2. 重庆市中药研究院, 重庆 400065
2. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China
加味佛手散(Jiawei Foshou San,JWFSS)胶囊是作者课题组自主研发的抗子宫内膜异位症的中药新药,是由中医妇科经典名方佛手散药物当归、川芎的主要有效成分阿魏酸(ferulic acid,FA)、川芎嗪(ligustrazine,LZ)以及具有止痛作用的延胡索乙素(tetrahydropalmatine,THP)组成的中药单体复方。前期研究[1, 2, 3]表明,该方疗效明显,没有显著毒副作用。
细胞色素P450(简称CYP450)酶系是肝微粒体混合功能氧化酶系的主要成分,是介导临床药物的主要代谢酶,对CYP450酶的抑制可改变联合用药后的药代动力学行为,进而影响临床用药的有效性和安全性[4]。本研究在大鼠和人肝微粒体孵育体系中,系统评价加味佛手胶囊及其组分对CYP450同工酶的抑制作用,并比较人和大鼠间的种属差异,为加味佛手散胶囊临床安全合理用药提供相应试验资料。
材料与方法 仪器液质联用系统(API 4000 Qtrap,SER.N: AR26221101,岛津LC-20AD泵;SIL-20AC恒温自动进样器,CTO-20A柱温箱,CBM-20A控制器,ESI离子源;Analyst Software 1.5.2色谱工作站,美国Beckman Coulter公司);Avanti J-301冷冻高速离心机(美国Beckman Coulter公司);Elix3超纯水系统(美国Millipore公司),EL2204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司),SHB-ⅢS循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),微量移液器(德国Eppendorf公司)。
药品与试剂加味佛手散胶囊(本实验室自制,实验用药批号: 20145202);阿魏酸原料药(批号:QZ-100427,纯度98%)、盐酸川芎嗪原料药(批号:QZ-100511,纯度98%)、延胡索乙素原料药(批号:QZ-091224,纯度98%)均购于南京泽朗有限责任公司;非那西丁(phenacetin,PHE)、对乙酰氨基酚(acetaminophen,ATP)、甲苯磺丁脲(tolbutamide,TOL)、4-羟基甲苯磺丁脲(4-hydroxytolbutamide,OHTOL)、右美沙芬(dextromethorphan,DEXM)、去甲右美沙芬(dextrorphan,DEXP)、咪达唑仑(midazolam,MDZ)、1-羟基咪达唑仑(1-hydroxymidazolam,OHMDZ)、氯唑沙宗(chlorzoxazone,CHL)、6-羟基氯唑沙宗(6-hydroxychlorzoxazone,OHCHL)、卡马西平(carbamazepine)等均购自中国食品药品检定研究院;α-萘黄酮、磺胺苯吡啶、奎尼丁、酮康唑等均购自天津一方科技有限公司;还原型辅酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide,NADPH)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国Sigma公司;25供体女性混合人肝微粒体(批号: RFB)、20供体雌性混合大鼠肝微粒体(批号: RHSO)均购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司,人源材料经美国Bioreclamation IVT伦理委员会同意。甲醇为质谱纯,购自美国Fisher公司;所有其他溶剂和化学试剂均为分析纯或以上。
色谱和质谱条件[5]色谱柱为(Agilent Zorbax XDB-C18,2.1 mm×50 mm,3.5 μm);进样量: 10 μL;检测波长: 280 nm;流速:0.45 mL·min-1;流动相为含0.1%甲酸(A)和甲醇(B),梯度洗脱程序: 0~0.5 min为98%A,2% B;0.5~1 min为2% A,98% B;1~2.5min保持不变,2.5~3.0 min为98% A,2% B,3.0~4.0min保持不变。
离子源: 电子轰击式离子源(ESI);扫描方式:多反应监测(MRM);气帘气体为20 psi(1 psi ≈ 6.9 kPa);离子喷射电压(IS): 5 kV(ESI+)、-4.2 kV(ESI-);源内气体1(Gas 1)和源内气体2(Gas 2)分别为55和50psi,离子源温度为550 ℃。5个探针药物代谢产物和内标的MRM质谱检测参数如表 1所示。
参照文献[6],建立200 µL的孵育体系:包含0.1mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4),0.3 mg·mL-1大鼠或人肝微粒体蛋白50 µL,5种混合探针药物25 µL(非那西丁10 µmol·L-1,右美沙芬2.5 µmol·L-1,甲苯磺丁脲100 µmol·L-1,咪达唑仑5 µmol·L-1,氯唑沙宗20 µmol·L-1)。孵育体系分为药物组、阳性抑制剂组和阴性对照组。药物组分别加入阿魏酸、川芎嗪、延胡索乙素、加味佛手散胶囊;阳性抑制剂分别为α-萘黄酮(α-naphthoflavone,CYP1A2)、磺胺苯吡啶(sulfaphenazole,CYP2C9)、奎尼丁(quinidine,CYP2D6)及酮康唑(ketoconazole,CYP2E1,CYP3A4)。阳性抑制剂和受试药物在孵育液中浓度范围见表 2。阴性对照组不加受试药或阳性抑制剂。所有的孵育反应都是在37 ℃水浴上进行。加入1 mmol·L-1NADPH 100 µL启动反应,孵育15 min。加入400 µL冰甲醇(含有内标卡马西平,75 ng·mL-1)终止反应。10 000×g离心5 min,取上清液,应用“Cocktail”探针法以及LC-MS/MS法分析各探针药物及代谢产物的浓度。每个浓度3个平行样品。
通过测定探针底物代谢产物的相对生成量来确定酶的相对活性。由下式计算受试药物作用下的相对酶活性(Erel),式中C0为阴性对照组孵育反应后代谢产物生成量,Ci为给药组孵育反应后代谢产物生成量。
${E_{rel}}=\frac{{{C_{\rm{i}}}}}{{{C_0}}} \times 100\% $ |
用GraphPadPrism version 5.0(GraphPad software Inc,CA,USA)软件将Erel对药物浓度的Log值作图,由抑制曲线得到IC50值。
结果 1 肝微粒体孵育体系的验证由药物对5种CYP450酶亚型的抑制曲线计算得到IC50值。按照通用的CYP酶抑制剂强度的分级规则[7],若IC50 >10µmol·L-1为弱抑制剂;1 µmol·L-1 <IC50 <10µmol·L-1为中等强度抑制剂;IC50 <1µmol·L-1,为强抑制剂。首先用已知的阳性抑制剂,分别验证大鼠和人肝微粒体孵育体系。阳性抑制剂对相应酶的亚型均表现出明显的抑制作用,各CYP450酶亚型的IC50值均小于2 µmol·L-1,表明孵育体系满足CYP酶抑制活性的评价要求(表 3、表 4)。
阿魏酸组和川芎嗪组在最高浓度500 µmol·L-1时,二者的Erel均大于50%,所以无法计算IC50。延胡索乙素组在最高浓度500µmol·L-1时,对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2D2、CYP2E1的Erel大于50%,对CYP3A1/2的Erel小于50%,所以无法计算延胡索乙素对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2D2、CYP2E1的IC50,而能得出对CYP3A1/2的IC50。加味佛手散胶囊组在最高浓度3 200 mg·L-1时,对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9的Erel大于50%,对CYP2D2、CYP2E1、CYP3A1/2的Erel小于50%,故无法计算加味佛手散胶囊对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9的IC50,而能得出对CYP2D2、CYP2E1、CYP3A1/2的IC50。
阿魏酸组和川芎嗪组对大鼠肝5种CYPs的IC50,延胡索乙素组对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2D2、CYP2E1的IC50,加味佛手散胶囊组对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9的IC50均无法计算,提示阿魏酸和川芎嗪对大鼠肝5种CYPs的酶活性,延胡索乙素对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2D2、CYP2E1的酶活性,加味佛手散胶囊对大鼠肝CYP1A2、CYP2C9的酶活性产生明显抑制作用的可能性很小。延胡索乙素组对大鼠肝CYP3A1/2的IC50为7.46µmol·L-1,显示延胡索乙素是大鼠肝CYP3A1/2的中等强度抑制剂。加味佛手散胶囊组对大鼠肝CYP2D2、CYP2E1、CYP3A1/2的IC50分别为241.3、369.8和293.0 mg·L-1,均远远小于加味佛手散胶囊在孵育液中最高浓度的一半1 600 mg·L-1,初步提示加味佛手散胶囊对大鼠肝CYP2D2、CYP2E1、CYP3A1/2的酶活性可能有抑制作用(表 3)。
3 加味佛手散胶囊及其组分对人肝微粒体CYP450酶的抑制活性阿魏酸组和川芎嗪组在最高浓度500 µmol·L-1 时,二者的Erel均大于50%,所以无法计算IC50。延胡索乙素组在最高浓度500µmol·L-1时,对人肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4的Erel大于50%,对CYP2D6的Erel小于50%,所以无法计算延胡索乙素对人肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4的IC50,而能得出对CYP2D6的IC50。加味佛手散胶囊组在最高浓度3 200 mg·L-1时,对人肝CYP1A2、CYP2C9的Erel大于50%,对CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的Erel小于50%,故无法计算加味佛手散胶囊对人肝CYP1A2、CYP2C9的IC50,而能得出对CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的IC50。
阿魏酸组和川芎嗪组对人肝5种CYPs的IC50,延胡索乙素组对人肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4的IC50,加味佛手散胶囊组对人肝CYP1A2、CYP2C9的IC50均无法计算,提示阿魏酸和川芎嗪对人肝5种CYPs的酶活性,延胡索乙素对人肝CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4的酶活性,加味佛手散胶囊对人肝CYP1A2、CYP2C9的酶活性产生明显抑制作用的可能性很小。延胡索乙素组对人肝CYP2D6的IC50为9.237µmol·L-1,显示延胡索乙素是人肝CYP2D6的中等强度抑制剂。加味佛手散胶囊组对人肝CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的IC50分别为123.9、189.9和171.3 mg·L-1,远远小于加味佛手散胶囊在孵育中最高浓度的一半1 600 mg·L-1,初步提示加味佛手散胶囊对人肝CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4酶活性可能有抑制作用(表 4)。
讨论体外模型在新药开发阶段由于简单可行而得到广泛应用。通过体外实验可以推断药物的代谢途径以及参与代谢的相关酶系,同时可判断药物是否由于竞争CYP450酶系而发生相互反应[8]。鸡尾酒探针药物法结合体外肝微粒体孵育测定酶活性是评价药物CYP450酶抑制作用的一个常用方法,也是美国FDA规定的方法。本文采用该方法研究受试药的体外代谢作用,其结果具有可信性。
体外单药实验的结果显示,阿魏酸和川芎嗪在大鼠和人肝微粒体CYP450中引起酶抑制作用的可能性比较小,延胡索乙素是人肝微粒体CYP2D6酶活性的中等强度抑制剂。这与同类研究报道一致[9, 10, 11]。然而,延胡索乙素对大鼠的CYP2D2却无体外抑制作用,对大鼠的CYP3A1/2酶活性有体外抑制作用,而对人的CYP3A4却无体外抑制作用。推测出现这种差异的原因,动物种属差异可能会导致药物代谢过程在大鼠和人身上出现不同[12, 13]。动物实验研究结果外推至人时,应充分考虑CYP450酶种属差异所致的抑制活性和机制的差异。
复方实验的结果显示:阿魏酸、川芎嗪和延胡索乙素3种药物的复方加味佛手散胶囊对CYP2E1酶活性有体外抑制作用,与单药实验结果不同。这一现象与有关研究所报道的“中药复方配伍后给药与原料药单独给药相比,其药代动力学过程会发生变化”[14, 15, 16, 17]的结果相符。并且提示,依靠单体成分对酶活性的影响来评价复方药物的酶代谢效果可能会有误差。延胡索乙素和复方加味佛手散胶囊对大鼠肝CYP3A1/2和人肝CYP2D6的酶活性均有体外抑制作用,推测延胡索乙素是加味佛手散胶囊对大鼠肝CYP3A1/2和人肝CYP2D6产生抑制作用的效应物质。另外,加味佛手散胶囊对大鼠和人肝CYP2D、CYP2E1、CYP3A酶活性均可能有抑制作用,发现大鼠CYP2D2、CYP2E1、CYP3A1/2和人CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4有很好的相关性,此结果可为经CYP2D、CYP2E1、CYP3A代谢的药物与加味佛手散胶囊联合用药提供参考。
[1] | Wang XC, Yang Y, Chen G, et al. Inhibitory effects of Jiawei Foshousan on angiogenesis of endometriosis in rats model and its mechanism[J]. Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报), 2011, 27:350-354. |
[2] | Yang Y, Wang XC, Chen G, et al. Research of therapeutical effect and immunologic mechanism of Jiawei Foshou San on model rats of endometriosis[J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2011, 36:3001-3006. |
[3] | Tang Q, Shang FH, Wang XC, et al. Combination use of ferulic acid, ligustrazine and tetrahydropalmatine inhibits the growth of ectopic endometrial tissue:a multi-target therapy for endometriosis rats[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 151:1218-1225. |
[4] | Cao Y, Zhong YH, Yuan M, et al. Inhibitory effect of imperatorin and isoimperatorin on activity of cytochrome P450 enzyme in human and rat liver microsomes[J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2013, 38:1237-1241. |
[5] | He F, Bi HC, Xie ZY, et al. Rapid determination of six metabolites from multiple cytochrome P450 probe substrates in human liver microsome by liquid chromatography/mass spectrometry:application to high-throughput inhibition screening of terpenoids[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2007, 21:635-643. |
[6] | Yan JJ, He X, Feng S, et al. Up-regulation on cytochromes P450 in rat mediated by total alkaloid extract from Corydalis yanhusuo[J]. BMC Complement Altern Med, 2014, 14:306-314. |
[7] | Deng J, Shao J, Markowitz JS, et al. ABC transporters in multi-drug resistance and ADME-Tox of small molecule tyrosine kinase inhibitors[J]. Pharm Res, 2014, 31:2237-2255. |
[8] | Zhao DM, Li Y, Lu YH. The role of drug metabolism in new drug development[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2000, 35:156-160. |
[9] | Ai CH, Sun HX, Li H, et al. In vitro inhibition of cytochrome P450 activities by active constituents of Chinese herbal drugs[J]. Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报), 2011, 27:519-523. |
[10] | Tan Y, Zhuang XM, Shen GL, et al. Investigation of metabolic kinetics and reaction phenotyping of ligustrazin by using liver microsomes and recombinant human enzymes[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2014, 49:374-379. |
[11] | Sun SY, Wang YQ, Li LP, et al. Stereoselective interaction between tetrahydropalmatine enantiomers and CYP enzymes in human liver microsomes[J]. Chirality, 2013, 25:43-47. |
[12] | Martignoni M, Groothuis GM, de Kanter R. Species different between mouse, rat, dog, monkey and human CYP-mediated drug metabolism, inhibition and induction[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2006, 2:875-894. |
[13] | Zhong YH, Shen GL, Yuan M, et al. Evaluation of cytochrome P450 inhibition and induction by psoralen and isopsoralen in vitro[J]. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学与毒理学杂志), 2012, 26:522-528. |
[14] | Zhang AH, Sun H, Yuan Y, et al. An in vivo analysis of the therapeutic and synergistic properties of Chinese medicinal formula Yin-Chen-Hao-Tang based on its active constituents[J]. Fitoterapia, 2011, 82:1160-1168. |
[15] | Yan R, Wang Y, Shen WJ, et al. Comparative pharmacokinetics of dehydroevodiamine and coptisine in rat plasma after oral administration of single herbs and Zuojinwan prescription[J]. Fitoterapia, 2011, 82:1152-1159. |
[16] | Jiang B, Cai F, Gao SH, et al. Induction of cytochrome P4503A by Shexiang Baoxin pill and its main components[J]. Chem Biol Interact, 2012, 195:105-113. |
[17] | Liu X, Li H, Wu L, et al. Simultaneous quantification of chrysophanol and physcion in rat plasma by ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry and application of the technique to comparative pharmacokinetic studies of Radix et Rhei Rhizoma extract alone and Dahuang Fuzi decoction[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2015, 980:88-93. |