药学学报  2016, Vol. 51 Issue (4): 631-636   PDF    
豨莶草中两种活性二萜成分在大鼠体内的药动学研究
殷玥1 , 孙莹1, 姜珍2    
1. 长春医学高等专科学校药学系, 吉林长春 130031;
2. 沈阳药科大学药学院, 辽宁沈阳 110016
摘要: 建立了快速灵敏的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定大鼠血浆中两种活性二萜奇任醇和对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸(DHKA)的含量。实验以蛇床子素为内标,血浆样品处理方法为乙酸乙酯作为萃取试剂的液液萃取。采用Waters Symmetry C18柱(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm),以甲醇-5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(80:20)为流动相进行洗脱,流速为0.2 mL·min-1。质谱条件采用电喷雾离子源(ESI),正负离子同时检测,扫描方式为多反应监测扫描模式(MRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z 356.4→321.4(奇任醇)、m/z 335.3→335.3(DHKA)和m/z 245.1→188.9(蛇床子素,内标)。奇任醇和DHKA分别在50.0~25000 ng·mL-1和25.0~12500 ng·mL-1内线性关系良好。两种待测物及内标的提取回收率均大于85%。方法的日内日间精密度RSD均小于13.9%,准确度在-10.7%~10.3%之间。采用SPSS软件(13.0版,社会科学统计软件包)对两种给药形式的药动学参数进行比较。结果表明,奇任醇在大鼠体内的药动学行为具有吸收快、消除快的特点,体内生物利用度低; DHKA在大鼠体内吸收较快,但消除过程相对较慢,体内生物利用度高。与灌胃给予单体相比,灌胃给予豨莶草药材提取物后,大鼠对奇任醇的吸收明显降低,但消除速率有所减慢;大鼠对DHKA的吸收有所降低,但吸收速率显著增加。该方法操作简便、快捷,灵敏度高,适于豨莶草中两种活性二萜成分在大鼠体内的药代动力学研究。
关键词: 豨莶草     药物动力学     液相色谱-串联质谱法     奇任醇     对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸    
Pharmacokinetics study of two active diterpenoids from Herba Siegesbeckiae in rat plasma
YIN Yue1 , SUN Ying1, JIANG Zhen2    
1. College of Pharmacy, Changchun Junior College of Medicine, Changchun 130031, China;
2. College of Pharmacy, Shenyang Pharmacy University, Shenyang 110016, China
Abstract: The study established a LC-MS/MS method for the simultaneous determination of two active diterpenoids:kirenol and ent-16β, 17-dihydroxy-kauran-19-oic acid (DHKA) from Herba Siegesbeckiae in rat plasma using osthole as an internal standard (IS). Plasma sample pretreatment involved a one-step liquid-liquid extraction with ethyl acetate. Chromatographic separation was performed on a Waters Symmetry C18 column (2.1 mm×100 mm, 3.5 μm) with isocratic elution using methanol-5 mmol·L-1 aqueous ammonium acetate (80:20) as mobile phase at a flow rate of 0.2 mL·min-1. The detection was performed on a triple quadrupole tandem mass spectrometer in multiple reaction monitoring (MRM) mode under positive and negative electrospray ionization. Quantification was performed using SRM of the transitions m/z 356.4→321.4 for kirenol, m/z 335.3→335.3 for DHKA, and m/z 245.1→188.9 for the IS, respectively. The calibration curves were linear over the range of 50.0-25000 ng·mL-1 for kirenol, 25.0-12500 ng·mL-1 for DHKA. The extraction recoveries of two analytes and IS were more than 85%. The intra- and inter-day precision (relative standard deviation) values were less than 13.9% and accuracy (relative error) was from -10.7% to 10.3% at four quality control levels. The pharmacokinetic parameters of different medication administration teams were analyzed with SPSS statistics 13.0 software. The validated method was successfully applied to a comparative pharmacokinetic study of the two diterpenoids in rat plasma after intragastric administration of kirenol, DHKA and Herba Siegesbeckiae extract. Kirenol appeared to be both absorbed and eliminated fast in vivo, and DHKA absorbed fast but eliminated slowly in vivo. And there were obvious differences between the pharmacokinetic behaviors after oral administration of Herba Siegesbeckiae extract compared with single substances. Compared with the value after oral administration of kirenol, the extract might inhibit the absorption and postpone the elimination of kirenol in rats after administration of the extract. For DHKA, the absorption rate of DHKA increased rapidly after administration of the extract. This work can provide some experimental basis for the clinical use of Herba Siegesbeckiae. The method is simple, rapid and sensitive, which is suitable for pharmacokinetics study of the two diterpenoids from Herba Siegesbeckiae in rats.
Key words: Herba Siegesbeckiae     pharmacokinetics     LC-MS/MS method     kirenol     ent-16β, 17-dihydroxykauran- 19-oic acid    

豨莶草 (Herba Siegesbeckiae) 为菊科豨莶属植物的全草,《中国药典》 2010年版收载豨莶 (Siegesbeckia orientalis L.)、腺梗豨莶 (Siegesbeckia pubescens Makino) 或毛梗豨莶 (Siegesbeckia glabrescens Makino) 三种植物的地上部位作为中药豨莶草[1]。豨莶草在临床 上主要用于治疗类风湿性关节炎,疗效显著。奇任醇 (kirenol) 和对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸 (ent-16β,17-dihydroxy-kauran-19-oic acid,DHKA) 是从豨莶草中分离得到的两种重要的活性二萜类化合物。药理学研究表明,奇任醇具有显著的抗炎和免疫抑制作用,对胶原诱导性关节炎和自身免疫性关节炎均有疗效[2, 3]。DHKA则具有抗血小板和抗凝活性[4]。另有文献[5]报道,DHKA能够通过激活角化干细胞再生表皮组织,是一种潜在的伤口愈合剂。本文建立了快速、灵敏、专属的LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中奇任醇和DHKA的含量,并且比较了分别灌胃给予大鼠豨莶草提取物和两种二萜单体后,两组分的药代动力学行为的差异,为豨莶草提取物和单体的合理用药提供了重要参考。

材料与方法 仪器

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪 (美国Waters公司),Micromass® Quattro microTM API三重四极杆串联质谱仪 (美国Waters公司),Masslynx 4.1数据采集软件 (美国Waters公司),BS110S型电子天平 (德国Sartorius公司),XW-80A旋涡混合器 (上海精科实业有限公司),TGL-16C型离心机 (上海安亭科学仪器厂),LC-400型离心机 (科大创新股份有限公司),L-119型试管恒温加热仪 (北京来亨科贸有限责任公司),L-128B型试管氮吹浓缩仪 (北京来亨科贸有限责任公司)。

药品和试剂

奇任醇 (自制,纯度> 98%),DHKA (自制,纯度> 98%),蛇床子素 (批号: 110822- 200407; 中国食品药品检定研究院),乙酸乙酯 (山东禹王实业有限公司),甲醇 (色谱纯,美国Tedia公司),醋酸铵、甲酸、 冰醋酸 (色谱纯,美国Dikma公司),二次重蒸水 (实验室自制)。

实验动物

健康Sprague Dawley雄性大鼠18只 (购自沈阳药科大学动物中心,许可证号: SLXK2012- 0001),体重(240± 20) g。

色谱条件

色谱柱: Symmetry C18色谱柱 (100 mm × 2.1 mm ID,3.5 μm; 美国Waters公司); 流动相: 甲醇-5 mmol·L-1醋酸铵水溶液 (80∶20); 柱温: 室温; 流速: 0.2 mL·min-1; 进样量: 5 μL。

质谱条件

离子源: 电喷雾离子源 (ESI); 毛细管电压: 3.0 kV; 离子源温度: 110 ℃; 脱溶剂气 (氮气) 温度: 350 ℃; 流速: 400 L·h-1; 锥孔气流速: 30 L·h-1; 碰撞气 (氩气) 压力: 0.275 Pa; 检测方式为正负离子检测多反应监测模式(MRM)。奇任醇、DHKA和内标蛇床子素的锥孔电压、碰撞诱导解离能及离 子反应见表 1,用于定量分析的离子反应分别为m/z 356.4→321.4 (奇任醇)、m/z 335.3→335.3 (DHKA) 和m/z 245.1→188.9 (蛇床子素,内标)。

Table 1 MS/MS transitions and parameters for the detection of the two analytes and internal standard (osthole). DHKA: ent-16β,17- Dihydroxy-kauran-19-oic acid
溶液的制备

对照品储备液 取奇任醇、DHKA对照品适量,精密称定,分别置25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,得到质量浓度分别为4.98和0.98 mg·mL-1的对照品储备液。精密量取奇任醇储备液5.0 mL和DHKA储备液12.5 mL,置100 mL量瓶中,用甲醇 稀释并定容至刻度,得到质量浓度分别为250和125 µg·mL-1的混合对照品储备液,于4 ℃储存,备用。

系列标准溶液 精密量取混合对照品储备液适量,用甲醇-水 (50∶50) 稀释成奇任醇质量浓度分别为50.0、100、250、1 000、2 500、10 000和25 000 ng·mL- 1,DHKA质量浓度分别25.0、50.0、125、500、1 250、5 000和12 500 ng·mL-1的系列标准溶液,于 4 ℃储存,备用。

内标溶液 取蛇床子素对照品适量,精密称定,置25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配成浓度为1.06 mg·mL-1的储备液,精密量取储备液适量,用甲醇稀释制成浓度为150 ng·mL-1的内标溶液,于4 ℃储存,备用。

灌胃药液的制备

豨莶草提取物灌胃药液的制备 取干燥豨莶草药材粉末100 g,加10倍量甲醇回流提取1次,再加10倍量乙酸乙酯回流提取2次,每次1 h,过滤,合并滤液蒸发至干,残渣用适量0.5% CMC-Na溶液超声溶解,制成豨莶草提取物灌胃药液 (含奇任醇5 mg·mL-1,含DHKA 2 mg·mL-1)。

单体灌胃药液的制备 精密称取奇任醇和DHKA对照品适量,加0.5% CMC-Na溶液超声溶解,分别制成5 mg·mL-1奇任醇溶液,2 mg·mL-1 DHKA的单体灌胃药液。

血浆样品预处理 在10 mL玻璃管中加入内标溶液100 μL,于40 ℃氮气流下吹干,加入大鼠血浆样品100 μL和1% 冰醋酸水溶液100 μL,涡流混合30 s,加入乙酸乙酯3 mL,涡流混合60 s,离心 (3 500 r·min-1) 10 min,取上清液于40 ℃氮气流下吹干,残渣用甲醇-水 (80∶20) 100 μL复溶,取5 μL进样分析。

血浆样品测定 血浆样品按“血浆样品预处理”方法处理,每个分析批制备一条标准曲线,同时制备低、中、高3个浓度的QC样品,每个浓度的QC样品进行双样本分析,并以同批的标准曲线计算各时间点血浆样品及QC样品中待测物的浓度,由QC样品的结果决定当日数据的取舍。

方法学考察

方法的专属性 取大鼠空白血浆100 μL,除不加内标溶液外,按“血浆样品预处理”方法操作,进样分析; 取10 mL玻璃管,加入内标溶液100 μL,加入系列标准溶液100 μL,涡流混合30 s,于40 ℃氮气流下吹干,加入大鼠空白血浆100 μL,制备50.0 ng·mL-1奇任醇和25.0 ng·mL-1 DHKA (LLOQ) 的血浆样品,其他按“血浆样品预处理”方法操作,进样分析; 分别取大鼠灌胃给予豨莶草提取物6和36 h后收集的血浆样品100 μL,按“血浆样品预处理”方法操作,进样分析; 考察专属性。

标准曲线和定量下限 分别取系列标准溶液100 mL,于40 ℃氮气流下吹干,加入大鼠空白血浆100 mL,配制成奇任醇血药浓度分别为50.0、100、250、1 000、2 500、10 000和25 000 ng·mL-1,DHKA血药浓度分别25.0、50.0、125、500、1 250、5 000和12 500 ng·mL-1的血浆样品,按“血浆样品预处理”方法操作,进样分析,建立标准曲线。以待测物浓度 (x) 为横坐标,待测物与内标的峰面积比值 (y) 为纵坐标,采用加权 (1/x2) 最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程即为标准曲线。

精密度与准确度 按“标准曲线和定量下限”项下方法操作,分别制备低、中、高3个浓度 (奇任醇分别为120、2 000和20 000 ng·mL-1,DHKA分别为60.0、1 000和10 000 ng·mL-1) 的质量控制 (QC) 样品,每一浓度进行6样本分析。连续测定3天,并根据当日标准曲线计算QC样品的浓度,与配制浓度对照,求得方法的精密度 (RSD) 和准确度 (RE)。

提取回收率和基质效应 按“标准曲线和定量下限”项下方法操作,分别制备低、中、高3个浓度 (奇任醇分别为120、2 000和20 000 ng·mL-1,DHKA分别为60.0、1 000和10 000 ng·mL-1) 的质量控制 (QC) 样品,每一浓度进行6样本分析,得峰面积A; 另取大鼠空白血浆100 μL,除不加内标外,按“血浆

样品预处理”方法操作,向获得的残渣中加入相应浓度的标准溶液100 μL及内标溶液100 μL,40 ℃氮气流下吹干,再用甲醇-水 (80∶20) 100 μL复溶,得到未经提取的血浆样品溶液,每一浓度6样本分析,得峰面积B。取相应浓度的标准溶液100 μL及内标溶液100 μL,40 ℃氮气流下吹干,用甲醇-水 (80∶20) 100 μL复溶,得到不含血浆基质的样品溶液,每一浓度3样本分析,得峰面积C。提取回收率和基质效应分别以 (A/B×100) % 和(B/C×100) % 表示。

稳定性 分别制备低、高2个浓度 (奇任醇分别为120和20 000 ng·mL-1,DHKA分别为60.0和10 000 ng·mL-1) 的QC样品,每一浓度进行3样本分析,分别考察QC血浆样品经室温放置4 h; 3次冻融循环; -20 ℃放置20天; 预处理后4 ℃下放置12 h的稳定性。按“血浆样品预处理”方法操作,进样分析,求得RSD和RE。

SD大鼠药代动力学实验及统计学分析

健康Sprague Dawley雄性大鼠18只,随机分成3组,每组6只。给药前禁食12 h,自由饮水,分别灌胃给予豨莶草提取物灌胃药液 (剂量相当于奇任醇50 mg·kg-1,DHKA 20 mg·kg-1)、奇任醇单体灌胃药液 (剂量为 50 mg·kg-1) 和DHKA单体灌胃药液 (剂量为20 mg·kg-1)。于给药前 (0 h) 及给药后0.08、0.17、0.25、0.50、0.75、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0和48.0 h经眼球后静脉丛取血0.25 mL,置涂有肝素的离心管中,离心 (12 000 r·min-1) 8 min,分离血浆,于 -20 ℃保存待测。

采用Excel软件进行有关药代动力学参数求算,并求出各参数的平均值和标准差,结果以平均值 ± 标准差 (x± s) 表示。tmaxCmax为实测值; AUC0-t采用梯形法计算; AUC0-∞ = AUC0-t + Ct / ke,ke (末端消除速率常数) 为对数血药浓度-时间曲线末端4个浓度点直线的斜率; 按t1/2 = 0.693/ke求出t1/2。采用SPSS统计分析软件 (13.0版,社会科学统计软件包),对给予大鼠豨莶草提取物和单体后待测物的药动学参数进行检验分析,讨论其在大鼠体内药动学行为的差异。其中Cmax、AUC0-t和AUC0-∞先进行对数转换,然后再进行独立样本t检验分析,tmaxt1/2进行非参数检验 (Mann-Whitney test) 分析[6, 7],当P < 0.05时认为存在显著性差异。

结果 1 质谱分析

采用电喷雾离子源,以正负离子方式进行检测。从一级全扫描质谱图中获得奇任醇、DHKA和内标蛇床子素的准分子离子峰分别为m/z 356.4、m/z 335.3和m/z 245.1,选择性对其进行碰撞诱导解离,得到峰强度较高的二级碎片离子分别为m/z 321.4 (奇任醇)、m/z 335.3 (DHKA) 和m/z 188.9 (蛇床子素,内标),采用MRM扫描方式,以上述离子转化进行定量分析,具有较高的专属性。图 1A为奇任醇的二级全扫描质谱图,图 1B为DHKA二级全扫描质谱图,图 1C为内标蛇床子素二级全扫描质谱图。

Figure 1 Product ion scan spectra and chemical structures of kirenol (A),DHKA (B) and osthole (C)
2 方法学考察 2.1 方法专属性

在本实验所采用的色谱条件下,奇任醇、DHKA和内标的保留时间分别为1.92、2.44和3.09 min,血浆中的内源性物质不干扰待测物和 内标的测定,表明方法的专属性良好。空白血浆色谱图见图 2A,空白血浆加奇任醇及其内标蛇床子素、DHKA及其内标蛇床子素 (LLOQ) 的血浆样品色谱图见图 2B,大鼠灌胃给予豨莶草提取物6 h后血浆样品色谱图见图 2C,大鼠灌胃给予豨莶草提取物36 h后血浆样品色谱图见图 2D

Figure 2 Representative MRM chromatograms of kirenol (1),DHKA (2) and osthole (3) in rat plasma. A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with the two analytes at LLOQ and IS; C: Plasma sample 6 h after oral administration of Herba Siegesbeckiae extract; D: Plasma sample 36 h after oral administration of Herba Siegesbeckiae extract
2.2 线性范围及定量下限

奇任醇和DHKA的回归方程分别为y = 5.68 × 10-4 x - 8.22 × 10-4 (r = 0.992 9) 和y = 2.41 × 10-3 x + 8.50 × 10-3 (r = 0.996 6),线性范围分别为50.0~25 000ng·mL-1和25.0~12 500 ng·mL-1。结果表明,奇任醇和DHKA在各自浓度范围内线性关系良好,测定奇任醇和DHKA的定量下限分别为50.0和25.0 ng·mL-1

2.3 精密度与准确度

奇任醇和DHKA的日内和日间精密度RSD值均不大于13.9%,准确度在-10.7%~10.3% 之内,均符合生物样品分析方法指导原则的有关规定[8]

2.4 提取回收率和基质效应

奇任醇3个浓度血浆样品的提取回收率在87.4%~93.4% 之间,DHKA 3个浓度血浆样品的提取回收率在90.6%~94.8% 之间,内标的提取回收率为 (92.7 ± 9.3) %。待测物与内标的基质效应均在85%~115% 之间,不存在明显的基质效应。

2.5 稳定性

奇任醇和DHKA低、高2个浓度的QC样品处理后经室温放置4 h; 3次冻融循环; -20 ℃放置20天; 预处理后4 ℃下放置12 h。奇任醇RE在 -8.5%~12.3%,DHKA 在 -7.7%~9.9%,RSD均小于11.2%。结果表明,奇任醇和DHKA的血浆样品在以上条件下稳定性良好。

3 药动学的研究

大鼠分别灌胃给予豨莶草提取物和单体后,测得各时间点血浆中奇任醇和DHKA的浓度。求算待测物各时间点血药浓度的平均值和标准差,绘制两组分的平均血药浓度-时间曲线,见图 3。两组分的主要药动学参数及检验结果见表 2

Figure 3 The plasma concentration-time curves of kirenol (A) and DHKA (B) following oral administration of Herba Siegesbeckiae extract and the single substances. n = 6,x± s

Table 2 Main pharmacokinetic parameters of kirenol and DHKA in rats after oral administration of Herba Siegesbeckiae extract and the single substances. n = 6,x± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs Kirenol alone; ΔP < 0.05,ΔΔP < 0.01 vs DHKA alone
讨论

本实验建立了准确、灵敏、快速的LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中奇任醇和DHKA的含量,并将该法成功应用于两种活性二萜单体在大鼠体内的药动学研究。

由于待测的两种二萜极性较小,本实验优先选择液液萃取法作为处理方法,操作简便、成本低,且受内源性物质干扰少。实验考察了不同提取试剂的提取效率。结果表明,使用乙酸乙酯的提取效率最高,奇任醇的提取回收率大于90%,DHKA的提取回收率大于70%。考虑到DHKA结构中含有羧基基团,加入酸化试剂冰醋酸以提高其提取回收率。实验发现,虽然加入冰醋酸后奇任醇的提取回收率略有下降,但DHKA的提取回收率明显增大。同时考察了加入冰醋酸对提取回收率的影响。研究表明,加入1% 冰醋酸时,DHKA酸化较完全,两待测物的提取回收率稳定且均大于85%; 继续增大冰醋酸的浓度时,奇任醇的回收率明显下降。

本实验初期考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水系统,结果表明待测物在甲醇-水系统中的响应明显好于其在乙腈-水系统中,且以80% 的甲醇为最佳。考察了在水中添加甲酸和醋酸铵对分离的影响,发现加入醋酸铵后,奇任醇能够形成稳定的m/z 356.4的前体离子[M+NH4]+和产物离子m/z 321.4,而在其他色谱系统中奇任醇所形成的其他前体离子均未能形成特征碎片离子,因此选择水相中添加醋酸铵以提高奇任醇的选择性。进一步考察了醋酸铵浓度的 影响,当醋酸铵浓度为5 mmol·L-1时,待测物峰形和响应均较好,且添加剂的加入对DHKA的色谱行为及质谱行为几乎无影响,故最终确定流动相系统为甲醇 - 5 mmol·L-1醋酸铵水溶液 (80∶20)。本实验中待测物在等度洗脱条件下能够获得良好的峰形,且等度洗脱能够缩短分析时间,该方法总的分析时间为4 min,适合高通量的体内样品分析。

本实验分别测定了灌胃给予大鼠豨莶草药材提取物和等剂量两种活性二萜单体后的药动学参数。结果表明,奇任醇在大鼠体内吸收迅速,在25 min内血药浓度快速升高达峰后又迅速消除,8 h后在血浆中基本检测不到奇任醇。大鼠灌胃给予豨莶草药材提取物后,与灌胃给予奇任醇单体相比,奇任醇的Cmax、AUC0-t和AUC0-均显著降低,t1/2显著增加。表明灌胃给予豨莶草药材提取物后,大鼠对奇任醇的吸收明显降低,但消除速度有所减慢。

DHKA在大鼠体内的药动学行为具有吸收快和消除慢的特点。与奇任醇比较,该化合物的AUC高,表明其在大鼠体内生物利用度高。大鼠灌胃给予豨 莶草药材提取物后,与灌胃给予DHKA单体相比,DHKA的AUC0-t和AUC0-均明显降低,tmax也显著降低。表明灌胃给予豨莶草药材提取物后,虽然大鼠对DHKA的吸收有所降低,但吸收速率显著增加。

对于待测物在灌胃给予大鼠豨莶草提取物和单体后药动学行为产生差异的原因,推测可能是由于提取物中多种化学成分的相互作用,影响了待测物的药动学行为。作用机制有待进一步研究。

参考文献
[1] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (中华人民共和国药典)[S]. Part 1. 2010 ed. Beijing:China Medical Science Press, 2010.
[2] Wang ZM, Zhu SG, Wu ZW, et al. Kirenol upregulates nuclear Annexin-1 which interacts with NF-κB to attenuate synovial inflammation of collagen-induced arthritis in rats[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 137:774-782.
[3] Lu Y, Xiao J, Wu ZW, et al. Kirenol exerts a potent antiarthritic effect in collagen-induced arthritis by modifying the T cells balance[J]. Phytomedicine, 2012, 19:882-889.
[4] Wang JP, Xu HX, Wu YX, et al. Ent-16β,17-dihydroxykauran-19-oic acid, a kaurane diterpene acid from Siegesbeckia pubescens, presents antiplatelet and antithrombotic effects in rats[J]. Phytomedicine, 2011, 18:873-878.
[5] Sung SH, Park SH, Song SY, et al. Epidermal regeneration by ent-16α,17-dihydroxy-kauran-19-oic acid isolated from Siegesbeckia pubescens[J]. Cell Prolif, 2011, 44:527-536.
[6] Di B, Feng NP, Liu WY. Pharmacokinetic comparisons of Shuang-Huang-Lian with the different combinations of its constitutional herbs[J]. J Ethnopharmacol, 2006, 107:401-405.
[7] Zhao JJ, Han X, Zhao X, et al. A sensitive liquid chromatographic-mass spectrometric method for simultaneous determination of dehydroevodiamine and limonin from Evodia rutaecarpa in rat plasma[J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 401:289-296.
[8] FDA. Guidance for Industry:Bioanalytical Method Validation[S/OL]. 2001-05[2011-11-18]. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf 2001-05.