成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 是FGF家族中FGF19亚家族成员之一,主要表达在肝脏中,其主要作用靶器官有肝脏、脂肪和胰腺等^[1],FGF21可以不依赖于胰岛素信号通路安全有效调节血糖^[2],不会产生低血糖、水肿和过敏等不良反应^[3]。除此之外,大量动物实验表明,FGF21可以有效改善胰岛素抵抗,降低血清中甘油三酯、胆固醇以及低密度脂蛋白的浓度^{[4, 5]} 。FGF21在治疗代谢疾病特别是糖尿病方面有着广阔的市场前景^{[6, 7]}。

大肠杆菌被广泛地应用到重组蛋白的生产,具有生产成本低、操作技术简单等优点,是表达非糖基化重组蛋白的首选,目前FDA批准生产的重组蛋白药物大约有30%由大肠杆菌表达^[8]。然而,大肠杆菌胞内表达重组蛋白,具有易被蛋白酶降解、不能形成正确的二硫键和错误折叠等风险,从而导致重组蛋白不表达、表达量低以及错误折叠形成包涵体等问题^{[8, 9]}。相对于大肠杆菌细胞质,细胞周质是一个氧化环境,有利于二硫键的正确形成促进蛋白质的正确折叠; 此外细胞周质蛋白酶含量低,重组蛋白不易被降解; 同时细胞周质蛋白总量低,便于重组蛋白的提取纯化,简化了提纯工艺并节约了生产成本^[10]。

Sec分泌途径是大肠杆菌经典的依赖于N端信号肽的转运途径,已有许多重组蛋白通过Sec 分泌途径成功表达^{[10, 11, 12, 13]},PelB (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA MA) 信号肽在大肠杆菌中是典型的Sec信号肽。鉴于细胞周质表达有其独特的优势,因此本文旨在利用该系统制备出纯度在95%以上且具有生物活性的h-FGF21蛋白。

质粒pSUMO-h-FGF21由本实验室构建,pET27b载体由本实验室提供,pMD18-Tsimple载体购自TaKaRa公司。E. coli菌株DH5α、BL21 (含DE3) 由本实验室保存。

dNTPs、rTaq酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)、溶菌酶、氨苄霉素 (ampcilin,Amp) 及卡那霉素 (kanamycin,Kan) 均购自TaKaRa公司。SUMO蛋白酶由本实验室制备。葡萄糖检测试剂盒购自北京金豪制药股份有限公司。Ni Sepharose 6 FF、Sephadex G-25、Capto Q填料、Column XK16/20空柱和HiScreen^TM Q HP预装柱购自GE公司。其他化学试剂均为分析纯。

HepG2细胞为东北农业大学生物制药教研室提供,db/db雄性小鼠 (8周龄,SPF级) 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,动物质量许可证号码SCXK (沪) 2014-0002。

引物设计软件为Primer premier 5.0,引物由Invitrogen公司合成,引物序列见表 1。

pET27b载体上含有PelB信号肽,以P1、P2为引物,pSUMO- h-FGF21为模板扩增目的片段,目的片段PCR纯化连入pMD18-Tsimple载体,并由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。经MscI、BamHI双酶切后,采用凝胶回收试剂盒回收并纯化目的DNA,连入pET27b载体中构建成重组质粒pET27bPelB-h-FGF21。

将pET27bPelB-h-FGF21转化至大肠杆菌BL21 (含DE3); 转化后挑取单菌落接种于含Kan (50 μg·mL^-1) LB 培养基20 mL中,37 ℃过夜培养,以1∶100接种于另 3个500 mL含 Kan (50 μg·mL^-1) LB& lt; span style='font-family:宋体;color:black'>培养基中,37 ℃培养; 当OD₆₀₀达到0.3～0.4时,加入IPTG至终浓度为0.25 mmol·L^-1进行诱导,诱导温度分别为25、30和37 ℃; 3 h后收集菌体,用20 mmol·L^-1 Tris (pH 8.0) 重悬,破碎离心后分别取上清液和沉淀进行15% SDS-PAGE分析,检测表达情况,上样量为20 μL。蛋白质分子质量计算公式如下: 蛋白质相对分子质量大小 = 氨基酸平均相对分子质量×氨基酸数-(氨基酸数-肽链数)×18。

收集菌体6 mL,1 mL PBS溶液洗一遍,用高渗溶液350 μL Tris (20 mmol·L^-1)/Sucrose (0.75 mmol·L^-1) (pH 8.0) 重悬菌体; 加入质量浓度为10 mg·mL^-1新鲜配制的溶菌酶母液35 μL (只有当EDTA存在时,溶菌酶才能起作用); 逐滴加入1 mmol·L^-1 EDTA溶液700 μL,同 时涡旋震荡混匀; 冰上孵育15 min; 加入0.5 mol·L^-1 MgCl₂溶液50 μL,并在冰上孵育10 min终止反应; 4 ℃、12 000 r·min^-1离心2 min,将上清液和沉淀进行15% SDS-PAGE分析,上样量为20 μL。

收集含有ph-FGF21的细胞周质蛋白提取上清 液,进行buffer置换,将蛋白置换到20 mmol·L^-1 Tris (pH 8.0) 结合缓冲液中。用AKTA purifier 100纯化系统将上清液,按200 cm·h^-1速度流入Capto Q (XK16/20,柱高10 cm) 柱; 待蛋白结合后采用步级梯度洗脱,根据紫外吸收峰收集蛋白。将含目标蛋白洗脱液稀释至电导值小于或等于5 mS·cm^-1,用HiScreen^TM Q HP column进行精细纯化,步级梯度 洗脱后收集蛋白。将收集的目标蛋白透析至PBS中。最后所得蛋白进行15% SDS-PAGE分析,上样量为20 μL。

表 1 (Table 1)

Table 1 Primer sequence Primer sequence Restriction enzyme cutting site P1 5'-TGGCCAGCCACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCC-3' MscI P2 5'-CGCGGATCCTTAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG-3' BamHI

Table 1 Primer sequence

将pSUMO-h-FGF21转化至大肠杆菌BL21 (含DE3); 转化后挑取单菌落接种于含Amp (100 μg·mL^-1) LB培养基20 mL中,37 ℃过夜培养,以1∶100接种于另一500 mL含Amp (100 μg·mL^-1) LB培养基中,37 ℃培养; 当OD₆₀₀达 到0.3～0.4时,加入IPTG至终浓度为0.25 mmol·L^-1进行诱导,诱导温度为30 ℃; 3 h后收集菌体,用Lysis buffer (20 mmol·L^-1 Na₃PO₄、500 mmol·L^-1 NaCl、40 mmol·L^-1咪唑,pH 7.4) 重悬菌体; 加入溶菌酶至终质量浓度为1 mg·mL^-1,4 ℃作用60 min。利用超声破碎仪冰上破碎菌体后,12 000 r·min^-1、4 ℃离心30 min,将上清液放置4 ℃待用。取全菌、离心后上清沉淀进行15% SDS-PAGE检测,上样量为20 μL。

用AKTA purifier 100纯化系统将表达ih-FGF21的BL21菌液上清依次进行Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析、Sephadex G-25脱盐、SUMO 蛋白酶酶切、Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析,即获得ih-FGF21成熟蛋白,并进行15% SDS-PAGE检测,上样量为融合蛋白20 μL、成熟蛋白40 μL。

实验室制备的鼠h-FGF21单抗^[14]为一抗,HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗。将上述得到纯化好的ph-FGF21和ih-FGF21为阳性对照以及BSA为阴性对照进行Western blotting 分析。

HepG2细胞饥饿12 h后,细胞生长状态回归至G₀期,分别加入不同浓度 (10、100及1 000 nmol·L^-1) 纯化后细胞周质表达ph-FGF21与ih-FGF21刺激细胞24 h; 用经微量化的POD-GOD方法检测培养基中剩余葡萄糖含量,并运用统计学分析结果。培养液中残留的葡萄糖浓度和细胞葡萄糖消耗率的计算公式如下: 葡萄糖浓度(mmol·L^-1) = (A_样品/A_标准) × 5.55; 细胞葡萄糖消耗率 = [(C_{空白葡萄糖} - C_{给药葡萄糖}) / C_{空白葡萄糖}] × 100% (A为波长在505 nm时紫外吸收值,C为葡萄糖浓度)。

实验选取15只成模的血糖接近均值的db/db小鼠,分成3组,每组5只; 分笼饲养在动物室 (温度22～28 ℃) 中,明暗周期为12 h (6∶00～18∶00),天黑前投食,自由饮水。实验期间,通过皮下注射方式给予各实验组小鼠对应蛋白,剂量为0.05 μmol·kg^-1·d^-1,模型对照组注射相同体积生理盐水。第一天给药3 h后,尾静脉取血比较两种蛋白对II型糖尿病db/db小鼠短期调节血糖能力。每天上午8∶00给药,连续给药14天,隔天给药前检测记录血糖值,比较两种蛋白长期调节血糖效果,所得实验数据进行统计学分析。

实验所得数据运用SPSS软件进行 统计学分析,两组间数据比较采用t检验,多组间比较采用方差分析。

pET27bPelB-h-FGF21重组质粒经MscI、BamHI双酶切后得到大约550 bp的小片段与预期543 bp相符(图 1),测序结果正确。实验结果表明,重组质粒构建成功。

Figure 2

Figure 2 Identification of the recombinant plasmid. 1: DL2000 marker; 2: Restriction enzyme analysis of pET27bPelB-h-FGF21; 3: λ-T14 marker

将含有pET27bPelB-h-FGF21表达载体的BL21菌株接种后诱导,诱导后3 h取样进行15% SDS-PAGE电泳分析。结果表明,含有pET27bPelB-h-FGF21的阳性菌以可溶形式表达了ph-FGF21,大小约20 kDa与计算的19.9 kDa相符(图 2A),目的蛋白在诱导表达温度为37 ℃时,ph-FGF21表达量最多,经灰度分析软件分析得知目的蛋白占菌体总蛋白10.2% (图 2A)。

收集菌体后,经EDTA和溶菌酶短时间处理后,细菌细胞壁被溶菌酶打孔后形成原生质球,细胞周质内蛋白释放,离心后分别收集上清以及沉淀,进行15% SDS-PAGE电泳分析。结果表明,重组蛋白绝大部分在细胞周质内可溶表达 (图 2B),且细胞周质内含有少量菌体自身表达蛋白。

Figure 2

Figure 2 A: Expression analysis of periplasmic expression of h-FGF21 (ph-FGF21) at different culturing temperatures. 1: Protein molecular weight (MW) marker; 2: The entire cell lysates at 30 ℃; 3: Supernatant of cell lysates at 30 ℃; 4: Precipitate of cell lysates at 30 ℃; 5: The entire cell lysates at 25 ℃; 6: Supernatant of cell lysates at 25 ℃; 7: Precipitate of cell lysates at 25 ℃; 8: The entire cell lysates at 37 ℃; 9: Supernatant of cell lysates at 37 ℃; 10: Precipitate of cell lysates at 37 ℃. B: The extracting of ph-FGF21. 1: Protein molecular weight marker; 2: Un-induced cell lysates; 3: The induced entire cell lysates; 4: The periplasmic h-FGF21; 5: Precipitate of protoplasm. C: Analysis of purified ph-FGF21 by SDS-PAGE. 1: Protein molecular weight marker; 2: Purified protein after Capto Q chromatography; 3: Blank lane; 4: Purified protein after Q high performance chromatography

经过两步离子交换洗脱出来的峰进行SDS-PAGE分析,如图 2C所示,2号泳道为Capto Q离子交换纯化后目的蛋白,3号为空泳道,4号泳道为HiScreen^TM Q HP column进行精细纯化后目的蛋白成单一条带,约为20 kDa。经紫外分光光度计测定蛋白浓度计算产量约为5 mg·L^-1。经灰度分析软件分析其纯度达到95%以上。

经30 ℃诱导3 h后,收集菌体,破碎离心,分 别取上清沉淀,以未诱导做阴性对照,进行15% SDS- PAGE电泳分析。结果显示,ih-FGF21融合蛋白绝大部分呈可溶形式表达 (图 3A)。经Ni S epharose 6 Fast Flow亲和层析,脱盐、酶切,二次亲和后得到成熟蛋白,进行15% SDS-PAGE电泳分析 (图 3B)。经灰度分析软件分析其纯度达95% 以上,应用紫外分光光度计测量浓度计算产量约为6 mg·L^-1。

Figure 3

Figure 3 A: Expression analysis of intracellular expression of h-FGF21 (ih-FGF21). 1: Protein molecular weight marker; 2: Un-induced cell lysates; 3: The induced entire cell lysates; 4: Supernatant of cell lysates 5: Precipitate of cell lysates. B: Analysis of purified ih-FGF21. 1: Protein molecular weight marker; 2: Sumo-ih-FGF21 fusion protein; 3: ih-FGF21 protein

采用鼠抗h-FGF21的抗体进行Western blotting 分析结果表明 (图 4),1号和2号泳道均能与鼠抗h-FGF21发生特异性反应,3号泳道为BSA阴性对照,证明表达纯化出的蛋白为h-FGF21。

Figure 4

Figure 4 Western blotting analyses the physical properties difference between ph-FGF21 and ih-FGF21. 1: ph-FGF21; 2: ih-FGF21; 3: BSA

结果如图 5所示,经过10、100和1 000 nmol·L^-1 ph-FGF21与ih-FGF21分别刺激后的细胞,采用GOD- POD法检测其葡萄糖吸收率。实验结果表明,与空白对照组相比,两者均能显著增加细胞葡萄糖吸收率,且呈剂量依赖性; 相同浓度的ph-FGF21与ih-FGF21促进细胞糖吸收的生物学活性无显著差异,说明ph-FGF21与ih-FGF21在细胞水平上促进HepG2细胞糖吸收的生物学活性并没有显著差异,证实分泌到细胞周质表达的ph-FGF21在细胞水平生物活性并未受到影响。

注射3 h后,模型对照组小鼠的血糖由 (17.31 ± 3.79) mmol·L^-1变为 (17.18 ± 4.01) mmol·L^-1,ph-FGF21组小鼠血糖由 (18.53 ± 2.30) mmol·L^-1降至(10.41 ± 2.56) mmol·L^-1,ih-FGF21组小鼠血糖由 (18.15 ± 2.57) mmol·L^-1降至(10.72 ± 1.74) mmol·L^-1。与模型对照组相比,无论作用效果还是作用时间,两种FGF-21蛋白都表现出良好的降糖效果,血糖在注射1 h开始下降,注射3 h降糖效果较模型对照组相比差异极显著,两种蛋白之间差异不显著,注射后3 h降糖效果与Yu等^[15]研究结果一致。连续注射14天,每天上 午8∶00给药,隔天给药前监测血糖,给药4天后与生理盐水组相比,ph-FGF21与ih-FGF21注射组小鼠血糖均降为7.5 mmol·L^-1左右,且一直保持稳定,二者并无显著差异 (图 6)。说明两种来源的重组FGF-21蛋白均能长期维持II型糖尿病小鼠血糖稳定。

Figure 5

Figure 5 Comparison of glucose uptake in HepG2 cells treated with ph-FGF21 or ih-FGF21. n = 5,$\overline{x}$± s. **P < 0.01 vs vehicle

Figure 6

Figure 6 Comparison of ph-FGF21 and ih-FGF21 for long- term hypoglycemic effect in db/db mice. Diabetic db/db mice were administrated with saline (vehicle),0.05 μmol·kg-1·d-1 ph-FGF21 and 0.05 μmol·kg-1·d-1 ih-FGF21 for 14 days,respectively. n = 5,$\overline{x}$± s

至今为止,多种Sec分泌途径信号肽已经成功应用于高效可溶表达重组蛋白,例如PelB、OmpA、PhoA、endoxylanase、OmpT和StII等。目前已有一些细胞周质表达的重组蛋白应用于临床,包括一些Fab片段 (Leucentis^®和Cimza^®) 等^[8]。其中重组蛋白细胞周质表达与表达载体、宿主菌、诱导表达条件、重组蛋白质本身的性质以及信号肽的选择等一系列问题密切相关。pET表达系统由Studier和Moffat开发,是现在应用比较广泛的大肠杆菌表达重组蛋白系统之一。PelB信号肽为pET载体上固有的信号肽,Sockolosky等^[16]成功地用pET-22b载体在细胞周质表达了hGH。因此,本研究选取了pET-22b同系列的表达载体pET-27b,将PelB信号肽替换成OmpT (MRAKLLGIVLTTPIAISSFA) 和PhoA (MKQSTIAL ALLPLLFTPVTKA) 进行比较研究,后两者均未能成功携带h-FGF21表达 (数据未显示),最终筛选出PelB信号肽为表达h-FGF21的合适信号肽。同时,本研究也进行了BL21与Rosetta宿主表达菌,25、30和37 ℃诱导表达等条件对ph-FGF21表达的影响,得出BL21以及37 ℃诱导为适合ph-FGF21表达条件的结论 (以上部分结果数据未在文中展现)。

大肠杆菌细胞周质为内膜和外膜中间的部分,细胞周质内含有一系列Dsb蛋白,Dsb蛋白含有多个高度保守的硫氧还蛋白样基序 (C-X-X-C),这一基序对二硫键氧化还原酶活性有重要作用^[17]。其中,DsbA和DsbB蛋白作为氧化还原酶可以催化二硫键形成; DsbC和DsbD蛋白可以对蛋白质内形成的错误二硫键进行重排; 此外,包涵体一般不会在细胞周质内积聚,DegP蛋白酶可以快速将包涵体降解^{[17, 18]}。因此,本研究可以在37 ℃、3 h内,在细胞周质内得到可溶表达的目的蛋白。细胞周质空间内菌体本身蛋白含量少,利于重组蛋白的纯化,经过细胞周质蛋白提取以及两步离子交换得到了纯度大于95% 的重组蛋白,且细胞及体内生物活性与ih-FGF21一致,表明两种表达方式得到的重组蛋白并无差异。

FGF21是重要的糖脂代谢调节因子,是治疗肥胖和II型糖尿病等代谢疾病的潜力药物。本文利用pET-27b载体成功地在大肠杆菌周质可溶表达了ph-FGF21,得到与ih-FGF21生物学活性一致的重组蛋白。ph-FGF21产量约为5 mg·L^-1,与ih-FGF21产量约为6 mg·L^-1相比略低,然而,ph-FGF21不需要SUMO蛋白酶过夜酶切,节约了制备蛋白酶成本以及酶切时间; 同时用于ph-FGF21纯化的离子交换填料比用于ih-FGF21的亲和层析填料便宜3～4倍。综上所述,本研究解决了带SUMO标签表达需要昂贵的蛋白酶酶切、包涵体表达费时费力、变性复性率低以及胞内表达纯化工艺复杂等一系列问题,为工业化生产提供了新思路,但后期实验需要在培养表达条件和提高蛋白产量方面做进一步优化,为大批量发酵生产做好准备。