柯萨奇病毒 (CV) 属于小RNA病毒科肠道病毒属,是一种重要的致病病原,根据在新生鼠中引起的病理状态的不同分为A、B两族。已报道的CVB血清型包括CVB1~6,其中柯萨奇病毒B3 (CVB3) 感染与45%~60% 的病毒性心肌炎发病有关[1],除引起急、慢性病毒性心肌炎、扩张性心肌病外,也可导致心包炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎[2]等多种疾病。迄今为止,尚未有针对CVB3引起的病毒性心肌炎和肠道病毒感染的药物批准上市。目前临床上主要使用广谱抗病毒药物进行治疗,包括利巴韦林 (RVB)、干扰素[3]和中药制剂[4]。因此,寻找与发现抗CVB3候选物,用于临床CVB3引起的病毒性心肌炎的治疗意义重大。
槐果碱 (1,图 1),一种天然生物碱,其注射液 (又称抗柯注射液) 作为院内制剂,对CVB3引起的病毒性心肌炎显示一定的疗效[5, 6]。本课题组前期以槐
果碱为先导化合物,开展了结构修饰与优化[7, 8],发现12-N-m-氰基苯磺酰苦参丁甲醚 (2,图 1) 在体外显示出良好的抗CVB3活性[9],IC50值8.41 μmol·L-1,SI为39.5。前期构效关系表明,12-位苯环上为强吸电子基团,如CF3、CN等,有利于保留其抗CVB3活性。本文以2为先导物,继续对其11-和12-位取代基进行结构调整,探索11-位醚侧链的长短对活性的影响,由此设计合成了系列苦参丁甲醚、苦参乙甲醚、苦参二乙醚以及苦参乙甲硫醚等衍生物 (合成路线1、2),并对其抗CVB3活性进行了评价。
本研究设计合成的15个目标化合物均未见文献报道。其产率、熔点及波谱数据见表 1,结构及体外抗CVB3活性见表 2。
使用苯磺酸甲酯对11-位侧链羟基甲醚化,以无水THF为溶剂,升温回流并不能引发反应进行,必须加入NaH活化羟基。同时发现位阻对该反应的进行和产率影响较大,即12-N上取代基的位阻越小、11-位侧链的长度越长,反应越容易进行,产率越高。相同反应条件下24 h,Boc-苦参丁醇 (7) 甲醚化的产率为90%,明显高于Boc-苦参乙醇 (13) 的甲醚化产率50%。并且在合成c1的过程中,无法采用相同路线由13出发,由苯磺酸乙酯生成Boc-苦参二乙醚 (合成路线2),只有将12-N取代替换成位阻较小的p-三氟甲基苯磺酰后,乙醚化才能进行,产率为35%。
2 体外抗CVB3活性研究苦参丁甲醚 (a1、a2) 和先导物2相比,抗CVB3活性均有下降,表明12-苯环上的间位CN对活性有利。将苦参丁甲醚的11-位侧链缩短为苦参乙甲醚 (b1、b3) 后,活性大为降低甚至消失 (>165.2~95.4 μmol·L-1),提示丁基侧链的缩短不利于活性。当把CN替换为CF3、中等吸电子强度的乙酰基或变为吡啶杂环后,化合物 (b4~b6) 的活性有所升高 (16.6~39.3 μmol·L-1),含吡啶的化合物 (b9) 显示中度活 性,IC50为29.8 μmol·L-1,优于乙酰基 (b7、b8) 取代 (> 475.5 μmol·L-1~>158.5 μmol·L-1)。结果表明苦参乙甲醚12-N-取代苯环上以CF3活性最好。
保留12-N-p-三氟甲基苯磺酰取代,将苦参乙甲醚11-位替换为的苦参乙甲硫醚 (c2) 或改变为苦参二乙醚(c1) 时,活性分别提高至18.6和7.1 μmol·L-1,提示脂溶性增加或许有利于活性的提高。当苦参的11-位侧链连接甲基哌嗪 (d1)、吡咯 (d2) 后,抗CVB3活性完全丧失,提示11-位侧链连接极性基团时活性消失,这与前期的构效关系结果[9]一致。
3 结论本研究以化合物2为先导物,设计合成了15个全新结构的12-N-取代苦参醚类似物,并测定了其体外抗CVB3活性和细胞毒性。SAR表明,11-位侧链长度缩短不利于活性提高; 连接脂溶性基团有利于活性增加。进一步完善了此类衍生物的抗CVB3构效关系,为此类化合物的进一步结构优化提供了有益的指导,见图 2。其中化合物c1显示出较强的抗CVB3活性,IC50值为7.1 μmol·L-1 (SI为35.5),值得进一步深入研究。
熔点用CXM-300型精密熔点仪测定,温度未校正; 1H NMR和13C NMR用Bruker Avance Ⅲ 400和500核磁共振仪测定 (400/500 Hz),溶剂为DMSO-d6; HR-MS用Autospec Ultima-TOF质谱测定仪测定; Flash柱分离纯化用CombiflashRf 200快速制备液相; 荧光检测用ZF-20D暗箱式紫外分析仪; 薄层色谱 (TLC) 采用E-Merck公司预铺硅胶铝箔卷; 试剂均为分析纯。
1 化合物的合成 1.1 12-N-p-氰基苯磺酰苦参丁甲醚(a1) 的合成苦参碱 (3,10 g,40 mmol) 加至氢氧化钠 (10 g,250 mmol) 的水溶液 (80 mL) 中,加热回流9 h,室温冷却过夜,析出大量白色固体,过滤,滤饼加入浓盐酸(25 mL),减压浓缩,得粗品苦参丁酸盐酸盐 (4)。其浅黄色固体加入甲醇 (100 mL) 加热回流2 h,TLC检测,反应结束后,减压浓缩,得苦参丁酸甲酯盐酸盐 (5)。置入CH2Cl2 (100 mL) 中,加入K2CO3 (16 g,115 mmol) 和Boc2O (7.0 g,32 mmol),室温搅拌过夜,反应完全后,有机相依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得到Boc-苦参丁酸甲酯 (6)。其黄色油状液体置于无水THF (40 mL) 中,冰浴条件下缓慢加入LiAlH4 (1.2 g,29 mmol),加毕移至室温反应30 min。依次加入丙酮 (6 mL) 30 min、饱和氯化铵溶液 (6 mL) 30 min淬灭反应,过滤,滤液减压浓缩后,加CH2Cl2溶解,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得Boc-苦参丁醇 (7)。
将7 (2 g,5.7 mmol) 溶于无水THF (40 mL) 中,依次加入苯磺酸甲酯 (3 g,17 mmol) 和NaH (0.4 g,17 mmol),室温反应24 h,无水CH3OH淬灭反应,稀盐酸调pH至7~8,减压浓缩,CH2Cl2溶解,有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得Boc-苦参丁甲醚 (8)。该黄色油状液体置于2 mol·L-1 HCl/Et2O (15 mL) 中,室温搅拌3 h,过滤,乙醚冲洗,干燥得白色固体苦参丁甲醚盐酸盐 (9)。取9 (0.4 g,1.2 mmol) 至CH2Cl2 (30 mL) 中,加入p-氰基苯磺酰氯 (0.3 g,1.5 mmol) 和三乙胺 (0.4 g,3.9 mmol),室温搅拌4 h,反应结 束,有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,浓缩,得黄色油状物。加入乙醚溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,过滤,干燥,得白色固体a1。
以9 (0.4 g,1.2 mmol) 和o-氰基苯磺酰氯 (0.3 g,1.5 mmol) 为原料,参照化合物a1制备方法,得白色固体a2。
1.2 12-N-p-氰基苯磺酰苦参乙甲醚 (b1) 的合成槐果碱 (1,5 g,20 mmol) 加至10% 浓硫酸溶液 (65 mL) 中,冰浴下缓慢加入KMnO4 (12 g,75 mmol),加热回流5 h,冷却至室温加入Na2SO3 (12 g,95 mmol) 搅拌1 h,加入甲醇 (200 mL),过滤,滤液减压浓缩得粗品苦参乙酸 (10)。其褐色固体加入甲醇(100 mL),缓慢滴加SOCl2 (5 mL,69 mmol),加热回流2 h,TLC检测,反应结束后,冰浴条件下加入10 mol·L-1 NaOH溶液(7 mL) ,调pH为7~8,减压浓缩,得苦参乙酸甲酯 (11) 。CH2Cl2溶解,加入K2CO3 (5 g,36 mmol) 和Boc2O (3.5 g,16 mmol) 室温2 h 反应完全,有机相依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,得Boc-苦参乙酸甲酯 (12) 纯品。参照1.1的还原、甲醚化、脱保护操作步骤,得到黄色固体苦参乙甲醚盐酸盐 (15)。以15 (0.4 g,1.3 mmol) 和p-氰基苯磺酰氯 (0.3 g,1.6 mmol) 为原料,参照化合物a1制备方法,得黄色固体b1。
化合物b2~b9以相应的磺酰氯为原料,制备方法与b1相同,其中b4浓缩后即得黄色固体。
1.3 12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参二乙醚(c1) 的合成将11(4 g,16 mmol) 加入p-三氟甲基苯磺酰氯 (3.9 g,16 mmol),参照1.1的N取代和还原操作步骤,得到12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参乙醇 (17)。其黄色油状液体 (0.4 g,0.9 mmol) 溶于无水THF (20 mL) 中,依次加入苯磺酸乙酯 (0.5 g,2.8 mmol) 和NaH (0.07 g,2.8 mmol),室温反应24 h,无水CH3OH淬灭反应,稀盐酸调pH至7~8,减压浓缩,CH2Cl2溶解,有机相用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,收集产物,加入乙醚溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,过滤,干燥,得黄色固体c1。
1.4 12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参乙甲硫醚(c2) 的合成将17(1.0 g,2.3 mmol) 置于CH2Cl2 (100 mL) 中溶解,依次加入p-甲基苯磺酰氯 (0.5 g,2.6 mmol)、三乙胺 (0.7 g,6.9 mmol) 及催化量4-DMAP,室温搅拌36 h反应完全,有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得棕色油状12-N-p-三氟甲基磺酰基-5'-O-p-甲苯磺酸苦参乙酯 (18)。取18(0.5 g,0.9 mmol) 置于无水THF (20 mL) 中,加入NaSCH3 (0.6 g,5.1 mmol),65 ℃,5 h后冷却,减压浓缩,CH2Cl2溶解,依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,收集产物,加入CH2Cl2溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,减压浓缩,乙醚浸泡过夜析出,过滤,干燥,得黄色固体c2。
1.5 12-N-p-三氟甲基苯磺酰基-5'-N-甲基哌嗪苦参乙胺 (d1) 的合成通过斯文氧化反应将17氧化成醛: 将无水CH2Cl2 (100 mL) 置于三口烧瓶中,氮气保护,-78 ℃条件下,依次加入无水DMSO (0.74 mL,10.4 mmol) 和草酰氯 (0.45 mL,5.2 mmol),搅拌10 min后,滴加化合物17(1.5 g,3.5 mmol) 的CH2Cl2溶液,搅拌30 min,加入三乙胺 (2 mL,13.9 mmol),转移至室温,搅拌30 min。加入饱和Na2SO3 (10 mL) 搅拌30 min,分液,留有机相,水相用CH2Cl2萃取,合并有机相, 用饱和氯化铵溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩,得到棕色固体12-N-p-三氟甲基苯磺酰苦参乙醛 (19)。取19(0.5 g,1.2 mmol) 溶于无水乙醇 (30 mL) 中,分别加入甲基哌嗪 (0.2 g,2.3 mmol),加热回流5 h,降至室温后,加入NaBH4 (0.09 g,2.3 mmol) 搅拌3 h,加水淬灭反应,减压浓缩,氨水调pH为9~10,CH2Cl2萃取,有机相硅胶拌样,以CH2Cl2和MeOH为流动相Flash柱色谱纯化,收集产物,浓缩得到黄色固体d1。
以19 (0.5 g,1.2 mmol) 和吗啉 (0.2 g,2.3 mmol) 为原料,参照化合物d1制备方法,得黄色油状液体,乙醚溶解,2 mol·L-1 HCl/Et2O成盐,干燥,得黄色固体d2。
2 生物学实验 2.1 抗CVB3细胞水平的活性评价每孔2.5 × 104个Vero细胞接种于96孔板内,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养16 h后,用100TCID50的CVB3病毒液每孔100 μL感染细胞,吸附1 h后弃去上液,给予相应浓度的受试化合物,并设置阳性药和病毒对照组。继续置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养72 h后,观察各浓度给药孔的细胞病变效应 (CPE) 值,采用Reed & Muench方法计算半数抑制浓度 (IC50)。
2.2 细胞毒性评价每孔2.5 × 104个Vero细胞接种于96孔板内,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养16 h后,加入用维持液梯度稀释的受试化合物,同时设置细胞对照组,继续置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养72 h后,观察各给药孔的细胞CPE值,采用Reed & Muench方法计算半数致死浓度 (TC50)。
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