药学学报  2016, Vol. 51 Issue (4): 606-612   PDF    
12-N-苯磺酰苦参醚衍生物的合成及其抗柯萨奇病毒B3活性研究
程新越, 唐胜, 孔兰英, 李玉环, 宋丹青     
中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050
摘要: 12-N-m-氰基苯磺酰苦参丁甲醚是一个具有良好抗柯萨奇病毒B3(CVB3)活性的全新结构骨架化合物,本研究以其为先导物,共设计合成了15个全新结构的苦参醚衍生物。采用细胞病变效应(CPE)方法评价了其体外抗CVB3活性和细胞毒性。构效关系表明, 11-位碳链长度的缩短不利于活性提高。其中化合物c1显示出良好的抗CVB3活性, IC50值为7.1 μmol·L-1(SI为35.5),与先导物相当。构效关系结果为此类化合物的进一步结构优化提供了有益的信息。
关键词: 苦参醚     槐果碱     柯萨奇病毒B3     构效关系    
Synthesis and biological evaluation of 12-N-benzenesulfonyl matrinic ether derivatives as anti-coxsackievirus B3 agents
CHENG Xin-yue, TANG Sheng, KONG Lan-ying, LI Yu-huan, SONG Dan-qing     
Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: 12-N-m-Cyanobenzenesulfonyl matrinic butyl methyl ether is a potent anti-coxsackievirus B3(CVB3) agent bearing a novel structure skeleton. Taking this compound as a lead, totally 15 novel target compounds have been synthesized and evaluated for the anti-CVB3 activities using CPE method. Structureactivity relationship (SAR) demonstrated that the shorten-length of 11-side chain was not helpful for keeping the good anti-virus activity. Among the newly synthesized compounds, compound c1 displayed a good anti-CVB3 activity with the IC50 of 7.1 μmol·L-1 and SI of 35.5, similar to that of the lead. The SAR results provided useful information for further optimization of these compounds in the molecular structure.
Key words: matrinic ether     sophocarpine     coxsackievirus B3     structure-activity relationship    

柯萨奇病毒 (CV) 属于小RNA病毒科肠道病毒属,是一种重要的致病病原,根据在新生鼠中引起的病理状态的不同分为A、B两族。已报道的CVB血清型包括CVB1~6,其中柯萨奇病毒B3 (CVB3) 感染与45%~60% 的病毒性心肌炎发病有关[1],除引起急、慢性病毒性心肌炎、扩张性心肌病外,也可导致心包炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎[2]等多种疾病。迄今为止,尚未有针对CVB3引起的病毒性心肌炎和肠道病毒感染的药物批准上市。目前临床上主要使用广谱抗病毒药物进行治疗,包括利巴韦林 (RVB)、干扰素[3]和中药制剂[4]。因此,寻找与发现抗CVB3候选物,用于临床CVB3引起的病毒性心肌炎的治疗意义重大。

槐果碱 (1,图 1),一种天然生物碱,其注射液 (又称抗柯注射液) 作为院内制剂,对CVB3引起的病毒性心肌炎显示一定的疗效[5, 6]。本课题组前期以槐

果碱为先导化合物,开展了结构修饰与优化[7, 8],发现12-N-m-氰基苯磺酰苦参丁甲醚 (2,图 1) 在体外显示出良好的抗CVB3活性[9],IC50值8.41 μmol·L-1,SI为39.5。前期构效关系表明,12-位苯环上为强吸电子基团,如CF3、CN等,有利于保留其抗CVB3活性。本文以2为先导物,继续对其11-和12-位取代基进行结构调整,探索11-位醚侧链的长短对活性的影响,由此设计合成了系列苦参丁甲醚、苦参乙甲醚、苦参二乙醚以及苦参乙甲硫醚等衍生物 (合成路线1、2),并对其抗CVB3活性进行了评价。

Figure 1 Structures of sophocarpine (1) and compound 2
结果与讨论 1 化学合成

本研究设计合成的15个目标化合物均未见文献报道。其产率、熔点及波谱数据见表 1,结构及体外抗CVB3活性见表 2

Table 1 Physical properties and spectra data of target compounds. The yield of final step

Table 2 Structure-activity relationship (SAR) of the target compounds against CVB3. RBV: Ribavirin; aCytotoxic concentration required to inhibit Vero cell growth by 50%. bConcentration required to inhibit CVB3 growth by 50%. cSelectivity index: TC50/IC50

使用苯磺酸甲酯对11-位侧链羟基甲醚化,以无水THF为溶剂,升温回流并不能引发反应进行,必须加入NaH活化羟基。同时发现位阻对该反应的进行和产率影响较大,即12-N上取代基的位阻越小、11-位侧链的长度越长,反应越容易进行,产率越高。相同反应条件下24 h,Boc-苦参丁醇 (7) 甲醚化的产率为90%,明显高于Boc-苦参乙醇 (13) 的甲醚化产率50%。并且在合成c1的过程中,无法采用相同路线由13出发,由苯磺酸乙酯生成Boc-苦参二乙醚 (合成路线2),只有将12-N取代替换成位阻较小的p-三氟甲基苯磺酰后,乙醚化才能进行,产率为35%。

2 体外抗CVB3活性研究

苦参丁甲醚 (a1、a2) 和先导物2相比,抗CVB3活性均有下降,表明12-苯环上的间位CN对活性有利。将苦参丁甲醚的11-位侧链缩短为苦参乙甲醚 (b1、b3) 后,活性大为降低甚至消失 (>165.2~95.4 μmol·L-1),提示丁基侧链的缩短不利于活性。当把CN替换为CF3、中等吸电子强度的乙酰基或变为吡啶杂环后,化合物 (b4~b6) 的活性有所升高 (16.6~39.3 μmol·L-1),含吡啶的化合物 (b9) 显示中度活 性,IC50为29.8 μmol·L-1,优于乙酰基 (b7、b8) 取代 (> 475.5 μmol·L-1~>158.5 μmol·L-1)。结果表明苦参乙甲醚12-N-取代苯环上以CF3活性最好。

保留12-N-p-三氟甲基苯磺酰取代,将苦参乙甲醚11-位替换为的苦参乙甲硫醚 (c2) 或改变为苦参二乙醚(c1) 时,活性分别提高至18.6和7.1 μmol·L-1,提示脂溶性增加或许有利于活性的提高。当苦参的11-位侧链连接甲基哌嗪 (d1)、吡咯 (d2) 后,抗CVB3活性完全丧失,提示11-位侧链连接极性基团时活性消失,这与前期的构效关系结果[9]一致。

3 结论

本研究以化合物2为先导物,设计合成了15个全新结构的12-N-取代苦参醚类似物,并测定了其体外抗CVB3活性和细胞毒性。SAR表明,11-位侧链长度缩短不利于活性提高; 连接脂溶性基团有利于活性增加。进一步完善了此类衍生物的抗CVB3构效关系,为此类化合物的进一步结构优化提供了有益的指导,见图 2。其中化合物c1显示出较强的抗CVB3活性,IC50值为7.1 μmol·L-1 (SI为35.5),值得进一步深入研究。

Reagents and conditions: (a) 5 mol·L-1 NaOH,reflux,9 h,10 mol·L-1 HCl,pH = 3-5; (b) MeOH reflux,2 h; (c) Boc2O,K2CO3,CH2Cl2,r.t.,overnight; (d) LiAlH4,THF,r.t.,30 min; (e) THF,PhSO2OCH3,NaH,r.t.,24 h; (f) 2 mol·L-1 HCl/Et2O,3 h; (g) CNPhSO2Cl,TEA,CH2Cl2,r.t.,4 h,flash column chromatography. Scheme 1 Synthetic route of compounds a1-2

Reagents and conditions: (a) KMnO4,10% H2SO4,reflux,5 h; (b) MeOH,SOCl2,reflux,2 h; (c) Boc2O,K2CO3, CH2Cl2,r.t.,2 h,flash column chromatography; (d) LiAlH4,THF,r.t.,30 min; (e) THF,PhSO2OCH3 NaH,r.t.,24 h,flash columnchromatography; (f) THF,PhSO2OC2H5,NaH,r.t.,24 h,flash columnchromatography; (g) 2 mol·L-1 HCl/Et2O,3 h; (h) R1PhSO2Cl, TEA,CH2Cl2,r.t.,4 h; (i) p-CF3PhSO2Cl,K2CO3,CH2Cl2,r.t.,4 h; (j) TsCl,TEA,CH2Cl2,4-DMAP,r.t.,36 h; (k) THF,NaSCH3,65 ℃,5 h,flash column chromatography; (l) -78 ℃,CH2Cl2,DMSO,C2O2Cl2,stir,10 min; compound 17,stir,30 min; TEA,r.t.,30 min; (m) C2H5OH,methylpiperazine or morpholine,reflux,5 h; NaBH4,r.t.,3 h,flash column chromatography. Scheme 2 Synthetic route of compounds b1-9,c1-2 and d1-2

Figure 2 SAR of matrinic ether for anti-CVB3
实验部分

熔点用CXM-300型精密熔点仪测定,温度未校正; 1H NMR和13C NMR用Bruker Avance Ⅲ 400和500核磁共振仪测定 (400/500 Hz),溶剂为DMSO-d6; HR-MS用Autospec Ultima-TOF质谱测定仪测定; Flash柱分离纯化用CombiflashRf 200快速制备液相; 荧光检测用ZF-20D暗箱式紫外分析仪; 薄层色谱 (TLC) 采用E-Merck公司预铺硅胶铝箔卷; 试剂均为分析纯。

1 化合物的合成 1.1 12-N-p-氰基苯磺酰苦参丁甲醚(a1) 的合成

苦参碱 (3,10 g,40 mmol) 加至氢氧化钠 (10 g,250 mmol) 的水溶液 (80 mL) 中,加热回流9 h,室温冷却过夜,析出大量白色固体,过滤,滤饼加入浓盐酸(25 mL),减压浓缩,得粗品苦参丁酸盐酸盐 (4)。其浅黄色固体加入甲醇 (100 mL) 加热回流2 h,TLC检测,反应结束后,减压浓缩,得苦参丁酸甲酯盐酸盐 (5)。置入CH2Cl2 (100 mL) 中,加入K2CO3 (16 g,115 mmol) 和Boc2O (7.0 g,32 mmol),室温搅拌过夜,反应完全后,有机相依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得到Boc-苦参丁酸甲酯 (6)。其黄色油状液体置于无水THF (40 mL) 中,冰浴条件下缓慢加入LiAlH4 (1.2 g,29 mmol),加毕移至室温反应30 min。依次加入丙酮 (6 mL) 30 min、饱和氯化铵溶液 (6 mL) 30 min淬灭反应,过滤,滤液减压浓缩后,加CH2Cl2溶解,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得Boc-苦参丁醇 (7)。

将7 (2 g,5.7 mmol) 溶于无水THF (40 mL) 中,依次加入苯磺酸甲酯 (3 g,17 mmol) 和NaH (0.4 g,17 mmol),室温反应24 h,无水CH3OH淬灭反应,稀盐酸调pH至7~8,减压浓缩,CH2Cl2溶解,有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得Boc-苦参丁甲醚 (8)。该黄色油状液体置于2 mol·L-1 HCl/Et2O (15 mL) 中,室温搅拌3 h,过滤,乙醚冲洗,干燥得白色固体苦参丁甲醚盐酸盐 (9)。取9 (0.4 g,1.2 mmol) 至CH2Cl2 (30 mL) 中,加入p-氰基苯磺酰氯 (0.3 g,1.5 mmol) 和三乙胺 (0.4 g,3.9 mmol),室温搅拌4 h,反应结 束,有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,浓缩,得黄色油状物。加入乙醚溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,过滤,干燥,得白色固体a1。

以9 (0.4 g,1.2 mmol) 和o-氰基苯磺酰氯 (0.3 g,1.5 mmol) 为原料,参照化合物a1制备方法,得白色固体a2。

1.2 12-N-p-氰基苯磺酰苦参乙甲醚 (b1) 的合成

槐果碱 (1,5 g,20 mmol) 加至10% 浓硫酸溶液 (65 mL) 中,冰浴下缓慢加入KMnO4 (12 g,75 mmol),加热回流5 h,冷却至室温加入Na2SO3 (12 g,95 mmol) 搅拌1 h,加入甲醇 (200 mL),过滤,滤液减压浓缩得粗品苦参乙酸 (10)。其褐色固体加入甲醇(100 mL),缓慢滴加SOCl2 (5 mL,69 mmol),加热回流2 h,TLC检测,反应结束后,冰浴条件下加入10 mol·L-1 NaOH溶液(7 mL) ,调pH为7~8,减压浓缩,得苦参乙酸甲酯 (11) 。CH2Cl2溶解,加入K2CO3 (5 g,36 mmol) 和Boc2O (3.5 g,16 mmol) 室温2 h 反应完全,有机相依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,得Boc-苦参乙酸甲酯 (12) 纯品。参照1.1的还原、甲醚化、脱保护操作步骤,得到黄色固体苦参乙甲醚盐酸盐 (15)。以15 (0.4 g,1.3 mmol) 和p-氰基苯磺酰氯 (0.3 g,1.6 mmol) 为原料,参照化合物a1制备方法,得黄色固体b1。

化合物b2~b9以相应的磺酰氯为原料,制备方法与b1相同,其中b4浓缩后即得黄色固体。

1.3 12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参二乙醚(c1) 的合成

将11(4 g,16 mmol) 加入p-三氟甲基苯磺酰氯 (3.9 g,16 mmol),参照1.1的N取代和还原操作步骤,得到12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参乙醇 (17)。其黄色油状液体 (0.4 g,0.9 mmol) 溶于无水THF (20 mL) 中,依次加入苯磺酸乙酯 (0.5 g,2.8 mmol) 和NaH (0.07 g,2.8 mmol),室温反应24 h,无水CH3OH淬灭反应,稀盐酸调pH至7~8,减压浓缩,CH2Cl2溶解,有机相用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,收集产物,加入乙醚溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,过滤,干燥,得黄色固体c1。

1.4 12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参乙甲硫醚(c2) 的合成

将17(1.0 g,2.3 mmol) 置于CH2Cl2 (100 mL) 中溶解,依次加入p-甲基苯磺酰氯 (0.5 g,2.6 mmol)、三乙胺 (0.7 g,6.9 mmol) 及催化量4-DMAP,室温搅拌36 h反应完全,有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得棕色油状12-N-p-三氟甲基磺酰基-5'-O-p-甲苯磺酸苦参乙酯 (18)。取18(0.5 g,0.9 mmol) 置于无水THF (20 mL) 中,加入NaSCH3 (0.6 g,5.1 mmol),65 ℃,5 h后冷却,减压浓缩,CH2Cl2溶解,依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,收集产物,加入CH2Cl2溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,减压浓缩,乙醚浸泡过夜析出,过滤,干燥,得黄色固体c2。

1.5 12-N-p-三氟甲基苯磺酰基-5'-N-甲基哌嗪苦参乙胺 (d1) 的合成

通过斯文氧化反应将17氧化成醛: 将无水CH2Cl2 (100 mL) 置于三口烧瓶中,氮气保护,-78 ℃条件下,依次加入无水DMSO (0.74 mL,10.4 mmol) 和草酰氯 (0.45 mL,5.2 mmol),搅拌10 min后,滴加化合物17(1.5 g,3.5 mmol) 的CH2Cl2溶液,搅拌30 min,加入三乙胺 (2 mL,13.9 mmol),转移至室温,搅拌30 min。加入饱和Na2SO3 (10 mL) 搅拌30 min,分液,留有机相,水相用CH2Cl2萃取,合并有机相, 用饱和氯化铵溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得到棕色固体12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参乙醛 (19)。取19(0.5 g,1.2 mmol) 溶于无水乙醇 (30 mL) 中,分别加入甲基哌嗪 (0.2 g,2.3 mmol),加热回流5 h,降至室温后,加入NaBH4 (0.09 g,2.3 mmol) 搅拌3 h,加水淬灭反应,减压浓缩,氨水调pH为9~10,CH2Cl2萃取,有机相硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,收集产物,浓缩得到黄色固体d1。

以19 (0.5 g,1.2 mmol) 和吗啉 (0.2 g,2.3 mmol) 为原料,参照化合物d1制备方法,得黄色油状液体,乙醚溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,干燥,得黄色固体d2。

2 生物学实验 2.1 抗CVB3细胞水平的活性评价

每孔2.5 × 104个Vero细胞接种于96孔板内,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养16 h后,用100TCID50的CVB3病毒液每孔100 μL感染细胞,吸附1 h后弃去上液,给予相应浓度的受试化合物,并设置阳性药和病毒对照组。继续置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养72 h后,观察各浓度给药孔的细胞病变效应 (CPE) 值,采用Reed & Muench方法计算半数抑制浓度 (IC50)。

2.2 细胞毒性评价

每孔2.5 × 104个Vero细胞接种于96孔板内,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养16 h后,加入用维持液梯度稀释的受试化合物,同时设置细胞对照组,继续置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养72 h后,观察各给药孔的细胞CPE值,采用Reed & Muench方法计算半数致死浓度 (TC50)。

参考文献
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