药学学报  2016, Vol. 51 Issue (5): 839-842   PDF    
抑制HIV1病毒侵入的首创药物马拉维罗
郭宗儒    
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
1 干预HIV病毒进入宿主细胞的环节 1.1 HIV1进入宿主细胞的过程

HIV病毒感染宿主细胞是衣被与胞膜的融合过程,融合是分步进行的: ① 识别与结合CD4受体: 病毒颗粒的外膜糖蛋白gp120与跨膜糖蛋白gp41识别宿主细胞表面受体CD4,并与之结合附着在细胞膜上; ② 与CCR5受体结合: 结合于CD4的gp120构象发生变化,识别并结合于宿主细胞的辅受体趋化因子受体CCR5,遂之gp41与gp120分离; ③ 核酸进入: gp41的α螺旋变构,形成管束状构象,与膜蛋白融合,病毒的核酸穿越胞膜进入宿主细胞。研制抗HIV1药物可以在不同的环节干预病毒进入细胞,例如屏蔽和抑制CD4受体或者CCR5受体。

1.2 CCR5受体的特征与功能

CCR5是一种趋化因子受体,由352个氨基酸残基组成,为跨膜G蛋白偶联受体,7个跨膜α螺旋可分为胞外N-末端、3个胞外环套、3个胞内环套和C- 末端。激动CCR5受体的配体有巨噬细胞炎症蛋白1α (MIP1α)、1β (MIP1β) 和RANTES等趋化因子家族成员,功能是趋化细胞以定向运动调控淋巴细胞的迁移、增殖与免疫的功能。由于介导炎症反应和自身免疫性疾病的发生,因而CCR5是研发抗炎药物和免疫调节药物的重要靶标。另一方面,它又是HIV病毒侵入细胞的重要辅受体 (coreceptor),参与病毒蛋白与细胞膜的融合过程,所以CCR5又是抑制HIV1感染的重要靶标。图 1是CCR5与配体趋化因子的结合位点以及病毒颗粒与CD4结合的示意图。

图 1 巨噬细胞胞膜的CD4与CCR5受体同趋化因子 (MP1αβγ) 与HIV1结合的示意图
2 抑制剂的活性评价

用稳定表达CCR5的HEK-293细胞作为体外细胞模型评价化合物活性,将放射性标记的趋化因子MIP1β从与CCR5受体结合的复合物中置换出50%的化合物浓度 (MIP1β IC50) 作为受试化合物抑制活性的指标,在一定程度上该IC50代表了化合物阻断病毒融合和侵染宿主细胞的活性强度。然而这种用竞争抑制实验作为阻止病毒侵入的指标有一定的风险,因为化合物的MIP1β IC50值有时与抑制病毒侵入的活性不相关联 (在研发马拉韦罗和其他CCR5抑制剂中已显示出来,见后)。但作为初筛,仍是有价值的。另一种模型是抑制50% HIVBAL病毒复制所需的化合物浓度AV IC50,用以表征化合物的抗病毒功能。

3 苗头化合物和向先导物的过渡 3.1 随机筛选获得苗头化合物

研发CCR5受体拮抗剂以抑制HIV1对宿主细胞膜的融合与侵入,本质上是干预gp120与CCR5之间的蛋白-蛋白相互作用。由于缺乏结构生物学信息,发现阻断蛋白-蛋白相互作用的有机小分子所常用的方法是随机筛选获得苗头化合物。辉瑞公司设定了遴选苗头化合物的标准: MIP1β IC50 < 2.5 μmol·L-1、配体效率LE > 0.2 (LE = 配体-受体结合自由能ΔG / 配 体分子的非氢原子数,ΔG可由Ki计算得到,LE是同时表征化合物活性和分子大小的量度) 以及clogP < 5 (clogP为化合物疏水性或亲脂性的量度)。这3个指标用以控制和确保苗头化合物处于成药性的化学空间。

经随机筛选发现了化合物1和2达到了上述标准,IC50分别为0.40和1.1 μmol·L-1

3.2 消除抑制CYP的作用

化合物1结构中含有咪唑并吡啶片段,基于已 有的经验,该片段具有抑制CYP2D6的作用,测试 结果表明1对CYP2D6有显著抑制作用,IC50 = 0.04 μmol·L-1,分子模拟研究表明吡啶N原子与卟啉环上的Fe形成配位键,如图 2所示。由于1占据了CYP2D6与底物结合的空间,降低了酶的代谢转化能力,因而呈现抑制作用。推论将1的吡啶环换成苯环会消除抑制CYP2D6的作用,化合物3对MIP1β有很强的抑制活性,IC50 = 4 nmol·L-1,并消除了抑制CYP作用。然而3未显示抑制病毒的功能。

图 2 分子模拟化合物1与CYP2D6结合示意图
3.3 引入酰胺基团以降低脂溶性

化合物3有较高的亲脂性,而且邻近的两个苯环可发生疏水折拢作用 (hydrophobic collapse) 导致构象变化。将化合物3中的苯环用苯甲酰胺片段取代得到脂溶性降低的化合物4,虽然抑制CCR5的作用略弱 (MIP1β IC50 = 0.045 μmol·L-1),但呈现出抑制病毒复制的活性 (AV IC50 = 0.21 μmol·L-1)。因而以4为模板,用通式5考察不同酰基对活性的影响。

3.4 不同酰胺取代的构效关系

不同的酰基替换苯甲酰基,测定化合物抑制CCR5和病毒复制的活性表明,苄基的活性低于苯 基,异丙基和环丁基活性强于4,尤其是环丁基活性很高 (MIP1β IC50 = 0.040 μmol·L-1,AV IC50 = 0.050 μmol·L-1); 极性更强的如二甲胺基甲酰基和烯丙酰基化合物活性降低,体积小的乙酰基活性更弱。提示基团过大或过小或增加极性都不利于活性的提升。

3.5 手性对活性的影响—先导化合物的确定

化合物4是光活性分子,含有一个手性碳原子,测定了两个光学异构体的活性,表明S异构体为优 映体,MIP1β IC50 = 0.013 μmol·L-1,R构型MIP1β IC50 = 0.58 μmol·L-1,相差44倍。同样制备了环丁基取代的光学活性化合物,也表明S构型的化合物 (6) 有良好的活性,MIP1β IC50 = 0.020 μmol·L-1,AV IC90 = 0.073 μmol·L-1。6也降低了对CYP2D6的抑制作用,IC50 = 5 μmol·L-1。(Armour D,de Groot MJ,Edwards M,et al. The discovery of CCR5 receptor antagonists for the treatment of HIV infection: hit-to-lead studies [J]. ChemMedChem,2006,1: 706-709)。

4 先导物的优化 4.1 降低对CYP的抑制作用

以化合物6为先导化合物,采用了分子模拟的理性设计策略优化结构以进一步降低对CYP2D6的抑制作用。文献报道CYP2D6的抑制剂和底物的药效团 具有共同的特征,即在距离苯环的5~7Å处有碱性氮原子的存在 (de Groot MJ,Ackland MJ,Home VA,et al. Novel approach to predicting P450-mediating drug metabolism: development of a combined protein and pharmacophore model to CYP2D6 [J]. J Med Chem,1999,45: 1515-1524)。化合物6也是这样,分子对接显示,6的哌啶N原子与CYP的Asp301发生相互作用。为了消除这种作用,设计具有位阻的哌啶环或降低N原子的碱性,以阻止N原子与Asp301的结合。在报道的化合物7~15中,7 (exo-异构体) 和8 (endo-异构体) 不仅对CCR5具有高抑制活性 (MIP1β IC50分别为2和6 nmol·L-1),而且抑制病毒复制的活性也很高 (AV IC90分别为13和3 nmol·L-1),而其他化合物 (9无活性除外) 虽也有强效的抑制CCR5作用,但没有或只有很弱的抑制病毒活性 (再次证明受体与细胞活性的不平行性)。endo-化合物8由于苯并咪唑环的存在,迫使桥连的哌啶环采取假船式结构。

此外7和8都消除了抑制CYP2D6的作用,说明增加位阻效应阻止了氮原子与Asp 301的结合。因而以7和8为新的起点作进一步研究。(Armour DR,de Groot MJ,Price DA,et al. The discovery of tropane- derived CCR5 receptor antagonists [J]. Chem Biol Drug Design,2006,67: 305-308)。

化合物7和8的安全性试验表明有抑制hERG钾通道的作用,例如7在0.3 μmol·L-1浓度下抑制率达80%,这种潜在的心脏毒性,需进一步优化结构加以消除。

4.2 消除抑制hERG钾通道作用—马拉韦罗的设计 4.2.1 变换环丁甲酰胺基片段,

降低疏水性 化合物7和8对心脏的潜在毒性需要去除。以化合物8 为起始物,变换环丁甲酰胺基片段,提高分子的极性以抑制hERG通道的作用,合成了化合物16,保持了抗病毒活性,AV IC90 = 2 nmol·L-1,但16不能吸收。

化合物17 (UK-396794) 的AV IC90 = 0.6 nmol·L-1,未显示抑制hERG作用,可在动物体内吸收,但体内代谢快,不能作为候选化合物。

4.2.2 变换苯并咪唑以降低疏水性结合

再回到7和8先导物上。将化合物7与hERG作分子对接,显示苯并咪唑的苯环与通道蛋白的疏水区域高度重合,这或许是与hERG亲和力的结构因素,为此,可向苯并咪唑环上引入极性基团或去除苯环以降低疏水性。前者会增加分子量,并且合成难度加大,因而采用降低杂环疏水性策略。为了方便合成,考察苯并咪唑的影响用哌啶系列 (暂时不用托品系列) 作为模型化合物,报道了合成18~23等分子。

化合物18~20虽有活性但呈现较强抑制hERG的作用,可能是苄基与通道蛋白的疏水区域相结合的缘故。化合物21的苄基位置与18不同(互为区域异构体),对CCR5的抑制作用很弱。22和23对CCR5的MIP1β IC50分别为70和50 nmol·L-1,抑制hERG的作用很弱,表明去除苯基有可能在保持活性前提下去除抑制hERG通道作用。

遂将23的哌啶环换成托品环,保持了高抗HIV的增殖活性,基本消除了抑制hERG作用。例如化合物24的AV IC90 = 13 nmol·L-1,在浓度为100 nmol·L-1下抑制hERG仅10%。其中一个甲基换成异丙基时,得到的化合物25的抗HIV活性更强,AV IC90 = 8 nmol·L-1,而且浓度为300 nmol·L-1时对hERG的抑制率为30%。这样,化合物25确定为新的里程碑式化合物,再变换结构中的环丁酰基。

4.2.3 变换环丁酰胺片段,再降低分子的疏水性

研发至此,化合物25的抗HIV增殖活性、对CYP2D6和hERG的作用已经达到优化的目标,剩下的问题是降低整体分子的疏水性,以便提高体内的代谢稳定性,因为疏水性越强,药物代谢越复杂,而且降低疏水性还有利于生物药剂学性质。

分布系数logD是表征化合物的疏水性或亲脂性的参数,数值越大疏水性越强,容易产生复杂的代谢产物,也不利于剂型设计。该项目设定目标化合物的logD值在1.5~2.3,这是药代动力学和生物药剂学的适宜范围。表 1列出了有代表性化合物25~28,它们的logD都在2.3以内。用环戊基置换环丁基,化合物26提高了抗病毒活性,抑制hERG作用有所降低。R为三氟丙基的化合物27的活性略有减弱,但抑制hERG作用进一步下降。合并26和27的结构特征,设计合成了4,4-二氟环己基化合物28,不仅具有强效抑制病毒复制活性,甚至在1 μmol·L-1浓度下也未显示抑制hERG通道的作用,说明环己基的位阻和氟原子的极性阻止了与hERG的结合。(Price DA,Armour D,de Groot M,et al. Overcoming hERG affinity in the discovery of the CCR5 antagonist maraviroc [J]. Bioorg Med Chem Lett,2006,16: 4633-4637)。

表 1 有代表性的化合物25~28的结构、logD和生物学参数
5 候选物的确定和马拉维罗的上市

该项目从随机筛选出的苗头化合物 (hits),经 过结构变换过渡到先导物 (hit-to-lead),再经先导 物的优化 (optimization),最终确定了候选化合物 (candidate),共合成了上千个目标分子。其中化合物28具有良好的药代动力学性质,口服生物利用度F = 23%,血浆半衰期t1/2 = 16 h,被遴选为候选化合物,命名为马拉维罗 (maraviroc)。经Ⅲ期临床研究证明是治疗HIV1感染安全有效,成为抑制CCR5阻止病毒进入宿主细胞的首创性药物。