 5 (Calcd: 359.135 0)。

采用类似方法合成了4b4n

4b: 收率69%; mp 150~152 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.80 (d,J = 5.8 Hz,2H,ArH),8.06 (d,J = 5.9 Hz,2H,ArH),7.82 (d,J = 2.0 Hz,1H,ArH),7.71 (dd,J = 8.7,2.0 Hz,1H,ArH),7.23 (d,J = 8.7 Hz,1H,ArH),7.07 (s,2H,NH2),3.89 (d,J = 6.5 Hz,2H,OCH2CH),2.09~2.03 (m,1H,OCH2CH),1.00 (d,J = 6.7 Hz,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 348.110 1 (Calcd: 348.110 9)。

4c: 收率65%; mp 140~142 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.80 (dd,J = 4.5,1.5 Hz,2H,ArH),8.06 (dd,J = 4.5,1.5 Hz,2H,ArH),7.97 (d,J = 2.1 Hz,1H,ArH),7.75 (dd,J = 8.6,2.1 Hz,1H,ArH),7.19 (d,J = 8.8 Hz,1H,ArH),7.07 (s,2H,NH2),3.89 (d,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH),2.09~2.03 (m,1H,OCH2CH),1.01 (d,J = 6.7 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 392.059 6 (Calcd: 392.060 4)。

4d: 收率40%; mp 149~151 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.81 (d,J = 5.5 Hz,2H,ArH),8.26 (d,J = 1.8 Hz,1H,ArH),8.07 (d,J = 5.7 Hz,2H,ArH),8.03 (dd,J = 8.8,1.6 Hz,1H,ArH),7.47 (d,J = 8.9 Hz,1H,ArH),7.21 (s,2H,NH2),4.18 (t,J = 6.3 Hz,2H,OCH2CH2),1.79~1.71 (m,2H,OCH2CH2CH3),0.98 (t,J = 7.3 Hz,3H,OCH2CH2CH3); MS (ESI): m/z [M+H]+ 345.118 6 (Calcd: 345.119 3)。

4e: 收率46%; mp 120~122 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.81 (d,J = 4.5 Hz,2H,ArH),8.25 (d,J = 2.2 Hz,1H,ArH),8.07 (dd,J = 4.6,1.4 Hz,2H,ArH),8.02 (dd,J = 8.9,2.2 Hz,1H,ArH),7.45 (d,J = 9.0 Hz,1H,ArH),7.21 (s,2H,NH2),4.10 (d,J = 7.0 Hz,2H,OCH2CH),1.27~1.21 (m,1H,CH2CH(CH2)2),0.60~0.55 (m,2H,CH2CH(CH2)2),0.38~0.34 (m,2H,CH2CH(CH2)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 357.118 6 (Calcd: 357.119 3)。

4f: 收率71%; mp 105~107 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.81 (d,J = 5.3 Hz,2H,ArH),8.25 (d,J = 1.6 Hz,1H,ArH),8.07 (d,J = 5.5 Hz,2H,ArH),8.03 (dd,J = 8.8,1.6 Hz,1H,ArH),7.49 (d,J = 8.9 Hz,1H,ArH),7.21 (s,2H,NH2),4.24 (t,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH2),1.81~1.75 (m,1H,CH2CH(CH3)2),1.63 (q,J = 6.5 Hz,2H,CH2CH2CH(CH3)2),0.91 (d,J = 6.4 Hz,6H,CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 373.150 1 (Calcd: 373.150 6)。

4g: 收率55%; mp 95~97 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.81 (d,J = 5.9 Hz,2H,ArH),8.26 (d,J = 2.1 Hz,1H,ArH),8.07 (d,J = 5.9 Hz,2H,ArH),8.03 (dd,J = 8.9,2.1 Hz,1H,ArH),7.47 (d,J = 9.0 Hz,1H,ArH),7.21 (s,2H,NH2),4.03 (d,J = 5.9 Hz,2H,OCH2CH),1.80~1.62 (m,6H,cyclohexyl-H),1.29~1.04 (m,5H,cyclohexyl-H); MS (ESI): m/z [M+H]+ 299.165 6 (Calcd: 399.166 3)。

4h: 收率82%; mp 160~162 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.81 (d,J = 6.0 Hz,2H,ArH),8.28 (d,J = 2.2 Hz,1H,ArH),8.07 (dd,J = 4.5,1.5 Hz,2H,ArH),8.04 (dd,J = 8.9,2.2 Hz,1H,ArH),7.57 (d,J = 9.0 Hz,1H,ArH),7.47 (d,J = 7.2 Hz,2H,ArH),7.41 (t,J = 7.4 Hz,2H,ArH),7.34 (t,J = 7.2 Hz,1H,ArH),7.22 (s,2H,NH2),5.39 (s,2H,OCH2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 393.118 6 (Calcd: 393.119 3)。

4i: 收率58%; mp 230~232 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.81 (d,J = 5.5 Hz,2H,ArH),8.28 (d,J = 1.6 Hz,1H,ArH),8.07 (d,J = 5.8 Hz,2H,ArH),8.04 (d,J = 1.8 Hz,1H,ArH),7.57 (d,J = 8.9 Hz,1H,ArH),7.52 (dd,J = 7.7,6.0 Hz,2H,ArH),7.26 (d,J = 8.8 Hz,2H,ArH),7.22 (s,2H,NH2),5.37 (s,2H,OCH2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 411.109 0 (Calcd: 411.109 9)。

4j: 收率48%; mp 88~90 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.65 (d,J = 5.0 Hz,1H,ArH),8.26 (d,J = 1.6 Hz,1H,ArH),8.03 (dd,J = 8.8,1.6 Hz,1H,ArH),7.95 (s,1H,ArH),7.85 (d,J = 4.8 Hz,1H,ArH),7.47 (d,J = 9.0 Hz,1H,ArH),7.19 (s,2H,NH2),4.00 (d,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH),2.57 (s,3H,CH3),2.08~2.01 (m,1H,OCH2CH),0.98 (d,J = 6.7 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 373.150 1 (Calcd: 373.150 6)。

4k: 收率46%; mp 88~90 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.64 (d,J = 5.1 Hz,1H,ArH),7.96 (d,J = 2.0 Hz,1H,ArH),7.95 (s,1H),7.84 (d,J = 5.0 Hz,1H,ArH),7.75 (dd,J = 8.6,1.7 Hz,1H,ArH),7.19 (d,J = 8.7 Hz,1H,ArH),7.05 (s,2H,NH2),3.89 (d,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH),2.57 (s,3H,CH3),2.09~2.03 (m,1H,OCH2CH),1.01 (d,J = 6.7 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 406.075 6 (Calcd: 406.076 1)。

4l: 收率48%; mp 158~160 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.63 (d,J = 4.8 Hz,1H,ArH),8.25 (d,J = 7.2 Hz,2H,ArH),8.03 (m,2H,ArH),7.47 (d,J = 8.9 Hz,1H,ArH),7.29 (s,2H,NH2),4.00 (d,J = 6.2 Hz,2H,OCH2CH),2.08~2.01 (m,1H,OCH2CH),0.98 (d,J = 6.6 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 393.095 2 (Calcd: 393.096 0)。

4m: 收率71%; mp 158~160 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 9.32 (d,J = 1.5 Hz,1H,ArH),8.82 (dd,J = 4.8,1.6 Hz,1H,ArH),8.50 (dt,J = 8.0,1.9 Hz,1H,ArH),8.27 (d,J = 2.2 Hz,1H,ArH),8.04 (dd,J = 8.9,2.2 Hz,1H,ArH),7.57 (dd,J = 8.2,5.1 Hz,1H,ArH),7.46 (d,J = 9.0 Hz,1H,ArH),7.19 (s,2H,NH2),4.00 (d,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH),2.08~2.01 (m,1H,OCH2CH),0.98 (d,J = 6.7 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 359.134 2 (Calcd: 359.135 0)。

4n: 收率88%; mp 213~215 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 9.17 (d,J = 1.9 Hz,1H,ArH),8.39 (dd,J = 8.1,2.2 Hz,1H,ArH),8.26 (d,J = 2.2 Hz,1H,ArH),8.03 (dd,J = 8.9,2.2 Hz,1H,ArH),7.46 (d,J = 9.0 Hz,1H,ArH),7.42 (d,J = 8.1 Hz,1H,ArH),7.15 (s,2H,NH2),4.00 (d,J = 6.4 Hz,2H,OCH2CH),2.56 (s,3H,CH3),2.08~2.01 (m,1H,OCH2CH),0.97 (d,J = 6.8 Hz,6H,OCH2CH(CH3)2); MS (ESI): m/z [M+H]+ 373.149 7 (Calcd: 373.150 6)。

1.2 (4-吡啶基)-(4-异丁基-3-硝基苯基)-1,2,4-噁二唑的制备 (5a)

4a (71.5 mg,0.2 mmol) 溶于4 mL无水DMF中,115 ℃下加热回流6 h。待反应完全后,向反应液中加入乙酸乙酯和水萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂后得到白色粉末状固体,乙醚洗,过滤,得到5a,收率73%。

采用类似方法合成了5b5n,光谱数据见表 3

2 分子模拟实验

采用Accelrys公司的Discovery Studio 2016软件包中Small Molecules模块下的Diverse Conformation Generation产生构象,Conformation Method设置为“BEST”,其他参数采用缺省值; 利用Receptor- Ligand Interactions模块下的Dock ligands (Libdock) 程序进行分子对接,Input Receptor: 1N5X,其他参数采用缺省值。2D相互作用关系图采用MOE (Chemical Computing Group,Inc.) 软件包制得。

3 XO体外抑酶活性实验

样品溶解于DMSO中,配制成10 mmol·L-1贮备液。在37 ℃、pH 7.4下,采用96孔板测定各化合物对XOD-催化黄嘌呤 (XAN) 水解作用的影响。反应体系中含10 μmol·L-1的化合物 (终浓度)、3 U·L-1 XOD (对照组不加,以0.01% DMSO代替) 及缓冲液 (3.5 mmol·L-1 KH2PO4、15.2 mmol·L-1 K2HPO4、0.25 mmol·L-1 EDTA及50 μmol·L-1 XAN,pH 7.4)。采用 分光光度计 (molecular devices),检测293 nm波长下产物尿酸的吸收,来测定XOD-催化的黄嘌呤 (XAN) 水解作用,依据OD值计算抑制率。

参考文献
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