药学学报  2016, Vol. 51 Issue (6): 913-918   PDF    
细胞角蛋白8对丙型肝炎病毒复制的影响
李文静, 李健蕊, 黄梦昊, 吴舟一, 陈金花, 李虎, 吕晓芹, 程军军, 彭宗根     
中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050
摘要: 细胞角蛋白8(KRT-8)水平在丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝癌患者体内及在HCV感染细胞培养中均明显上升,与肝病进展密切相关,但KRT-8是否对HCV复制产生影响并不清楚。本文利用KRT-8高表达质粒和特异性shRNA分析其在细胞培养中对HCV复制的影响,并分析低沉默KRT-8后与已知抗HCV药物联合抑制HCV的作用及其对常见HCV耐药突变株的影响。结果显示,胞内KRT-8水平随HCV复制的增加而增加,其高表达能促进HCV的复制,而特异性干扰KRT-8基因表达后, HCV的复制受到抑制。低沉默KRT-8可以增强已知抗HCV药物特拉匹韦抑制HCV复制的作用,且对蛋白酶抑制剂常见耐药突变(A156T和D168V) HCV也具有抑制作用。这提示KRT-8可能是HCV复制的辅助因子,下调KRT-8具有抗HCV的作用及优势。因此, KRT-8有望成为抗HCV药物研发的一个新的宿主靶点。
关键词: 细胞角蛋白8     丙型肝炎病毒     辅助因子     抗病毒靶点     宿主成分    
The influence of intracellular keratin 8 on hepatitis C virus replication
LI Wen-jing, LI Jian-rui, HUANG Meng-hao, WU Zhou-yi, CHEN Jin-hua, LI Hu, Lü Xiao-qin, CHENG Jun-jun, PENG Zong-gen     
Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: The level of intracellular keratin 8(KRT-8) is associated with liver diseases, whose expression is increased in hepatitis C virus (HCV)-infected patients with hepatocarcinoma and in cultural cells infected with HCV. However, it is not clear whether KRT-8 will impact HCV replication. In this paper, the HCV replication was analyzed in response to high expression and silence of KRT-8. The inhibitory activities against wild-type and mutant HCV were also analyzed by silence of KRT-8 or combined with known anti-HCV drug telaprevir. Results showed that the protein level of KRT-8 was increased in proportion with the HCV replication. The high expression was found to facilitate HCV replication, while the silence of KRT-8 was able to inhibit HCV replication and enhanced the anti-HCV activity of telaprevir. It also inhibited A156T and D168V mutant HCV, which are resistant to protease inhibitors. These results suggest that KRT-8 is a co-factor for HCV replication. Down-regulation of KRT-8 can inhibit wild type and mutant HCV replication to enhance the anti-HCV activity of known anti-HCV drugs. Therefore, KRT-8 may be a new target in the development of anti-HCV agents.
Key words: keratin 8     hepatitis C virus     co-factor     antiviral target     host factor    

丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus,HCV) 感染引起的慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、甚至肝细胞癌是严重威胁人类健康的全球性难题之一[1]。目前,临床上常用聚乙二醇干扰素和利巴韦林联用的标准疗法治疗HCV患者,但总体治疗效果并不理想,且存在较大不良反应[2,3]。近年来,国外多个靶向HCV复制酶的抗HCV药物已经相继进入临床试验或上市,其能有效降低患者体内的HCV病毒载量,并呈现良好的应用前景[4,5]。但是,这些抑制剂单独用于抗HCV治疗,往往易产生病毒耐药,从而导致治疗无效或反弹[6,7]。为解决这一问题,直接抗病毒药物的联合应用及开发针对宿主靶点的抗HCV药物[8,9]成为重要研究策略。病毒与宿主间错综复杂的相互作用,使得宿主成分在HCV复制过程中扮演着重要的角色[10]

细胞角蛋白 (keratin,KRT) 是细胞骨架的构成成分,为细胞质内中间丝蛋白最大的亚家族,主要分布于表皮细胞和上皮细胞的整个细胞质,成人肝细胞只表达角蛋白8 (KRT-8) 和角蛋白18 (KRT-18)[11, 12]。已有研究报道KRT-8与肝病进展密切相关[13],它可与HCV核心 (core) 蛋白结合[14],HCV感染可上调KRT-8表达[15],但KRT-8是否影响HCV的复制尚不清楚。本研究利用高表达和低沉默KRT-8或与临床药物联合用药等实验分析其对HCV复制的影响。

材料与方法 细胞系和病毒

人肝细胞系Huh7.5细胞 (美国Vertex Pharmaceuticals Inc.惠赠) 在含10% 胎牛血清和1% 双抗的DMEM培养基 (Invitrogen公司) 中培养,并置于含5% CO2及饱和湿度的37 ℃细胞培养箱中。感染性HCV病毒株J6/JFH-1/JC是由重组的全长HCV cDNA的pFL-J6/JFH/JC1质粒(美国Vertex Pharmaceuticals Inc.惠赠) 酶切纯化并通过体外转录得到HCV RNA,然后转染正常Huh7.5细胞后收集细胞上清,制备得到的具有感染性的HCV病毒[16]

药物及抗体

特拉匹韦 (telaprevir,VX-950) 和西米匹韦 (simeprevir) 两种HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂[17, 18]购自MedChemExpress公司。抗HCV 核心蛋白 (ab13830) 和抗HCV NS3蛋白 (ab2740) 的单克隆抗体购于Abcam公司。抗KRT-8 (E-12) 抗体(sc-374274) 购自Santa Cruz Biotech公司。

质粒和感受态

真核表达载体pcDNA3.1+购自美国Invitrogen公司。 KRT-8 shRNA (sc-35156-SH) 和阴性对照control shRNA (sc-108060) 购自Santa Cruz Biotech公司。感受态细胞Trans 5α购自北京全式金生物技术有限公司。

分子生物学试剂盒

RNA提取试剂盒QIAamp RNA Mini Kit和质粒小提试剂盒购自美国Qiagen公司。常规PCR反应试剂盒SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq 购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒GoScript Reverse Transcription System、DNA片段回收和纯化试剂盒Wizard SV Gel Purification system购自美国Promega公司。

细胞培养及HCV的体外感染

Huh7.5细胞以 每平方厘米3.0×104个的密度接种于25 cm2培养瓶,培养24 h后感染HCV,感染量为每个细胞45 U。于感染后第0、3、6和9天分别提取细胞内总蛋白,用Western bolt法检测胞内蛋白水平。

KRT-8高表达质粒的构建

本实验以pcDNA3.1+为载体,根据已知KRT-8基因序列设计引物并引入EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切位点 (上游引物: CGGAATT CATGCATCATCACCATCACCATTCCATCAGGGTG ACCCAGAAGTC; 下游引物: GCTCTAGATCAATG GTGATGGTGATGATGCTTGGGCAGGACGTCAGA GGACTC,由上海英潍捷基合成),以从Huh7.5细胞

内总RNA反转录合成的cDNA为模板,使用基因扩增聚合酶PfuUltra ⅡFusion HS DNA Polymerase扩增目的基因,所得PCR产物进行纯化。PCR循环参数设置如下: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,进行40次循环; 最后 72 ℃延伸10 min。10 g∙L−1琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。将纯化后的KRT-8片段和pcDNA3.1+质粒进行双酶切,纯化后进行连接反应,将连接产物转化进大肠杆菌感受态 (Trans 5α),用含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜,提取质粒,进行PCR酶切鉴定和测序验证。

质粒转染及蛋白提取

Huh7.5细胞以每平方厘米4.0×104个的密度接种于6孔板中,培养24 h后用FuGENE HD转染试剂转染质粒。设置0.5 μg高表 达质粒组和空载体对照组,或0.5 μg KRT-8特异性shRNA组和阴性对照组。转染6 h后感染野生型或A156T和D168V耐药突变HCV,72 h后提取胞内蛋白,用Western blot法检测蛋白水平。

药物处理

Huh7.5细胞以每平方厘米4.0×104个的密度接种于6孔板中,培养24 h后用FuGENE HD转染试剂转染0.2 μg质粒,分组为阴性对照组、KRT-8 shRNA低沉默组、VX-950单加药组及KRT-8 shRNA低沉默联合VX-950加药组。转染6 h后感染HCV,VX-950单加药组及KRT-8 shRNA低沉默联合VX-950加药组同时给药处理,72 h后收集细胞蛋白,用Western blot法检测蛋白水平。

Western blot

利用SDS-PAGE凝胶分离提取的细胞内总蛋白样品,湿法转移至PVDF膜后用5% 脱脂牛奶室温摇床封闭1 h。然后,在3% 脱脂牛奶配制的相应抗体中室温摇床孵育4 h。洗膜后在TBST缓冲液配制的相应二抗中孵育1 h,TBST缓冲液洗膜,用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore公司) 显色,在ChemiDo XRS gel imager system (Bio-Rad公司) 进行凝胶成像。

数据处理及分析

蛋白免疫印迹结果中蛋白条带信号密度值用Gelpro 32软件扫描分析,并以对照组中目的蛋白/内参蛋白的比值为1.00作标准化处理。柱状图中的数据是3次的独立实验结果以x± s表示。所有数据均采用ANOVA分析和t检验,P < 0.05即认为有统计学差异。

结果 1 HCV感染上调宿主细胞内KRT-8蛋白的表达

Huh7.5细胞感染HCV后,提取感染第0、3、6和9天的细胞内总蛋白,通过Western blot法检测胞内KRT-8、HCV核心蛋白和NS3蛋白水平。结果显示,Huh7.5细胞感染HCV后,随着培养时间的延长,HCV病毒量不断升高,KRT-8蛋白水平也相应地升高 (图 1)。此结果与Sun等[15]报道KRT-8蛋白在HCV感染阳性的Huh7.5细胞内高表达的结果一致。

Figure 1 HCV infection increased the expression of keratin-8 (KRT-8) in Huh7.5 cells. Huh7.5 cells were infected with HCV (45 U/cell),intracellular proteins were extracted and detected with Western blot at indicated days post infection. n = 3,x± s. **P < 0.01 vs Day 9. The protein bands presented in the figure showed the results of a representative experiment
2 高表达质粒pKRT-8的构建

从Huh7.5细胞内提取的总RNA经逆转录获得cDNA,并以此为模板进行PCR,凝胶电泳显示,PCR产物条带位置接近1 500 bp (图 2A),与目的片段位置一致。PCR产物经双酶切连接到pcDNA3.1+载体中并进行克隆筛选,获得高表达KRT-8的单克隆载体。经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切得到两条带,大小与KRT-8基因和pcDNA3.1+质粒大小相符 (图 2B)。经基因测序后比较分析,所获得的KRT-8基因DNA序列与GenBank中的序列一致,说明KRT-8表达质粒构建成功。

Figure 2 PCR products of KRT-8 (A) and fragments of pKRT-8 plasmid digested with EcoRⅠ and XbaⅠ (B). M: DNA molecular weight markers; 1: PCR products of KRT-8; 2: Fragments of pKRT-8 plasmid digested with EcoRⅠ and Xba
3 上调KRT-8蛋白促进HCV的复制

HCV感染转染高表达质粒pKRT-8的Huh7.5细胞,72 h后用Western blot法测定胞内蛋白水平。结果显示,转染高表达质粒组与对照组相比,KRT-8蛋白水平明显上升,是对照组的2.01倍 (P< 0.01) (图 3A),HCV核心蛋白和NS3蛋白水平也明显升高,分别是对照组的2.17和2.20倍 (P < 0.01) (图 3A)。

Figure 3 HCV replication was increased by high expression of KRT-8 and decreased by silence of KRT-8. Huh7.5 cells were transfected with 0.5 μg of KRT-8 plasmid (A) or with 0.5 μg of KRT-8 shRNA (B) for 6 h. The cells were washed and infected with HCV (45 U/cell). Intracellular proteins were extracted and detected with Western blot in 72 h. n = 3,x± s. **P < 0.01 vs control. The protein bands presented in the figure showed the results of a representative experiment
4 下调KRT-8蛋白抑制HCV的复制

HCV感染已转染特异性干扰KRT-8基因表达的shRNA质粒的Huh7.5细胞,72 h后用Western blot法测定胞内蛋白水平。结果显示,KRT-8 shRNA组与对照组相比,KRT-8蛋白水平下降了68% (P < 0.01) (图 3B),HCV核心蛋白和NS3蛋白水平与对照组相比则分别下降了78% 和73% (P < 0.01) (图 3B)。

5 低沉默KRT-8增强VX-950抑制HCV的复制

HCV感染已转染特异性干扰KRT-8基因表达的shRNA质粒的Huh7.5细胞,或联合药物VX-950处理,72 h后用Western blot法测定胞内蛋白水平。结果显示,KRT-8 shRNA组与对照组相比,KRT-8蛋白水平下降了23% (P < 0.01),HCV核心蛋白和NS3蛋白水平分别下降了18% 和23% (P < 0.01)。VX-950药物组与对照组相比,KRT-8蛋白水平下降了48% (P < 0.01),HCV核心蛋白和NS3蛋白水平分别下降了31% 和36% (P < 0.01)。KRT-8 shRNA联合VX-950组与KRT-8 shRNA组相比,KRT-8蛋白水平下降59% (P < 0.01),HCV核心蛋白和NS3蛋白水平分别下降 了50% 和59% (P < 0.01); 而与VX-950药物组相比,KRT-8蛋白水平下降38% (P < 0.05),HCV核心蛋白 和NS3蛋白水平分别下降了41% 和51% (P < 0.01) (图 4)。

Figure 4 Silence of KRT-8 enhanced the anti-HCV activity of VX-950. Huh7.5 cells were transfected with 0.2 μg of KRT-8 shRNA. After 6 h,the cells were washed and infected with HCV (45 U/cell) and simultaneously treated with 0.02 μmol·L−1 of VX-950. Intracellular protein was extracted and detected with Western blot in 72 h. n = 3,x± s. **P < 0.01 vs shRNA control; ##P < 0.01 vs KRT-8 shRNA group; &P < 0.05,&&P < 0.01 vs VX-950 group. The bands presented in the figure were from a representative experiment
6 低沉默KRT-8 抑制A156TD168V耐药突变HCV的复制

A156T和D168V是HCV常见的耐药突变位点并导致NS3蛋白酶抑制剂治疗无效。本文分析了低沉默KRT-8对耐药HCV复制的影响。首先分析了蛋白酶抑制剂VX-950和simeprevir对野生型 (WT) 和A156T或D168V耐药HCV的抑制作用。结果发现,药物作用后感染A156T (图 5A) 和D168V (图 5B) 耐药突变HCV的细胞内HCV RNA水平与感染野生型的相比显著降低,Western blot结果进一步确证 (图 5C和5D),说明A156T和D168V突变耐药模型构建成功。

Figure 5 The inhibitory activities of antiviral agents against HCV. Naïve Huh7.5 cells were infected with wide type (WT) or mutant (A156T and D168V) HCV and simultaneously treated with VX-950 (A,C) and simeprevir (SIM) (B,D) after 72 h. Intracellular HCV RNA (A,B) and proteins (C,D) were extracted and detected with qRT-PCR and Western blot,respectively. n = 3,x± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs control. The bands presented in the figure were from a representative experiment

随后分析了低沉默KRT-8对耐药HCV复制的影响。用特异性干扰KRT-8基因表达的shRNA质粒转染Huh7.5细胞后,再感染A156T或D168V耐药突变HCV,72 h后提取细胞内总蛋白并用Western blot法测定胞内蛋白水平。结果发现KRT-8 shRNA降低胞内KRT-8水平的同时,对A156T突变耐药HCV (图 6A) 或D168V突变耐药HCV (图 6B) 仍有一定的抑制作用。

Figure 6 The inhibitory activities of silence of KRT-8 with KRT-8 shRNA against A156T (A) and D168V (B) mutant HCV. Huh7.5 cells were transfected with 0.5 μg of KRT-8 shRNA. After 6 h,the cells were washed and infected with mutant HCV (45 U/cell). Intracellular protein was extracted and detected in 72 h. n = 3,x± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs shRNA control. The bands presented in the figure were from a representative experiment
讨论

细胞角蛋白包括I型角蛋白 (K9~K20) 和Ⅱ型角蛋白 (K1~K8),具有多种生理功能,主要维持细胞的形状、完成细胞运动和抵抗外界机械应力,还可直接或间接地调节线粒体的结构和功能[19,20]。研究认为KRT-8突变与多种肝脏疾病相关,角蛋白的突变对线粒体的影响使得肝细胞易发生凋亡和氧化损伤,KRT-8蛋白的G61C突变与隐源性肝病相关[21],而R340H突变与终末期肝病显著相关[22]。另外,角蛋白高度磷酸化与多种肝脏损伤和肝脏疾病相关,在酒精性肝炎患者和动物模型中均发现大量KRT-8/KRT-18不成比例的高度磷酸化而错误折叠形成的集聚体[23]

Lee等[24]利用基因芯片技术研究HCV相关肝癌基因表达差异时发现KRT-8基因在HCV相关性肝癌组织中表达增加,Sun等[15]对感染HCV的人肝癌细胞系Huh7和Huh7.5细胞培养中的蛋白质表达谱变化分析发现,HCV感染后KRT-8蛋白水平明显上升,本文研究显示,随着HCV感染时间的延长,即病毒量的增加,胞内KRT-8含量也相应地随之上升 (图 1),但这种上升是否影响HCV的复制尚不清楚。本研究结果显示,转染特异性干扰KRT-8基因表达的shRNA能够抑制HCV的复制 (图 3),而转染高表达KRT-8的质粒则促进HCV的复制 (图 3),提示KRT-8可能是HCV复制的辅助因子。因此,HCV感染导致的KRT-8上调反过来有利于HCV自身的复制,这可能是HCV利用宿主因子的机制之一。

已有研究表明,KRT-8可能通过以下机制促进HCV复制: ① KRT-8表达增加可能通过激活某种激酶促进HCV复制。HCV复制过程中激酶或磷酸酶对核心蛋白磷酸化和去磷酸化的动态修饰是RNA病毒生命周期必不可少的过程,但HCV病毒基因不编码任何激酶蛋白,其激酶来源于宿主细胞,而有研究证明KRT-8可激活非典型磷酸激酶C (PKC),同时其与热休克70蛋白 (Hsc70) 相互协同作用影响PKC[25]; ② KRT-8与HCV核心蛋白相互作用,可能有利于HCV的复制[14]; ③ KRT-8表达增加可能为感染HCV的肝细胞提供一个有利的病毒复制微环境,从而间接地促进病毒复制,因KRT-8也是抗凋亡的蛋白之一[26],其能阻止病毒感染的肝细胞进入凋亡程序,以利于病毒感染后释放有感染性的病毒颗粒[27]

由于KRT-8蛋白与其他已知的抗HCV药物靶点不同,针对该靶点的药物与其他抗HCV药物就可能有联合抗HCV的作用。本研究应用特异性KRT-8的shRNA转染后与蛋白酶抑制剂联合给药的结果也证实了下调KRT-8可协同或增加其他药物的抗HCV作用 (图 4)。这为以后多靶点联合给药提供了新的研究线索。另外,直接抗病毒药物的长期使用易产生病毒耐药,而宿主靶向药物可弥补这个缺陷,并具有泛基因型抗病毒的优势[9,28]。在本研究中也证明了特异性抑制KRT-8表达可以抑制A156T和D168V HCV耐药突变株的复制 (图 6)。

综上所述,KRT-8可能是HCV复制的辅助因子,HCV感染导致其表达上调,从而反过来促进HCV自身的复制,这可能是HCV利用宿主因子的机制之一。

下调KRT-8具有抗HCV作用,并能增强其他已知抗HCV药物的抗病毒作用,且对耐药病毒也有效。因此,KRT-8有可能成为抗HCV药物的一个新靶点,其抗病毒机制的阐明将有助于发展新的抗病毒策略。

参考文献
[1] Mohd Hanafiah K, Groeger J, Flaxman AD, et al. Global epidemiology of hepatitis C virus infection:new estimates of age-specific antibody to HCV seroprevalence[J]. Hepatology, 2013, 57:1333-1342.
[2] Poordad F, McCone J Jr, Bacon BR, et al. Boceprevir for untreated chronic HCV genotype 1 infection[J]. N Engl J Med, 2011, 364:1195-1206.
[3] Sherman KE, Flamm SL, Afdhal NH, et al. Response-guided telaprevir combination treatment for hepatitis C virus infection[J]. N Engl J Med, 2011, 365:1014-1024.
[4] Feeney ER, Chung RT. Antiviral treatment of hepatitis C[J]. BMJ, 2014, 348:g3308.
[5] Dore GJ, Matthews GV, Rockstroh J. Future of hepatitis C therapy:development of direct-acting antivirals[J]. Curr Opin HIV AIDS, 2011, 6:508-513.
[6] Sarrazin C, Zeuzem S. Resistance to direct antiviral agents in patients with hepatitis C virus infection[J]. Gastroenterology, 2010, 138:447-462.
[7] Costantino A, Spada E, Equestre M, et al. Naturally occurring mutations associated with resistance to HCV NS5B polymerase and NS3 protease inhibitors in treatment-na ïve patients with chronic hepatitis C[J]. Virol J, 2015, 12:186.
[8] Asselah T, Boyer N, Saadoun D, et al. Direct-acting antivirals for the treatment of hepatitis C virus infection:optimizing current IFN-free treatment and future perspectives[J]. Liver Int, 2016, 36 Suppl 1:47-57.
[9] Zhu YP, Peng ZG, Wu ZY, et al. Host APOBEC3G protein inhibits HCV replication through direct binding at NS3[J]. PLoS One, 2015, 10:e0121608.
[10] Zhou LY, Zhang LL. Host restriction factors for hepatitis C virus[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22:1477-1486.
[11] Magin TM, Vijayaraj P, Leube RE. Structural and regulatory functions of keratins[J]. Exp Cell Res, 2007, 313:2021-2032.
[12] Omary MB, Ku NO, Strnad P, et al. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease[J]. J Clin Invest, 2009, 119:1794-1805.
[13] Strnad P, Stumptner C, Zatloukal K, et al. Intermediate filament cytoskeleton of the liver in health and disease[J]. Histochem Cell Biol, 2008, 129:735-749.
[14] Fang C, Yi Z, Liu F, et al. Proteome analysis of human liver carcinoma Huh7 cells harboring hepatitis C virus subgenomic replicon[J]. Proteomics, 2006, 6:519-527.
[15] Sun MZ, Dang SS, Wang WJ, et al. Cytokeratin 8 is increased in hepatitis C virus cells and its ectopic expression induces apoptosis of SMMC7721 cells[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19:6178-6187.
[16] Cheng JJ, Li JR, Huang MH, et al. CD36 is a co-receptor for hepatitis C virus E1 protein attachment[J]. Sci Rep, 2016, 6:21808.
[17] Lin K, Perni RB, Kwong AD, et al. VX-950, a novel hepatitis C virus (HCV) NS3-4A protease inhibitor, exhibits potent antiviral activities in HCV replicon cells[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50:1813-1822.
[18] Zhang X. Direct anti-HCV agents[J]. Acta Pharm Sin B, 2016, 6:26-31.
[19] Schweizer J, Bowden PE, Coulombe PA, et al. New consensus nomenclature for mammalian keratins[J]. J Cell Biol, 2006, 174:169-174.
[20] Tao GZ, Looi KS, Toivola DM, et al. Keratins modulate the shape and function of hepatocyte mitochondria:a mechanism for protection from apoptosis[J]. J Cell Sci, 2009, 122:3851-3855.
[21] Schöniger-Hekele M, Petermann D, Müller C. Mutation of keratin 8 in patients with liver disease[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2006, 21:1466-1469.
[22] Ku NO, Lim JK, Krams SM, et al. Keratins as susceptibility genes for end-stage liver disease[J]. Gastroenterology, 2005, 129:885-893.
[23] Kakehashi A, Inoue M, Wei M, et al. Cytokeratin 8/18 overexpression and complex formation as an indicator of GST-P positive foci transformation into hepatocellular carcinomas[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2009, 238:71-79.
[24] Lee CF, Ling ZQ, Zhao T, et al. Distinct expression patterns in hepatitis B virus- and hepatitis C virus-infected hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14:6072-6077.
[25] Mashukova A, Oriolo AS, Wald FA, et al. Rescue of atypical protein kinase C in epithelia by the cytoskeleton and Hsp70 family chaperones[J]. J Cell Sci, 2009, 122:2491-2503.
[26] Marceau N, Schutte B, Gilbert S, et al. Dual roles of intermediate filaments in apoptosis[J]. Exp Cell Res, 2007, 313:2265-2281.
[27] Arzberger S, Hösel M, Protzer U. Apoptosis of hepatitis B virus-infected hepatocytes prevents release of infectious virus[J]. J Virol, 2010, 84:11994-12001.
[28] Zeisel MB, Crouchet E, Baumert TF, et al. Host-targeting agents to prevent and cure hepatitis C virus infection[J]. Viruses, 2015, 7:5659-5685.