2. 中国中医科学院中药资源中心, 北京 100700
2. National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
雷公藤 (Tripterygium wilfordii Hook.f.) 是传统中药雷公藤的植物来源,现代药理研究表明具有抗癌[1]、调节免疫系统、治疗类风湿性关节炎[2]等作用。雷公藤中化学成分对细胞增殖的抑制作用引起了国内外研究者的广泛关注[3, 4]。雷公藤红素是雷公藤植物中代表性三萜类成分,以其显著的药理活性成为国内外研究的热点化合物之一[5, 6]。
高等植物中有定位于胞质的MVA (mevalonate) 和定位于质体的MEP (methylerythritol) 两条萜类 合成途径,两条途径产生共同的IPP (isopentenyl- diphosphate) 前体[7]。IPP和它的同分异构体DMAPP (dimethylallyl diphosphate) 在法呢基焦磷酸合酶 (farnesyl diphosphate synthase,FPS) 的催化作用下生成法呢基焦磷酸 (farnesyl diphosphate,FPP)[8]; 两分子FPP在鲨烯合酶 (squalene synthase,SQS) 的作用下合成一分子鲨烯[9]。鲨烯是三萜类化学成分的共同前体,SQS是三萜类成分合成途径中的关键酶[10]。目前SQS已经在甘草[11]、人参[12]、黄花蒿[13]等药用植物中克隆得到,然而雷公藤中SQS的信息并未见报道。
雷公藤植物生长周期长,且植物中次生代谢物含量低,利用传统化学提取方法获得活性成分面临成本高、产量低的问题。利用合成生物学办法获得结构复杂的次生代谢产物是可行的办法。SQS作为三 萜类成分生物合成途径上的关键酶,在合成过程中发挥重要作用,因此雷公藤SQS相关信息对于雷公藤中雷公藤红素等三萜类成分的生物合成研究具有重要意义。本文从雷公藤悬浮细胞中克隆得到了1条全长SQS基因,并进行生物信息学分析,以茉莉酸甲酯 (MJ) 为诱导子对雷公藤悬浮细胞进行诱导,分析诱导后T wSQS的表达情况变化,为雷公藤中三萜类成分生物合成研究奠定基础。
材料与方法 植物材料雷公藤悬浮细胞培养于MS液体培养基中,添加0.5 mg·L-1 2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸) + 0.1 mg·L-1 KT (激动素) + 0.5 mg·L-1 IBA (吲哚丁酸),25 ℃,120 r·min-1于黑暗条件下振荡培养。
菌株实验使用的E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。
试剂及仪器PrimeSTAR GXL DNA Polymerase,PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa宝生物工程 (大连) 有限公司; 2×EasyTaq PCR SuperMix,pEASY-T3 Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司; RNA纯化试剂盒,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,质粒提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司; KAPA SYBR FAST Universal 2×qPCR MasterMix购自KAPA Biosystems公司。其他化学试剂为国产分析纯; PCR扩增仪型号为ABI verity; 实时定量PCR仪型号为ABI 7300系统; 引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,测序服务由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
雷公藤总RNA提取取培养10天的雷公藤悬浮细胞,加入MJ诱导子,使诱导终浓度为50 μmol·L-1。分别于诱导后1、4、12、48和72 h后取材,液氮速冻后置于 -80 ℃保存。利用CTAB法提取雷公藤悬浮细胞总RNA,并用DNase (NEB) 和RNA纯化试剂盒去除基因组污染,精制RNA。
全长cDNA获得根据雷公藤转录组数据信息,获得TwSQS基因序列,通过NCBI BLAST搜索该基因的开放阅读框,设计全长cDNA引物 (SQS-F: 5'- AGCAGACGCCACATTAGA-3',SQS-R: 5'-GTTGTAT AGTCCGTAGTTGCC-3')。根据PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书将雷公藤悬浮细胞总RNA反转录成cDNA作为模板,配制反应体系: 1 μL cDNA、10 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、4 μL dNTP (2.5 mmol·L-1)、1 μL SQS-F (10 μmol·L-1)、1 μL SQS-R (10 μmol·L-1)、1 μL PrimeSTAR GXL DNA Polyerase和32 μL ddH2O。反应程序: 98 ℃ 3 min; 98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 2 min,重复35个循环。将PCR产物切胶纯化后回收连接pEASY-T3载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,挑选阳性克隆并进行测序验证。
雷公藤SQS基因序列的生物信息学分析NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 通过BLAST搜索蛋白质和核苷酸数据库,并由DNAMAN软件翻译成氨基酸序列,使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 查找开放阅读框 (ORF)。采用Interpro (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/) 进行结构域比对,ExPASy在线服务器的 Compute PI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/) 预测相对分子质量与理论等电点,TRMHMMserver v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 进行跨膜域分析,predictprotein (http://www.predictprotein.org/) 进行 二级结构预测,SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) 进行二级结构分析和结构域的三维同源建模。用DNAMAN软件对序列进行多重比对,用ClustalW软件与其他植物的SQS氨基酸序列进行比较,用MEGA 5.1软件构建Neighbor-joining系统进化树,Bootstrap重复次数为1 000次。
雷公藤SQS基因诱导表达分析用CTAB法 提取诱导后不同时间点的总RNA,去除基因组污染后反转录成cDNA,以β-actin作为看家基因,检测雷公藤悬浮细胞中TwSQS表达含量变化。设计引物如下: β-actin-F: 5'-AGGAACCACCGATCCAGACA-3',β-actin-R: 5'-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3',SQS- RT-F: 5'-AATAACACAGCGAATGGG-3',SQS-RT-F: 5'-GGGACTTAGGTATCTCGTTTA-3'。实时荧光定量反应体系: 10 μL 2×SYBR green Mix: 0.4 μL ROX High、正反引物 (10 μmol·L-1) 各0.4 μL和7.8 μL ddH2O。反应程序: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,重复40个循环。于延伸阶段进行数据采集,65~95 ℃做融解曲线分析。每个反应重复3次,用2-△△Ct法分析TwSQS的相对表达量。
结果与分析 1 TwSQS全长cDNA的获得实验获得TwSQS的全长cDNA序列,序列全长PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,见图 1。
TwSQS基因全长1 800 bp,通过在线软件对序列进行分析,发现基因包含完整的开放阅读框,开放阅读框为1 242 bp。利用DNAMAN软件推导该序列翻译的氨基酸序列,并进行BLAST。TwSQS与其他植物SQS氨基酸序列具有较高相似性,与乌拉尔甘草 (Glycyrrhiza uralensis) 相似度为85%、与三七 (Panax notoginseng) 相似度为85%、与人参 (Panax ginseng) 相似度为84%、与黄花蒿 (Artemisia annua) 相似度为81%。将TwSQS序列与其他植物进行多重序列比对 (图 2),利用InterproScan进行结构域分析,发现TwSQS存在两个鲨烯合酶保守位点,鲨烯合酶体征位点I: 168~183 aa和鲨烯合酶体征位点II: 201~229 aa。由以上结果判断本文获得的cDNA编码的蛋白为雷公藤鲨烯合酶,命名为TwSQS。
将TwSQS与GenBank下载的其他物种SQS氨基酸序列进行比对分析,利用MEGA5.1软件采用相邻连接法构建SQS的系统进化树 (图 3)。本文选取2种真菌、12种植物中的SQS序列进行建树,进化树中可以看出,植物与真菌中的SQS分为两支,且植物中单子叶植物与双子叶植物分化较为明显。TwSQS与双子叶植物SQS聚为一支,且与乌拉尔甘草同源性最高,位于进化树上部位置。
根据ExPASy在线软件预测,TwSQS编码413个氨基酸,编码的蛋白理论等电点为7.94,相对分子质量为47.20 kD。TwSQS蛋白二级结构预测结果显示主要有螺旋和成环结构构成,其中螺旋结构占65.38%、成环结构占34.14%、线性结构占0.48%。亚细胞定位及跨膜结构域分析推测TwSQS是膜蛋白,3' 端具有疏水性,包含两个跨膜结构域,分别为281~303 aa和387~404 aa。蛋白3D结构预测见图 4,同源建模模板为3wca.3.A,序列同源度为45.43%,建模范围为模板蛋白的34~370 aa。
用2-△△Ct法处理实时荧光定量PCR数据,分析雷公藤悬浮细胞中TwSQS在MJ诱导后不同时间的表达水平,结果如图 5。MJ诱导后72 h内TwSQS相对表达量有不同程度提高,于诱导后4 h达到最高值,是0 h表达量的3.70 倍; 随着时间延长表达量变化水平降低,在诱导后72 h,诱导组表达量水平是0 h的1.92倍。
雷公藤红素是雷公藤植物中具有重要药理活性的三萜类成分,该成分在原植物中的化学成分含量极低[14],通过构建体外生物合成的办法获得该成分是有效的途径。然而雷公藤中三萜类生物合成途径上的基因元件的相关研究较少,限制了三萜类成分的合成生物学研究。本文首次从雷公藤悬浮细胞中克隆获得鲨烯合酶基因,利用生物信息学方法分析基因及其编码的蛋白质氨基酸序列特征,并检测了MJ诱导条件下基因表达情况的变化。结果表明,本文得到的TwSQS基因与其他物种中的SQS基因具有较高相似性,相似度为80%左右。其编码的SQS蛋白具有保守的鲨烯合酶催化位点和蛋白结构,包括活性位点及SQS蛋白特征性的跨膜区。诱导表达结果显示TwSQS基因在MJ诱导后表达水平提高,提示该基因可能与下游雷公藤悬浮细胞中三萜类成分的次生代谢过程有相关关系。
本文选用的茉莉酸甲酯诱导子是一种广泛存在于植物中的植物激素,具有提高植物次生代谢水平、增加三萜类次生代谢物累积的作用[15]。虽然其作用机制尚未完全解析,但其诱导次生代谢途径的作用已被广泛证实。已有文献报道MJ能诱导药用植物人参[16]、柴胡[17]等三萜及甾醇类生物合成途径,增加药
用活性成分如人参皂苷、柴胡皂苷等物质的含量。由此推测MJ能够诱导雷公藤悬浮细胞中三萜类成 分生物合成途径,提高相应代谢物的含量。有研究用MJ诱导茯苓 (Poria cocos) 并检测了其中鲨烯的含量和PcSQS基因mRNA表达情况,发现诱导组的PcSQS表达水平显著提高,鲨烯含量是对照组的4 倍[18],与本文克隆得到的TwSQS表达情况相似,这些证据都提示TwSQS与雷公藤悬浮细胞中三萜类成分的次生代谢途径相关。
SQS具有催化生成鲨烯的作用,鲨烯是三萜类成分的共同前体,因此探究SQS对于解析三萜类成分生物合成具有重要作用。目前,研究者已经利用原核表达蛋白,进行体外酶促的办法鉴定了印度人参[19]、灵芝[20]、人参[12]等植物中SQS的功能。本文得到的TwSQS序列为雷公藤中三萜类成分的生物合成研究提供了物质基础和调控元件,丰富了雷公藤萜类成分生物合成途径上的信息。
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