药学学报  2016, Vol. 51 Issue (4): 672-676   PDF    
基于酶结构设计的个体化治疗药物克里唑替尼
郭宗儒    
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
1 研发c-Met抑制剂—从苗头到先导化合物 1.1 c-Met是抗肿瘤药物的靶标

辉瑞公司于2006年上市了舒尼替尼 (1,sunitinib),由于1对多种酪氨酸激酶 (VEGFR、PDGFR和KIT) 的抑制作用,得以治疗对伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤 (GIST) 患者。循此研发路径,公司也着手研究与肿瘤相关的其他激酶的药物。

间充质上皮转化因子激酶 (c-Met) 也是受体酪氨酸激酶,它的天然配体是肝细胞生长因子 (HGF,又称扩散因子),其信号通路对发育、器官形成和机体稳态起重要作用。当c-Met被HGF激活,引发细胞增殖、迁移、浸润和分支形态发生等浸染过程。许多实体瘤的c-Met的畸变和过度表达,发生结构性活化、基因放大和突变,因此c-Met被认为是肿瘤药物治疗的分子靶标。

1.2 苗头化合物优化

辉瑞研发c-Met激酶抑制剂仍以3-取代的吲哚啉-2-酮 (或称羟基吲哚) 为母核,这是因为该母核能以平面的方式进入激酶的结合位点,提供形成两个氢键的元件: 经环上的N-H和C=O可与激酶的ATP结合域发生氢键结合。在筛选已有的化合物中发现苗头化合物2(SU-5402) 抑制c-Met激酶的活性高达IC50 = 10 nmol·L-1,在1 μmol·L-1浓度下可因抑制c-Met而完全阻止了A549细胞的生长。

为了提高苗头对c-Met激酶的选择性作用,分别在母核的两个位置进行修饰,一是在4位连接 (取代的) 苯基,另一是在5位连接 (取代的) 苄基磺酰基侧链。通式3在苯环上R1为一个或两个简单取代基; 酰胺基侧链大都连接在4位或3位,R2多为叔或仲氮原子; R3为一个甲基时处于5位,酰胺侧链连接于3位,R3为2,5-二甲基时,酰胺侧链连接于4位。4-苯基吲哚林-2-酮系列 (通式3) 共合成并专利公布了435个实施例 (合成的目标化合物可能更多),都程度不同的显示了抑制c-Met活性 (Cui JR,et al. 4- Aryl substituted indolinones. WO 02/055517)。通式4的R1、R2和R3的含义与通式3相同,合成并专利公布了375个实施例,也显示了抑制c-Met活性 (Cui JR,et al. 5-Aralkylsulfonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)- 2-indolinones as kinase inhibitors. WO 02/096361)。

1.3 先导化合物

在报道的近千个目的化合物中,化合物5 (PHA-665752) 显示对c-Met激酶具有高选择性活性,强于对其他激酶抑制活性的50倍以上; 对高表达c-Met的细胞抑制活性IC50 = 9 nmol·L-1,而且 显著抑制多株肿瘤细胞的生长、迁移和浸润; 体内实验显示5能抑制移植性肿瘤细胞的c-Met磷酸化,且剂量依赖性地抑制肿瘤生长。5的物化和活性参数如下: 相对分子质量为641.62,配体效率 (LE) 为0.25 (LE = 由IC50换算成的结合自由能ΔG/非氢原子数,是联系化合物分子尺寸和与受体结合强度的量度,表示化合物的活性效率),亲脂性效率LipE为4.85 (LipE = pIC50 - clogD,是联系化合物亲脂性和与受体结合效率的量度,数值越大越趋近成药性),分布系数logD = 3.20 (于pH 7.4测定)。这些数据表明5可作为候选化合物进入开发阶段。

然而,5的相对分子质量偏大,尽管结构中含有成盐性基团,但成盐后溶解性仍差,在pH 7.4缓冲液中溶解度为0.9 μg·mL-1。此外5在大鼠体内有较高的代谢清除率,CL = 77 mL·min-1·kg-1,这些不利的物化和药代性质,表明不宜作为候选药物进一步研发,因而将5作为先导物进行结构优化。优化的目标是在保持对c-Met激酶和细胞的高抑制活性和选择性的前提下,降低分子尺寸,以改善物化和药代性质。

2 结构生物学揭示复合物的微观结合特征

化合物5与c-Met激酶 (未被磷酸化的结合域) 的复合物晶体结构表明有如下结合特征 (图 1): ① 结合域的A-环套 (A-loop) 采取了独特的自身抑制状态的构象,即在激酶的活化环套残基1222~1227形成转折, 占据了αC螺旋的催化位置,使得1228~1245环套残基移位,干扰了ATP与底物的结合; ② 吲哚酮的N-H和C=O基团与激酶铰链的残基分别形成氢键; ③ 吲哚酮的C=O与吡咯环的N-H形成分子内氢键,因而吲哚酮与吡咯环形成较大的共轭平面,处于ATP的腺嘌呤环结合的平面裂隙处; ④ 连接羟基吲哚与二氯苯基的连接基磺酰亚甲基形成U-形转折,使二氯代苄基与具有独特构象的A-环套上Tyr1230的苯酚环发生π-π堆积作用; ⑤ 磺酰基的氧原子与Asp1222的N-H形成氢键,稳定了分子取向; ⑥ 与吡咯环相连的酰胺及延伸的片段进入了水相,未与蛋白结合。

Figure 1 A: 化合物5与c-Met激酶结合域共结晶的结构图; B: 结合的简化图

上述结合的信息,为化合物5的结构改造与优化提供了微观性的依据。

3 基于酶结构的分子设计 3.1 骨架迁越——母核的优化

吲哚环经磺酰亚甲基与二氯苯基相连,二氯苯基为了与Tyr-1230发生重要的π-π堆积,磺酰亚甲基还得作U形转折,说明连接链-SO2-CH2-的长度有些冗赘,加之吲哚酮与吡咯环形成过大的共轭平面,提示化合物5的骨架有不足之处,须加以缩小变换。

采用骨架迁越方法,用可提供两个氢键结合的小尺寸平面结构替换吲哚酮-吡咯母核,以便适配于较小的嘌呤结合腔,并保持形成氢键能力; 同时缩短连接基,消除形成U形转折的熵损失,使二氯苯基更有利于与Tyr1230发生相互作用,将整个分子尺寸降低下来。

在骨架变迁中经历了数个阶段: 将5的吲哚酮 与吡咯的分子内氢键“固化”成共价键,为氮杂吖啶6,此时吡咯的NH与吡啶的N分别提供氢键的给体和接受体,母核+连接基的非氢原子数由原来的22降到17; 继之切断C-N键形成2-氨基-3-苯基吡啶化合物7 (非氢原子数仍为17),此时2-氨基吡啶提供氢键的给体和接受体,再简化连接基,用氧原子替换磺酰苯基,成为化合物8,非氢原子数降低到9。

3.2 新骨架的首轮优化

化合物8对c-Met激酶的Ki值3.83 μmol·L-1,活性虽然较弱,但因相对分子质量低,配体效率仍不错,LE = 0.29,高于化合物3,但亲脂性效率降低到LipE = 0.35,显然是因活性低的缘故。8的苯环上留有羟基,成为引出极性侧链的“端口”,连接吗啉亚乙基得到化合物9,活性略有提高,Ki = 2.45 μmol·L-1,但因分子尺寸加大,配体效率降低。进而加长并模仿化合物3的末端片段,化合物10的Ki = 0.46 μmol·L-1,LE = 0.24,LipE = 3.70,提高了抑制活性和亲脂性效率。

氨基吡啶系列的化合物与c-Met的复合物晶体 表明,氨基和吡啶的N原子分别与铰链形成氢键,由于缩短了连接基,使得二氯苯基容易同环套A上的Tyr1230发生π-π相互作用,苯甲酰基连接的片段进入水相中,但不同的片段活性不同,例如化合物10的活性是9的5倍,表明虽然亲水性片段进入了水相,没有同酶结合,但却影响了分子的结合。

3.3 二氯苯基的取代基的变换和连接基亚甲基的甲基取代

氨基吡啶骨架系列的二氯苯基与A环套的Tyr1230的苯酚基发生π-π堆积结合,为了考察环上取代基对活性Ki和亲脂性效率LipE的影响,合成了通式11的化合物,式中R代表一个、两个或三个相同或不同的原子或基团,R'为H或甲基,测定化合物对c-Met激酶的pKi值,计算分子的亲脂性参数cLogD值,将各化合物的活性pKi值与cLogD作图,图 2表示了有代表性的化合物的活性与亲脂性效率LipE的关系,表明随着苯环上亲脂性的增加,提高了抑制活性。

Figure 2 苯环与连接基变换与活性和亲脂性效率的关系

连接基上R'为甲基取代比未被取代的相应化合物活性高,提示甲基取代有利于提高活性。其中化合物12活性最高,对c-Met酶的活性参数为: Ki = 0.012 μmol·L-1,LipE = 4.82; 对c-Met细胞的活性参数为: IC50 = 0.020 μmol·L-1,LipE = 4.60。

3.4 5-苯环的变换—— 5-吡唑环系的确定

研发至此,以化合物12为代表的三卤代苯和连接基的化合物达到最佳优化状态,下一步是在保持活性和选择性前提下,优化物理化学和药代动力学性质。根据复合物的晶体结构,5-苯基结合于Tyr1159、Ile1084和Gly1163构成的疏水性狭窄裂隙,这需要确保在氨基吡啶的5位连接的芳环具有平面性,芳基上连接的基团 (片段) 延伸到溶剂相中。此外,12中的酰胺片段已离开疏水裂隙,进入水相,提示延伸的亲水性片段可不必经酰胺键连接。

用五元含氮芳环替换5-苯环可增加水溶性,例如含5-吡唑或咪唑化合物的cLogD比相应的苯化合物低2个单位,并且较小扭角 (减少了迫位效应),增加了共面性,有利于结合。

氨基吡啶与吡唑环的连接方式对活性影响很大,例如化合物13和14的活性 (酶的Ki和细胞的IC50) 以及LipE值相差很大。结构生物学表明,13的吡唑环氮原子所处的位置使得c-Met的残基Met1160和Ile1084取向与吡唑环邻近,不利于氨基吡啶的氢键结合,而且该吡唑环处于酶蛋白的疏水性界面, 为了发生疏水-疏水相互作用,N原子的孤电子对的去水合作用是不利的焓变; 而14的N原子都进入了水相,没有上述的不利效应,因而活性高于13,酶或细胞活性提高了30~40倍。化合物14的N-甲基化后产物15的活性更强,提示由这个N原子可引出含有极性基团的碳链,以提高活性水溶性。

3.5 N-取代的吡唑化合物的优化

鉴于化合物10结构中含有延伸到水相的碱性基团能够提高活性和亲脂性效率,因而也在吡咯环系上引入尽可能小的碱性片段,例如链烷基叔胺、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶等,以增加活性和改善药学和药代性质。在选择高活性 (酶和细胞) 和高亲脂性效率的化合物同时,还评价对人肝微粒体 (HLM) 的稳定性,从有代表性的化合物中优选出16和17,尤其是因17的高活性和较好的代谢稳定性,确定为候选药物。

3.6 光学活性的候选药物——克里唑替尼的成功

前述优化过程制备的吡唑系列化合物含有手性碳原子,都是用混旋的样品测定活性的。将优选出的化合物17拆分成光学活性物质,活性测定表明R-构型的分子18活性强于RSS构型,对酶和细胞抑制活性分别为Ki = 0.002 μmol·L-1和IC50 = 0.008 μmol·L-1。作为进一步研发的候选物命名为克里唑替尼 (crizotinib)。

4 克里唑替尼的作用特征 4.1 克里唑替尼的物化和活性参数

以化合物5为先导化合物成功研制出克里唑替尼18,体现了结构生物学和药物化学结合应用的成果,表 1比较了化合物5和18的物化和生物学参数。在优化的路径上,相对分子质量降低了191(30%),表征亲脂性的分布系数降低了1.3个对数单位 (20倍),对c-Met细胞的抑制活性没变,亲脂性效率增加了1.3个对数单位。

Table 1 化合物5与18的物化性质和活性参数的比较
4.2 克里唑替尼与c-Met结合特征

克里唑替尼 (化合物18) 与c-Met的复合物晶体结构表明,其结合模式与3基本相同。α-甲基苄基与c-Met的环套A发生相互作用,不仅有助于苄基的定位,而且增加了与疏水腔 (由Val1092、Leu1157、Lys1110和Ala1108的侧链构成) 发生的疏水相互作用,甲基处于R构型更适配于该疏水腔; 三卤苯基与Tyr1230发生π-π堆积,氟和氯原子还与Asp1222的N-H发生静电引力,比3的SO2形成氢键更有利。而且距离比3的苯基 更有利。母核2-氨基吡啶平面结合于铰链区,而没有3的羟基吲哚结合时发生构象变化而引起的张力。5- (4-吡唑) 基结合于由Ile1084和Tyr1159构成的狭窄的亲脂性通道内,哌啶环进入水相之中。图 3是化合物18与c-Met酶复合物的晶体结构图 (Cui JJ,Tran- Dubé M,Shen H,et al. Structure based drug design of crizotinib (PF-02341066),a potent and selective dual inhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) kinase and anaplastic lymphoma kinase (ALK). J Med Chem,2011,54: 6342-63 63)。

Figure 3 化合物18与c-Met酶复合物晶体结构
4.3 克里唑替尼对ALK激酶的选择性作用

为了证明克里唑替尼的选择性抑制作用,评价了它对人的120个激酶抑制活性,发现克里唑替尼对间变性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase,ALK) 与核磷蛋白 (nucleophosmin,NPM) 的融合蛋白高表达细胞的抑制活性很高 (IC50 = 20 nmol·L-1),ALK融合蛋白是发生间变性淋巴瘤、炎性肌纤维细胞瘤和非小细胞肺癌的关键性酶,因而预计克里唑替尼可治疗非小细胞肺癌等恶性肿瘤。

克里唑替尼与ALK激酶结合域的复合物晶体结构 (PDB code 2xp2) 表明,其结合模式与酮c-Met结合特征相似,主要的区别在于ALK的环套A没有类似于同c-Met的Tyr1230发生π-π堆积作用,因而活性低于c-Met激酶; 另一个区别是与2-氨基吡啶和3-卤代苄氧基发生疏水相互作用的残基不同,c-Met为Met1211,而ALK为Leu1211。虽然化学结构的构建是基于c-Met酶的结构的,但由于同c-Met和ALK结合的相似性,因而克里唑替尼成为作用于双靶标的抗肿瘤药物。

5 克里唑替尼的批准上市

克里唑替尼是c-Met/ALK激酶双靶标抑制剂,可能成为ALK融合蛋白呈阳性的非小细胞肺癌患 者的潜在靶向药物。因此辉瑞公司在2007年迅速调整了临床试验的研发方向,转向那些2%~7% 含有NPM-ALK瘤源性融合基因的非小细胞肺癌患者。

根据FDA关于靶向治疗和伴随诊断的指导意见,在临床试验中辉瑞与FDA以及发现ALK融合基因 的雅培公司的分子诊断业务部门进行了密切合作,确保辉瑞的克里唑替尼与雅培的Vysis ALK Break Apart FISH(荧光原位杂交) 探针试剂盒同时获得批准。从2007年立项到2011年克里唑替尼 (商品名为Xalkori) 批准上市,仅用了4年时间。克里唑替尼的研发是个体化治疗的又一个重大突破,美国国家癌症综合网络 (NCCN) 推荐作为ALK阳性的晚期非小细胞肺癌患者标准药物,其地位甚至超越了常规化疗 (Roberts PJ. Clinical use of crizotinib for the treatment of non- small cell lung cancer. Biologics,2013,7: 91-101)。