2. 西藏藏医学院, 西藏 拉萨 850000
2. Tibetan Traditional Medical College, Lhasa 850000, China
龙胆科龙胆属Gentiana秦艽组Sect. Cruciata植物多分布于我国青藏高原,物种及遗传背景丰富多样,具有重要的药用价值。作为我国秦艽组药用植物主产区之一的甘肃省,位于青藏高原与黄土高原交汇之处,地形狭长,东西向长达1 600多公里; 地质情况复杂,山地、高原、河谷、沙漠与戈壁交错分布,海拔高度变化剧烈,呈现出丰富的生物多样性。据文献记载及野外实地考察,该地区自然分布的秦艽组植物达6种之多,除了中国药典2015年版秦艽项下收载粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.、麻花秦艽G. straminea Maxim.、大叶秦艽G. macrophylla Pall.和小秦艽G. dahurica Fisch. 4种基原植物,尚有近缘种管花秦艽G. siphonanthaMaxim. ex Kusnez.及黄管秦艽G. officinalis H. Smith[1, 2]。
近年来,作者在甘肃等地野外考察中注意到,秦艽组植物种下变异幅度较大,一些居群个体显现种间过渡形态情况; 一些近缘种的鉴定较难把握,如粗茎秦艽与西藏秦艽Gentianatibetica King ex Hook. f.之间种的形态鉴定问题[3]; 同域分布的近缘种间存在自然杂交现象[4]; 加之前期的遗传背景初步分析显示,一些物种ITS区在基因组内存在明显多样性,协同进化 (concerted evolution) 不完全。
多年来,为梳理秦艽主流品种的形成过程,寻求高效、准确的中药秦艽类鉴定方法,中医药工作者开展了大量基础研究: 如上世纪60年代,Hsia等[5]在商品秦艽调查资料基础上,进行系统的本草学考证及植物分类学工作; 相关生药学鉴定方面亦有报道[6]; 环烯醚萜类是秦艽主要活性成分,Wu等[7]测定秦艽及其4个近缘物种中5种环烯醚萜含量,为多成分综合评价药材品质提供参考。但由于传统方法的局限性,当务之急是深入开展秦艽品种整理、遗传背景分析及构建DNA条形码工作,以进一步解决秦艽药材品种鉴定等问题。
目前,有关甘肃4种野生秦艽rDNA ITS区序列分析工作已有一定进展[8]; Luo等[9]直接以秦艽药材为研究对象,筛选其4种基原植物ITS 2条形码序列。本课题组在对秦艽组植物品种系统整理基础上[10],并参考国内外相关研究工作,扩大该地区秦艽组近缘物种采集数量,进一步开展了核基因组ITS区、叶绿体基因组matK、rbcL、rpoC1、trnL (UAA) intron、psbA-trnH、atpB-rbcL、trnS (GCU)-trnG (UCC)、rpl20- rps12、trnL (UAA)-trnF (GAA) 序列共10个片段的筛选,评价各片段的分子鉴定意义,寻找近缘物种间断的DNA分子证据,尝试协同进化不完全或自然杂交情况下的物种鉴定策略,以期为秦艽基原植物物种鉴定及遗传背景研究提供基础资料。
材料与方法 材料自采实验材料,取新鲜叶片经硅胶快速干燥,备用。同时采集龙胆科花锚属植物椭圆叶花锚Halenia elliptica D. Don作为外类群。凭证标本经赵志礼教授鉴定,存放于上海中医药大学中药学院药用植物标本室,见表 1。
取上述硅胶快速干燥的植物叶片,在液氮中研磨成粉末,采用改良的CTAB法[11]进行总DNA提取。
PCR扩增和测序对nrDNA ITS区及叶绿体matK、rbcL、rpoC1、trnL (UAA) intron、psbA-trnH、atpB-rbcL、trnS (GCU)-trnG (UCC)、rpl20-rps12、trnL (UAA)-trnF (GAA) 共10个片段进行扩增,引物及PCR反应条件参考相关文献[12]。扩增产物经电泳确认有清晰目的条带后送上海生工生物有限公司纯化并测序 (ABI 3730XL型测序仪)。双亲遗传的核基因组ITS区: 所有6个物种20个样品均采用TA克隆法测序,每个样品各选取10个阳性克隆。单亲遗传的叶绿体各片段及外类群均采用直接测序法。
序列数据分析各片段的起止范围参考GenBank中相关序列,所得序列输入计算机后,用MEGA 6.06软件进行分析。
结果 1 序列的获得共获得410条目的片段序列。包括200条ITS区克隆序列,其中粗茎秦艽、管花秦艽、黄管秦艽、大叶秦艽各30条,麻花秦艽、小秦艽各40条; 直接测序法获得其他210条序列。全部序列上传至GenBank,并获得对应的登录号 (表 2)。
基于叶绿体DNA序列比对,各物种的trnL (UAA) intron和rpoC1序列一致、无变异位点,而 其他7个片段均存在种间差异。同一物种内各样品 间除了大叶秦艽的4个多态性位点 (分别位于matK、rpl20-rps12和trnS-trnG) 及麻花秦艽1个多态性位点 (位于psbA-trnH) (表 3),其余种内各样品叶绿体DNA序列均保持一致。
以椭圆叶花锚为外类群,分别将各样品的9个 叶绿体DNA片段组合,构建NJ系统树 (Kimura 2- parameter模型,Bootstrap 1 000次重复)。结果显示,外类群首先单独区分开; 粗茎秦艽、麻花秦艽分别独立为一支; 管花秦艽为一小支,然后与小秦艽、黄管秦艽、大叶秦艽聚为一大支 (图 1)。
ITS区序列分析显示,6个物种的ITS区在各自基因组内存在多样性,序列中插入、缺失 (长度多态性) 及位点差异现象并存,基因型式样丰富; 但具体情况各不相同。
ITS区序列长度范围在621~628 bp之间,其中ITS1长度为226~233 bp,5.8S区均为164 bp,ITS2长度为229~231 bp。变异位点集中在ITS1区和ITS2区; 值得注意的是,作为编码区的5.8S较为保守,但在管花秦艽和小秦艽的236位分别具有1个G/A多态位点。
4 管花秦艽、麻花秦艽及粗茎秦艽的鉴定序列筛选结果显示,以下7个片段均存在种间差异。其中,管花秦艽、麻花秦艽及粗茎秦艽均具有特异的稳定鉴别位点 (种内一致,可与其他物种区分) (表 4)。基于atpB-rbcL片段可鉴别管花秦艽; atpB- rbcL、rpl20-rps12、trnS-trnG、psbA-trnH片段均可鉴别麻花秦艽; atpB-rbcL等7个片段均可鉴别粗茎秦艽。
大叶秦艽叶绿体DNA片段具有种内多态性位点,可分为两个基因型,比例为2∶1 (图 2)。其中基因I型序列与黄管秦艽、小秦艽均一致,Ⅱ型序列可作为大叶秦艽与这两个物种区分的鉴别序列。考虑到两者比例、实际鉴定的可操作性及具有的统计学意义等因素, 应用二项分布累计概率公式 (X≥1)[13]计算出实际获得Ⅱ型鉴定序列的概率大于90% 时的居群采样数为6; 即至少随机取6份样品,可有效鉴定大叶秦艽。
小秦艽与黄管秦艽遗传背景极为相近,两者的叶绿体片段和ITS区直接测序序列完全一致。鉴定策略: 通过ITS区克隆序列比较,选择5.8S区和ITS2区的多态性位点以区分两者。
小秦艽的ITS区克隆序列可分为4个基因型 (图 3),基因I型与Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型之和的比例为33∶7。基因I型序列的位点与黄管秦艽一致,Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型序列均有与黄管秦艽区分的鉴别位点 (Ⅳ型在保守的5.8S编码区尚具1变异位点)。同理,应用上述公式[13]计算出实际获得Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型鉴定序列的概率大于90% 时的克隆序列数为12; 即 1个样品至少随机取12个阳性克隆测序分析,可有效鉴定小秦艽与黄管秦艽。
综合以上分析,麻花秦艽、粗茎秦艽和管花秦艽均具有叶绿体DNA稳定鉴别位点,分别选取鉴别位点最为丰富的片段或片段组合,作为物种的鉴定序列; 大叶秦艽可通过叶绿体DNA多态性位点与小秦艽、黄管秦艽进行鉴别; 小秦艽可通过ITS区克隆序列的多态性位点与黄管秦艽进行鉴别。各物种DNA条形码序列及鉴定方法见表 5。
本文对甘肃产秦艽组6种植物进行多样本、多基因组、多片段遗传多样性分析,筛选出具有物种分辨率的叶绿体DNA7个片段,对富含杂合位点的ITS区克隆测序; 梳理相关物种的基因型式样,评价不同基因型的物种鉴定意义。在此基础上,尝试应用数理统计学原理,开展DNA条形码序列物种鉴定方法学研究,提出各物种间DNA条形码鉴定序列及方法学参数; 以期为协同进化不完全、遗传背景复杂多样的甘肃产秦艽基原植物提供一种具可操作性的分子鉴定方法 (图 4)。
被子植物叶绿体DNA为单亲遗传,不存在序列杂合的影响,近年来在植物系统学研究及中药基原植物鉴定中得到进一步的应用[14, 15]。本文对叶绿体DNA序列在秦艽组植物中的鉴定意义进行评价。结果显示: 叶绿体DNA matK、rbcL、psbA-trnH、atpB- rbcL、trnS (GCU)-trnG (UCC)、rpl20-rps12、trnL (UAA)-trnF (GAA) 7个片段在该组植物的物种鉴定中具重要意义。即基于叶绿体基因组atpB-rbcL等7个片段均可鉴别粗茎秦艽; atpB-rbcL片段可鉴别管花秦艽; atpB-rbcL、rpl20-rps12、trnS-trnG、psbA-trnH片段均可鉴别麻花秦艽。大叶秦艽叶绿体DNA片段分为两个基因型,其中基因Ⅱ型序列可作为大叶秦艽与黄管秦艽、小秦艽两个近缘物种区分的鉴别序列。鉴于此3种植物均具有基因I型序列,实际鉴定时至少应随机取6份样品,应用此片段鉴定大叶秦 艽具有统计学意义 (90% 以上)。同时,被子植物线粒体DNA与叶绿体DNA一样,多为母系遗传,近年来在中药鉴定中亦有应用,展示了广阔的研究与应用空间[16, 17]。
核基因组核糖体DNA ITS区因其具有多拷贝、易扩增、进化速率快及变异位点丰富等特点,常被用作构建条形码的候选序列[9]。但双亲遗传、存在杂 合现象等,使构建条形码、进行有效物种鉴定工作 更为复杂。Song等[18]应用焦磷酸测序技术 (pyrosequencing) 对178种维管植物ITS区基因组内多态性分析结果显示,基于复杂的物种进化史,可能存在的自然杂交及水平基因转移等因素,基因组内变异频繁,多样性丰富。对于生长环境严苛的高山植物而言,在环境胁迫下经历了不断发展进化的过程,具备了丰富多样的基因特征。如对青藏高原产大黄属Rheum唐古特大黄R. tanguticum居群内ITS区102条克隆 序列多态性分析表明,87个克隆与同属波叶大黄R. rhabarbarum有高度相似性; 另有5个克隆与荞麦属Fagopyrum荞麦F. esculentum相似[19]。本文中,秦 艽组6种植物亦显示了丰富的ITS区基因组内多样性。小秦艽的ITS区克隆序列可分为4个基因型; 基因I型序列的位点与黄管秦艽一致 (基因渗入),Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型具有鉴别意义。直接比较两者的ITS区,无法进行有效鉴定。对策: 1个样品至少随机取12个阳性克隆测序分析,鉴定两个近缘物种具有统计学意义 (获得相关基因型鉴定序列的概率大于90% 以上)。
物种形成机制及其遗传背景特性是构建DNA物种鉴定条形码的分子基础。在植物系统学研究或具体药用植物品种基原鉴定中,应深入开展此方面的基础研究工作。上述基于叶绿体DNA序列的NJ系统树中,大叶秦艽叶绿体DNA片段中的基因Ⅱ型显示了原始祖种的基因特性,其在该物种形成及进化过程中的意义如何,有无假基因存在,在现今仍然保留此基因型的动力等疑问有待进一步探究。同时,对协同进化不完全、近缘物种之间基因渗入明显等复杂研究对象,应优化居群采样策略 (扩大地理范围),加大样本量,扩大片段筛选范围,以获得更为客观、准确的DNA物种鉴定条形码。
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