药学学报  2016, Vol. 51 Issue (5): 756-761   PDF    
苦参酸类衍生物抗柯萨奇病毒B3的活性分子探针构建
唐胜1, 程新越1, 李玉环1, 宋丹青1, 李迎红1,2     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 抗感染药物研究北京市重点实验室, 北京 100050;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050
摘要: 12-N-苯磺酰基-11-苦参酸衍生物是一类全新结构骨架、对柯萨奇病毒B3(CVB3) 显示较好活性的化合物, 但其作用机制尚不清楚。本研究在前期构效关系基础上设计合成了两类分子探针: 一类是用于BIAcore 垂钓探寻靶蛋白的苦参胺类探针; 另一类是用于生物素亲和层析寻找靶蛋白的生物素酸苦参酯类探针。通过对其抗CVB3 活性评价, 发现生物素分子探针10a 具有较好抗CVB3 活性, IC50值为0.8 μmol·L-1, SI 值为58.3。此类活性分子探针的成功构建为此类化合物靶标蛋白寻找与探索提供了关键的化学工具。
关键词: 苦参酸衍生物     生物素     小分子探针     抗CVB3活性    
Construction of anti-CVB3 active molecule probe of matrinic derivatives
TANG Sheng1, CHENG Xin-yue1, LI Yu-huan1, SONG Dan-qing1, LI Ying-hong1,2     
1. Beijing Key Laboratory of Anti-infective Agents, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;
2. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: 12-N-Benzenesulfonyl-11-matrinic acid derivatives are a new class of anti-CVB3 compounds, but the mechanism of action is still unknown. Therein, two kinds of molecule probes were designed and constructed in this study, including matrinic amines that might be applied to the BIAcore fishing technique and biotin-tagged matrinic derivatives, which could be applied in the biotin affinity chromatography. Moreover, their anti-CVB3 activities were evaluated. Among them, 10a displayed a good activity with an IC50 value of 0.8 μmol·L-1. This active molecule probe provides a key chemical tool for exploration of the anti-CVB3 mechanism of this type of compounds.
Key words: matrinic derivative     biotin     molecule probe     anti-CVB3 activity    

流行病学调查显示,45%~60% 的病毒性心肌炎与柯萨奇病毒B3 (CVB3) 感染有关[1],CVB3感染所引起的病毒性心肌急性或慢性炎症,能进一步导致急性心功能衰竭、心律失常、慢性心肌病等,甚至造成猝死,成为心性猝死第三位,仅次于冠心病和高血压[2]。此外,CVB3感染还易引起脑炎、手足口病、疱疹性咽峡炎和肺炎等复杂多样的疾病[3]。然而,迄今为止,尚未有专门用于CVB3引起的病毒性心肌炎的治疗药物或疫苗批准上市。目前,临床治疗病毒性心肌炎的药物为广谱抗病毒药物利巴韦林 (RBV) 或干扰素,但此类药物特异性较差,毒副作用较大,主要表现为贫血和甲状腺疾病[4]。因此,寻找与研发病毒性心肌炎的治疗药物临床意义重大。

槐果碱 (1,图 1),一种天然生物碱,其注射液 (又称抗柯注射液) 作为我国院内制剂已用于CVB3引起的病毒性心肌炎的治疗,但其作用机制一直不清楚。本课题组前期以槐果碱为先导化合物,开展了结构修饰与优化,得到了一类活性强、成药性高的12-N-苯磺酰基-11-苦参酸衍生物 (图 1)。构效关系表明: ① 12-N-苯磺酰基上存在强吸电子基团有利于活性,如CF3、CN和NO2等; ② 11-侧链为可调节性基团,其长短及结构类型对活性影响不大,如11-丁/乙酸、酯、醇等取代类似物均显示较好的抗 CVB3活性[5, 6, 7, 8]。此构效关系结果提示,若在11-侧链末端引入不同的标签分子或基团,有可能保留活性而获得活性分子探针,进而为此类化合物靶标蛋白探寻以及作用机制研究提供关键的化学工具。

Fig. 1 Chemical structures of sophocarpine and SAR of this kind of compounds

目前,基于表面等离子共振原理的BIAcore垂钓技术成为药物靶标发现的热点方法之一[9]。BIAcore表面覆有葡聚糖层的CM5传感芯片,其羧基化的葡聚糖表面可与氨基、羟基、巯基及醛基等极性基团以共价键结合[10, 11]。其中,氨基与葡聚糖形成的酰胺键最为稳定,氨基活性探针可应用于BIAcore方法寻找靶蛋白。另外,生物素亲和标记分子探针 (biotin-tagged probe) 是基于生物素-链霉亲和素的特异性结合,其优势在于分子探针与靶蛋白的非共价键特异性结合即可实现靶蛋白的识别、富集和纯化,然后利 用亲和色谱方法分离靶蛋白[12, 13, 14, 15, 16]

基于此,本文拟分别构建上述两类苦参探针分子,为用BIAcore或生物素垂钓方法寻找此类化合物的直接作用靶点(或第一生物靶点) 提供重要的探针工具。因此,本研究在充分了解其构效关系的基础上,保留12位N-取代的活性基团,一方面,在11-丁基侧链末端引入氨基,设计合成苦参胺类探针化合物 (9a~9c); 另一方面,在11-丁/乙醇上用酯键连接生物素亲和标签,由此构建了生物素酸苦参酯类分子探针 (10a、10b、15)。

目标小分子探针的合成如合成路线1和2所示。以市售的苦参碱2为原料,经碱水解开环得中间体 3,将化合物3的羧基成酯,12位N-磺酰化制得中间体5a~5c。将化合物5a~5c的酯还原成醇得到关键中间体6a~6c; 将6a~6c经斯文氧化得苦参醛类化合物7a~7c; 经胺化还原、肼解即可制得11-末端连接氨基的目标小分子探针9a~9c。同时,将6a、6b与生物素相连制得含生物素的分子探针目标物10a、10b。另外,以槐果碱1为原料 (合成路线2),经酸 性KMnO4氧化双键断裂制得苦参乙酸11,再经羧 酸酯化、12位N-磺酰化、酯还原、与生物素缩合即可制得目标化合物15。所有目标化合物均未见文献报道,其结构均经1H NMR、13C NMR和HR-MS确 证。

结果与讨论

所设计合成的小分子探针结构及抗CVB3活性见表 1,理化参数及波谱数据见表 2。首先,在12位N-苯环上的不同位置 (邻、间、对) 保留活性基团CF3,在其11-位丁基末端引入氨基,由此构建了可用于BIAcore找靶的分子探针9a~9c,但3个苦参胺化合物的抗CVB3活性均消失。结果表明,在11-侧链引入含氮原子的极性基团不利于活性的提高,这一构效关系与前期结果吻合[6]。其次,将生物素分子通过酯键分别引入11-位丁羟基或乙羟基末端,由此获得生物素酸12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁酯 (10a)、生物素酸12-N-邻三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁酯 (10b) 以及生物素酸12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参乙酯 (15)。活性结果显示,3个探针分子均显示不同程度的抗CVB3活性,IC50介于0.8~9.14 μmol·L-1之间。尤其化合物10a显示较强的抗CVB3活性以及较宽的治疗窗口,其IC50值为0.8 μmol·L-1,SI值为58.3。结果显示,连接生物素化合物10a可以作为活性探针分子进一步寻找与探索抗CVB3作用的靶标蛋白。

本论文共设计合成了两类苦参衍生物小分子探针并评价了它们的抗CVB3活性。所获得的苦参胺 类化合物均没有显示出抗CVB3活性,而以酯键链接的生物素酸苦参丁/乙酯类化合物保留了良好的抗CVB3活性。其中,生物素探针分子10a抗CVB3的IC50值为0.8 μmol·L-1,SI值为58.3,成功构建了活性探针分子。为运用生物素亲和层析方法寻找此类 化合物抗CVB3的直接作用靶标蛋白提供了关键的化学工具,为完成此类化合物的化学生物学作用机制研究提供了重要的物质基础。

Scheme 1 Synthetic routes of target compounds 9a-9c and 10a,10b

Scheme 2 Synthetic routes of target compound 15
实验部分

熔点用CXM-300型精密熔点仪测定,温度未校正; 1H NMR和13C NMR用Bruker Avance Ⅲ 400和500核磁共振仪测定 (400/500 MHz),TMS为内标,溶剂为DMSO-d6; HR-MS用Autospec Ultima-TOF质谱测定仪测定; Flash柱分离纯化用CombiflashRf 200快速制备液相; 荧光检测用ZF-20D暗箱式紫外分析仪; 薄层色谱 (TLC) 采用E-Merck公司预铺硅胶铝箔卷; 试剂均为分析纯。

Table 1 Anti-CVB3 activity of molecule probes. aCytotoxic concentration required to inhibit Vero cell growth by 50%. bConcentration required to inhibit CVB3 growth by 50%. cSelectivity index: TC50/IC50. RBV: Ribavirin

Table 2 Physical properties and spectra data of target compounds. The yield of final step
1 化学合成 1.1 11-苦参丁酸甲酯盐酸盐(4)[7]的合成

苦参碱2 (10 g,40 mmol) 加至氢氧化钠 (10 g,250 mmol) 的水溶液 (50 mL) 中,加热回流9 h,室温冷却过夜,析出大量白色固体,过滤,滤饼加入浓盐酸 (25 mL),减压浓缩,得粗品11-苦参丁酸盐酸盐 (3)。其浅黄色固体加入2 mol·L-1盐酸甲醇 (100 mL) 加热回流2 h,TLC检测,反应结束后,减压浓缩,得11-苦参丁酸甲酯盐酸盐 (4),产率65%~75%。

1.2 12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁醇

(6a)[7]的合成 将11-苦参丁酸甲酯盐酸盐4 (2 g,5.6 mmol) 置入CH2Cl2 (100 mL) 中,加入K2CO3 (3.1 g,22.4 mmol) 和对三氟甲基苯磺酰氯 (1.64 g,6.7 mmol),室温搅拌过夜,反应完全后,有机相依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得到12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁酸甲酯 (5a)。将此黄色油状液体置于无水THF (30 mL) 中,冰浴条件下缓慢加入LiAlH4 (255 mg,6.72 mmol),加毕移至室温反应30 min。依次加入丙酮 (4 mL)、饱和氯化铵溶液 (4 mL),30 min淬灭反应,过滤,滤液减压浓缩后,加CH2Cl2溶解,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁醇 (6a),产率72%。

以4和间 (邻) 三氟甲基苯磺酰氯为原料,参照化合物6a制备方法,得化合物6b、6c,产率60%~74%。

1.3 12-N-对三氟甲基苯磺酰-11-苦参胺 (9a~9c) 的合成

通过斯文氧化反应将6a氧化成醛: 将无水CH2Cl2 (100 mL) 置于三口烧瓶中,氮气保护,-78 ℃条件下,依次加入无水DMSO (0.74 mL,10.4 mmol)、草酰氯 (0.45 mL,5.2 mmol),搅拌10 min后,滴加化合物6a (1 g,2.2 mmol) 的CH2Cl2溶液,搅拌30 min,加入TEA (0.5 mL,3.5 mmol),转移至室温,搅拌30 min。加入饱和Na2SO3 (5 mL) 搅拌30 min,分液,留有机相,水相用CH2Cl2萃取,合并有机相,饱和氯化铵溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得12-N-对三氟甲基苯磺酰-11-苦参醛 (7a)。将其溶于1,2-二氯乙烷 (30 mL) 中,分别加入邻苯二甲酰亚胺 (323 mg,2.2 mmol),加热回流5 h,降至室温后,加入三乙酰基硼氢化钠 (STAB) (125 mg,3.3 mmol) 搅拌过夜,加水淬灭反应,减压浓缩,氨水调pH为9~10,CH2Cl2萃取,水 (50 mL×3) 和饱和食盐水 (50 mL×3) 洗涤,浓缩得中间体8a,中间体8a溶于乙醇,加入水合肼,室温搅拌反应2 h,过滤,滤液浓缩,残留物经Flash柱色谱纯化得白色固体目标化合物9a,产率37%。

以6b、6c为原料,参照化合物9a制备方法,经Flash柱色谱纯化得黄色油状物,将所得油状物以 1 mol·L-1 HCl/Et2O(1 mL) 酸化得白色固体9b、9c。产率39%~44%。

1.4 生物素酸12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁酯

(10a) 的合成 取生物素 (1 g,4.1 mmol) 置入50 mL DMF和CH2Cl2 (1∶2) 的混合溶剂中,依次加入HOBt、EDCI室温搅拌1 h,然后加入化合物6a (920 mg,2 mmol)、三乙胺 (606 mg,6 mmol) 及催化量4-N,N-二甲基吡啶 (4-DMAP),室温搅拌8 h,TLC检测。反应结束后,反应液倒入分液漏斗中,再加入30 mL CH2Cl2和40 mL水,分液,CH2Cl2层依次用水 (50 mL×3)、饱和氯化铵 (50 mL×3) 和饱和食盐水 (50 mL×3) 洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样Flash柱色谱,得白色固体生物素酸12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁酯 (10a),产率63%。

以6b和生物素为原料,参照化合物10a制备方法,得白色固体目标化合物10b,产率60%。

1.5 12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参乙醇 (14)[17]的合成

槐果碱 (1,5 g,20 mmol) 加至10% 浓硫酸溶液 (65 mL) 中,冰浴下缓慢加入KMnO4 (12 g,75 mmol),加热回流2 h,冷却至室温加入Na2SO3 (12 g,95 mmol) 搅拌1 h,加入甲醇 (200 mL), 过滤,滤液减压浓缩得粗品11-苦参乙酸 (11)。其褐色固体加入甲醇 (100 mL),缓慢滴加SOCl2 (5 mL,69 mmol),加热回流2 h,TLC检测,反应结束后,冰浴条件下加入10 mol·L-1 NaOH溶液(7 mL),调pH为7~8,减压浓缩,得11-苦参乙酸甲酯 (12)。溶于CH2Cl2 (100 mL) 中,加入K2CO3 (16 g,115 mmol) 和对三氟甲基苯磺酰氯 (7.0 g,32 mmol),室温搅拌过夜,反应完全后,有机相依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得到12-N-三氟甲基苯磺酰基-11-苦参丁酸甲酯 (13)。其黄色油状液体置于无水THF (40 mL) 中,冰浴条件下缓慢加入LiAlH4 (1.2 g,29 mmol),加毕移至室温反应30 min。依次加入丙酮 (6 mL),30 min,饱和氯化铵溶液 (6 mL),30 min淬灭反应,过滤,滤液减压浓缩后,加CH2Cl2溶解,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参乙醇 (14),产率30%。

1.6 生物素酸12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参乙酯

(15) 的合成 取生物素 (1 g,4.1 mmol) 置入50 mL DMF和CH2Cl2 (1∶2) 的混合溶剂中,依次加入HOBt、EDCI,室温搅拌1 h,然后加入化合物14 (920 mg,2 mmol)、三乙胺 (606 mg,6 mmol) 及催化量4-DMAP,室温搅拌8 h,TLC检测。反应结束后,反应液倒入分液漏斗中,再加入30 mL CH2Cl2和40 mL水,分液,CH2Cl2层依次用水 (50 mL×3)、饱和氯化铵 (50 mL×3) 和饱和食盐水 (50 mL×3) 洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样Flash柱层析,得白色固体生物素酸12-N-对三氟甲基苯磺酰基-11-苦参乙酯 (15),产率59%。

2 生物学实验 2.1 抗CVB3细胞水平的活性评价

每孔2.5×104个Vero细胞接种于96孔板内,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养16 h后,用100TCID50的CVB3病毒液100 μL/孔感染细胞,吸附1 h后弃去上液,给予相应浓度的受试化合物,并设置阳性药 (利巴韦林) 和病毒对照组。继续置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养72 h后,观察各浓度给药孔的细胞病变效应 (CPE) 值,采用Reed & Muench方法计算半数抑制浓度 (IC50)。

2.2 细胞毒性评价

每孔2.5×104个Vero细胞接种于96孔板内,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养16 h后,加入用维持液梯度稀释的受试化合物,同时设置细胞对照组,继续置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养72 h后,观察各给药孔的细胞CPE值,采用Reed & Muench方法计算半数致死浓度 (TC50)。

致谢: 核磁共振氢谱和碳谱由中国医学科学院药物研究所分析测试中心测定,高分辨质谱由中国医学科学院医药生物技术研究所分析测试中心测定。

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