药学学报  2016, Vol. 51 Issue (4): 637-641   PDF    
LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中4种淫羊藿黄酮苷
许舜军1, 朱雅玲2, 余捷婧3, 冯怡3, 孙帅1, 许艺镌1, 杨柳3     
1. 广州万正药业有限公司, 广东广州 510663;
2. 广东省第二中医院, 广东广州 510095;
3. 广东省中医院, 广东省中医药科学院, 广东广州 510120
摘要: 建立大鼠血浆中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的LC-MS/MS法,并应用于大鼠肌肉注射喘可治注射液后血浆中4种黄酮苷浓度的测定及喘可治注射液的药物动力学研究。采用的色谱条件为Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×2.1 mm, 5.0 μm)色谱柱,乙腈-0.1%甲酸水溶液(35:65)为流动相,流速0.22 mL·min-1,柱温40℃;质谱条件为电喷雾多反应离子监测(MRM)负离子检测模式,血浆样品采用固相萃取法处理。结果显示,朝藿定A、B、C及淫羊藿苷在1~1000 ng·mL-1浓度内具有良好的线性关系;日内精密度RSD<5.99%,日间精密度RSD<10.16%;各成分相对回收率介于88.1%~101.1%, RSD<7.9%,绝对回收率介于72.0%~86.6%, RSD<6.3%。研究表明,该分析方法专属、灵敏、快速,适用于血浆中淫羊藿黄酮苷浓度的测定。
关键词: LC-MS/MS     喘可治注射液     8-异戊烯基黄酮苷     血药浓度     含量测定    
Simultaneous determination of 4 prenylflavonoids of Chuankezhi injection in rat plasma by LC-MS/MS
XU Shun-jun1, ZHU Ya-ling2, YU Jie-jing3, FENG Yi3, SUN Shuai1, XU Yi-juan1, YANG Liu3     
1. Guangzhou ImVin Pharmaceutical Co. Ltd., Guangzhou 510663, China;
2. Guangdong Second Traditional Chinese Medical Hospital, Guangzhou 510095, China;
3. Guangdong Provincial Hospital of TCM, Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences, Guangzhou 510120, China
Abstract: A quantitative method for epimedin A, B, C and icariin in rat plasma was established using LC-MS/MS after intermuscular administration of Chuankezhi injection to rat. Chromatographic separation was performed on an Agilent Eclipse XDB-C18 column (150 mm×2.1 mm, 5.0 μm) at 40℃. Mobile phase consisted of acetonitrile -0.1% formic acid in water (35:65), and the flow rate was 0.22 mL·min-1. The LC effluent was detected and analyzed using an ESI-triple quadrupole tandem mass spectrometer under the multiple reaction monitoring (MRM) in the negative ion mode. The plasma samples were treated with solid phase extraction prior to LC-MS/MS analysis. As a result, all of the four analytes displayed a good linearity over the concentration of 1-1000 ng·mL-1. The RSDs of intra-day and inter-day assays were less than 5.99% and 10.16%, respectively. The relative recovery of each analyte was between 88.1%-101.1% with RSD<7.9% and the absolute recovery was between 72.0%-86.6% (RSD<6.3%). In conclusion, the established method shows good specificity, sensitivity and efficiency for quantifying the four flavonoid glycosides contained in rat plasma.
Key words: LC-MS/MS     Chuankezhi injection     8-isoprenyl flavonoid glycoside     plasma concentration     quantitative analysis    

淫羊藿来源于小檗科 (Beberidaceae) 淫羊藿属 (Epimedium) 多种植物,为常用补肾壮阳中药,其代表性成分为黄酮类化合物。C8位接有异戊烯基是淫羊藿黄酮共同的结构特征,这类黄酮也是淫羊藿的专属性化学成分[1],主要包括淫羊藿苷 (icariin)、朝藿定A、B、C、sagitatoside A、B等,是淫羊藿发挥药理作用的主要效应成分[2, 3, 4, 5, 6]。喘可治注射液由中药淫羊藿和巴戟天配伍组成,具有温肾补阳、止咳平喘之功,主治哮证属肾虚挟痰证,临床上对哮喘和反复性呼吸道感染治疗有效率高,可达到长期缓解或根治的效果,此外在肿瘤的辅助治疗方面也表现出很好的疗效。淫羊藿黄酮也是喘可治注射液的主要效应成分。到目前为止,同时测定血浆中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的LC-MS/MS法及其在喘可治注射液药物动力学研究中的应用尚未见报道。本文运用LC- MS/MS成功建立大鼠血浆中4种淫羊藿黄酮的同时测定方法 (4种黄酮苷及内标物的化学结构见图 1),该方法专属、灵敏、准确,操作简便快速,应用于血浆中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的同时测定以及中药喘可治注射剂的体内药物动力学研究,一方面为客观评价喘可治注射剂的药动学规律提供方法学参考,另一方面也可为喘可治注射剂实际生产中产品的质量控制以及临床合理用药提供科学数据的支持。

Figure 1 Chemical structures of four flavones from epimedii extract and naringin (IS)
材料与方法 材料与仪器

美国AB公司API 3000液质联用仪,配有电喷雾离子源、Analyst 1.4数据采集软件; 美国Agilent公司1100型液相色谱仪; 美国Techne DB-30型样品浓缩仪; Waters 20管型固相萃取仪; 瑞士梅特勒-托利多AB 135-S型电子分析天平 (十万分之一); Branson 8510型超声波清洗仪。

喘可治注射液由广州万正药业有限公司提供; 朝藿定A (批号: 121106、纯度: 98.8%) 和朝藿定B (批号: 121109、纯度: 98.6%) 购自上海融禾医药科 技有限公司,朝藿定C (批号: 111780-200801、纯度: 99.1%)、淫羊藿苷 (批号: 0737-9910、纯度: 98.5%) 及柚皮苷 (批号: 0722-200108、纯度: 99.7%) 均购 自中国食品药品检定研究院; 乙腈为HPLC级,美国Fisher公司; 其他化学试剂均为分析纯,广州化学试剂厂; 超纯水经Milli-Q系统纯化制备。

色谱和质谱条件

色谱柱: Agilent Eclipse XDB- C18 (150 mm× 2.1 mm,5.0 µm)。流动相: 乙腈- 0.1% 甲酸水溶液 (35∶65),等度洗脱3.5 min。进样量: 5 µL; 柱温: 40 ℃; 流速: 0.22 mL·min-1。辅助气化电喷雾离子源 (ESI); 多反应离子监测 (MRM) 负离子检测模式,用于监测离子对分别为: m/z 883.4→ 675.2 (朝藿定A),m/z 853.5→ 645.3 (朝藿定B),m/z 867.4→ 659.4 (朝藿定C),m/z 721.3→ 513.2 (淫羊藿苷),m/z 579.2→ 271.1 (柚皮苷); 加热辅助气: 7.5 L·min-1; 雾化气: 8 L·min-1; 气帘气: 6 L·min-1; 碰撞气: 10 L·min-1; 离子源喷雾电压: -4 kV; 离子源雾化温度: 350 ℃。

对照品及内标储备液的制备

取4种黄酮苷对照品各约5.0 mg,精密称定,分置于5 mL量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,制得对照品储备液。精密量取上述对照品储备液各1.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,混匀,制得混合对照品储备液。取柚皮苷对照品约10.0 mg,精密称定,置于10 mL量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,制得内标储备液。精密量取内标储备液适量,加甲醇溶液稀释至刻度,得到内标工作液 (2 µg·mL-1)。

血浆样品处理

采用Waters固相萃取仪为固相萃取辅助装置,固相萃取小柱 (Agilent C18) 依次采用甲醇和水各1 mL活化与平衡。取血浆样品100 µL,加入内标工作溶液10 µL,混匀,恒速上样,用蒸馏水1 mL淋洗、抽干,弃去洗脱液,然后用甲醇1 mL洗脱,收集洗脱液,35 ℃氮气流吹干。残渣加流动相150 µL,充分溶解,通过0.22 µm微孔滤膜,取续滤液进样5 µL,进行LC-MS/MS测定。

实验动物

18只健康成年雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠,体重 (300 ± 20) g,购于广东省动物实验中心,饲养于室温22~26 ℃,湿度为40%~70%,12 h昼夜更替的动物室内,实验前适应性喂养一周,给药前12 h禁食,全程不禁水。

给药方法及血样采集

实验分为低、中、高3个剂量组,每个剂量组6只动物,给药途径为肌肉注射。中剂量设定为喘可治注射液临床用量 (采用人与动物的体表面积计算法折算后朝藿定A、B、C及淫羊藿苷给药量分别为41、34、334和66 µg·kg-1),中剂量的3倍设为高剂量,中剂量的1/3作为低剂量。于给药前12 h采集空白血,给药后不同时间点 (3 min、6 min、10 min、15 min、25 min、35 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和8 h共13个采血点) 经由大鼠眼底静脉丛采血约350 µL,置肝素钠抗凝处理过的离心管中,3 000 r·min-1离心15 min,分离血浆,置-80 ℃保存待测。

结果 1 RRLC-MS/MS的方法学考察 1.1 质谱和色谱分析

在优化的色谱和质谱条件下,血浆中内源性物质对4种淫羊藿黄酮苷的测定没有干扰。4种淫羊藿黄酮苷的全扫描及子离子扫描见图 2,空白血浆色谱图、空白血浆加各对照品色谱图和药后血浆色谱图如图 3所示。

Figure 2 Full scan (A) and product ion spectra (B) of the four prenylflavonoids and IS. 1: Epimedin A; 2: Epimedin B; 3: Epimedin C; 4: Icariin; 5: IS

Figure 3 Representative extract ion MRM chromatograms of the four prenylflavonoids and IS: (A) blank plasma; (B) blank plasma spiked with the four analytes at 1 ng·mL-1 and IS; (C) plasma sample at 15 min obtained from a rat after intramuscular administration of Chuankezhi injection (1: Epimedin A; 2: Epimedin B; 3: Epimedin C; 4: Icariin; 5: IS)
1.2 线性关系

取4种黄酮对照品储备液适量置于10 mL量瓶中,加入空白血浆,配制成浓度均为1 000 ng·mL-1的混标样品,加入空白血浆逐级稀释,得到1 000、800、300、100、30、10、3和1 ng·mL-1的系列浓度样品液。以血浆中被测物的质量浓度值 (X) 为横坐标,以被测物与内标物的峰面积之比 (Y) 为纵坐标,采用加权最小二乘法 (权重为1/C2) 进行线性回归,线性范围均为1.00~1 000 ng·mL-1,各成分的回归方程、相关系数、检测限 (LOD) 和定量下限 (LOQ) 分别为,朝藿定A: Y = 0.005 33 X + 0.001 49,r2 = 0.997 4; 0.05,0.04 ng·mL-1; 朝藿定B: Y = 0.003 42 X + 0.000 323,r2 = 0.997 5; 0.04,0.04 ng·mL-1; 朝藿定C: Y = 0.004 61 X + 0.002 00,r2 = 0.998 1; 0.05,0.04 ng·mL-1; 淫羊藿苷: Y = 0.006 65 X + 0.001 11,r2 = 0.996 4; 0.1,0.04 ng·mL-1

1.3 精密度和准确度

低、中、高 (3、30、300、800 ng·mL-1) 浓度的质控样品经处理后进样测定,由标准曲线求得各样品的浓度。以日内和日间相对标准差 (RSD) 考察方法精密度及准确度。得各成分的日内精密度RSD < 5.99%,准确度介于96.9%~107.5%; 日间精密度RSD < 10.16%,准确度介于92.3%~105.0%。

1.4 稳定性

血浆样品中4种淫羊藿黄酮苷成分经过3个冷冻-解冻循环、室温放置6 h和-80 ℃保 存30天可保持稳定,制备后的样品室温放置24 h后仍可保持稳定。各成分短期稳定性测定准确度介于88.4%~106.7%,RSD < 12.0%; 桌面稳定性测定准 确度介于88.4%~107.2%,RSD < 8.6%; 长期稳定性测定准确度介于93.0%~112.6%,RSD < 6.1%; 3个冷冻-解冻循环稳定性测定准确度介于88.1%~104.8%,RSD < 7.1%,结果表明样品稳定性完全可以满足测定要求。

1.5 绝对回收率与基质效应

将各浓度血浆质控样品预处理后测定所得峰面积与相同浓度的对照品溶液进样所得峰面积相比,评价基质效应; 将不同浓度血浆质控样品各5份,经生物样品预处理后测得的峰面积与空白血浆经预处理后加入等浓度对照品溶液复溶后进样所得峰面积比较,计算绝对回收率。结果表明,各成分基质效应介于90.7%~104.8%,RSD < 6.9%,相对回收率介于88.1%~101.1%,RSD < 7.5%,绝对回收率介于72.0%~86.6%,RSD < 6.3%。

2 方法应用

用本文建立的方法对18只大鼠肌肉注射高、中、低浓度喘可治注射液后血浆中4种黄酮苷浓度进行测定,同时检测已知浓度的质控样品,样品浓度以当日标准曲线计算。从测得的药时曲线可见,肌肉注射给予喘可治注射液后4种淫羊藿黄酮苷血浆药物浓度迅速升高,在10~15 min左右达峰,随后很快下降,几种化合物的血药浓度除朝藿定C外均维持在较低水平 (图 4)。

Figure 4 Mean plasma concentration vs time profile of the four prenylflavonoids in rats following single intramuscular administration of Chuankezhi injection at three different doses. L,M and H represent low,middle,and high concentration of Chuankezhi injection. The middle concentration of epimedin A,B,C and icariin is 41,34,334 and 66 μg·mL-1,respectively. The low and high concentration respectively correspond to one- third and three times of the middle concentration of compounds. Ⅰ: Epimedin A; Ⅱ: Epimedin B; Ⅲ: Epimedin C; Ⅳ: Icariin. n = 6,x± s
讨论

中草药及其方剂成分复杂,一般的检测技术难以满足给药后血药浓度的测定要求。LC-MS/MS的应用,使检测方法的专属性、灵敏度、分析速度等大大提高。有关朝藿定C、淫羊藿苷及其主要代谢物在血浆中的定量分析方法可见报道[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13],检测方法涵盖液相色谱、毛细管电泳以及液质联用等,但这些已有的研究方法均有其局限性,如较长分析时间、较低灵敏度、较窄线性范围等,到目前为止,血浆中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的同时测定方法尚未见报道。本研究采用LC-MS/MS同时检测血浆中4种淫羊藿黄酮苷的含量,在该分析条件下待测成分与生物基质得到较好的分离,3.5 min内即可完成4个成分的同时测定,线性范围介于1~1 000 ng·mL-1,最低定量限达到1 ng·mL-1,分析效率高,溶剂消耗少,充分体现了该分析方法专属、灵敏、快速的特点。

本研究同时对生物样品预处理方法进行了优化,结果表明采用沉淀蛋白和液液萃取法处理样品干扰较大,且回收率不稳定,本实验采用固相萃取法进行血浆样品前处理,制得的样品干净、基质干扰小、回收率稳定,能够满足LC-MS的测定要求。

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