2. 开封大学医学部, 河南开封 475001
2. Medical College of Kaifeng University, Kaifeng 475001, China
酗酒和酒精成瘾已经成为社会稳定和身体健康的重要影响因素之一,长期酗酒会导致神经异常和其他器官的功能改变,甚至危及生命[1, 2]。大量酗酒者出现局部脑损伤和认知功能障碍的迹象,造成沉重的社会和经济问题。人们对于长期酗酒对中枢神经的影响的认识有明显差异,比如: 中毒、成瘾与戒断、脑外伤、中枢神经系统感染、低血糖、肝衰竭和胼胝体变性等。此外,过量乙醇可能直接导致持久性痴呆[3]。
长期酒精暴露对大脑皮质的结构和功能的影响主要集中在神经细胞的凋亡[4, 5, 6]、神经细胞的减少 等[7, 8, 9, 10]方面。由于神经细胞的树突棘和它作为突触后成分所参与形成的突触在学习记忆中具有非常重要的作用,因此神经细胞树突棘及突触的数量、形态 的改变已经成为当前酒精毒理研究的热点。长期酒 精暴露对突触的数量和结构的影响以及酒精对树突棘的影响,意见不一[11, 12, 13]; 大部分学者认为长期酒精暴露可导致树突棘数目减少,少数学者认为长期酒精暴露可导致树突棘数目增加或者没有影响[14, 15, 16, 17, 18, 19]。之所以出现不同的结论,其中最主要的原因是方法的差异。大多数研究者观察树突棘时采用Golgi染 色法,其过程比较繁琐而且神经元染色数量不恒定,这样所观察到的结果会出现较大差异。为了规避以 上的缺点,本研究采用更稳定、标记效果更好的DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethy lindocarbocyanine perchlorate) 散射的方法来标记树突棘。
因此,本文利用新的技术方法拟就长期酒精暴露 (酗酒) 对中枢神经系统的影响以及是否存在安全剂量。
材料与方法 实验动物和标本收集选用两个月左右健康成年C57BL/6J小鼠90只(由河南省实验中心提供,SYXK [豫] 2005-0010),雌雄不计,体重25~30 g,动物室的室温20~25 ℃,相对湿度: 60%~70%,定期室内消毒。自然采光,自由进食、进水 (饲料由河南省实验动物中心统一配送,饮用水为自制纯净水)。
将90只小鼠随机分为对照组 (control,C)、酒精低剂量组 (low dosage,L) 和酒精高剂量组 (high dosage,H),各30只。各组小鼠每日早晨8∶00禁食、禁水4 h。酒精暴露组采用25% 酒精灌胃 (酒精低剂量组: 酒精剂量2.0 g·kg-1·d-1; 酒精高剂量组: 酒精剂量4.0 g·kg-1·d-1),对照组每日胃饲纯净水灌胃 4.0 g·kg-1[20],持续灌胃90天后成功建立动物模型。收集各组小鼠脑标本,多聚甲醛固定液中保存备用,必要时可选择石蜡包埋。
免疫组织化学染色免疫组织化学染色方法的优势是具有很好的专一性、灵敏性并且简单快捷、成本相对低廉,因此应用非常广泛。为了显示长期酒精暴露对中枢神经系统中的神经细胞和神经干细胞的影响,作者应用: ① 神经元核抗原 (neuronal nuclei,NeuN),观察长期酒精暴露后大脑皮质中已经发育分化成熟的神经元数量变化; ② 突触素 (synaptophysin,SYP),以此来推测长期酒精暴露后大脑皮质中神经细胞之间的信息传递桥梁——突触的数量变化; ③ 即刻早期基因 (c-Fos),观察长期酒精暴露后海马齿状回门区部位神经细胞损伤的重要标志蛋白c-Fos表达的变化。其具体流程如下: 冠状位振荡切,片厚80 µm,选择形态完整的脑片经0.1 mol·L-1 PB (phosphate buffer) 漂洗3次,封闭液孵育30 min。漂洗3次,加一抗,于4 ℃冰箱中孵育24 h。第二天再经PB漂洗后,加相应的二抗,室温避光孵育3 h。再经PB漂洗,终止抗原抗体反应后,甘油封片,激光共聚焦显微镜进行连续扫描拍片。
DiI散射标记长期酒精暴露前后大脑皮质神经细胞树突棘的变化参照文献[19, 21],利用DiI散射标记大脑皮质神经细胞树突棘。先将需要标记的脑片移入6孔培养板中央,每孔4~5片,吸掉培养孔中的PB液。将事先制备好的干燥冻存的弹头 (DiI染料均匀涂于金颗粒表面) 按一定序号放置于基因枪内,在150~180 Psi压力的氦气驱动下,将弹头中附着有DiI染料的金颗粒散射到脑片上,通过扩散作用,使细胞膜被DiI均匀地染成红色。散射后可在倒置荧光显微镜下进行检查,若金颗粒密度太低,可以再补射1~2次; 如果金颗粒密度太高,可以把原弹头进行切割,重新选择脑片进行散射,直至效果满意为止。散射后的脑片用0.1 mol·L-1 PB漂洗3次,把脑片表面附着的DiI染料尽量地清洗掉,染色效果会更佳。最后将PB中的脑片置于4 ℃冰箱内孵育24 h,以使DiI可以完全扩散于细胞膜表面。
利用BrdU标记长期酒精暴露对神经干细胞增殖的影响成年小鼠神经干细胞主要位于海马齿状回颗粒下层和室管膜下区。作者利用BrdU来标记 该区增殖的神经干细胞。具体实验步骤如下: 秤取 1 mg BrdU粉末溶于生理盐水1 mL中 (需充分震荡混匀,现用现配)。抽取新的BrdU溶液进行小鼠腹腔注射 (25 mg·kg-1),12 h后重复注射一次。注射后第 2日,常规取脑固定。冠状位震荡切片,片厚80 μm。2 mol·L-1盐酸裂解,然后用硼酸缓冲液及PB液分别漂洗3次。加入BrdU鼠单克隆抗体,4 ℃冰箱孵育 24 h。第二天,用PB漂洗后,加入Alexa 488驴抗小鼠IgG (1∶300,Invitrogen公司,A21202),室温孵育 3 h,0.1 mol·L-1 PB漂洗后,65% 甘油封片。利用激光共聚焦显微镜连续扫描拍片。
Western blot检测细胞内的c-Fos蛋白含量利用Western blot对各组小鼠大脑中c-Fos蛋白进行半定量分析,具体操作如下: 颈椎脱位处死小鼠,开颅取脑,迅速取出大脑并去除嗅球与小脑,提取蛋白。采用BCA法进行蛋白浓度测定并定量,各组样品取蛋白10 μL (蛋白8 μL,5×上样缓冲液2 μL) 上样进 行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移蛋白至PVDF膜上,5% 脱脂奶粉室温封闭2 h,加入一抗 (c-Fos兔多抗,1∶1 000,Abcam公司,AB7693) 4 ℃冰箱孵育 过夜,TBST漂洗3次后加入HRP标记的二抗 (驴抗兔IgG ,1∶2 000) 室温孵育2 h,TBST再漂洗3次; ECL发光液孵育1 min,胶片曝光显影定影,结果用ImageJ分析,并以β-actin (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,AC001-R) 做内参,分析其相对表达值。
统计学处理利用ImageJ图像处理软件,选择大脑皮质部位测量成熟神经细胞和其树突棘的密度,以及突触素和即刻早期基因的表达; 选择海马齿状回部位测量增殖神经干细胞BrdU的表达。具体操 作如下: ① 突触素和BrdU的测量: 每个小鼠大脑标本选择5张脑片,再从每张脑片中挑选具有代表性的5个部位,计数选定部位单位面积的阳性细胞数。② 树突棘密度的测量: 选择大脑皮质神经细胞侧树突上的树突棘作为测量的部位。测量时从靠近胞体的 第一个树突棘算起由近及远进行,尽可能地消除由于选择开始测量的位置的不同所引起的差异。树突 棘密度 = 树突棘的数量 / 所测树突全长。
测量结果以均数 ± 标准差 (x± s) 表示,SPSS11.0软件进行统计学分析,均数比较采用单因素方差分析,以P < 0.05为有显著性差异。
结果 1 长期酒精暴露后大脑皮质神经细胞密度降低NeuN是一种表达在中枢神经系统成熟神经细胞核中的特异性核蛋白。作者选择NeuN作为观察长期酒精暴露对中枢神经系统成熟神经细胞影响的判断指标,观察结果如下: 大脑皮质部位NeuN阳性细胞均匀排列,长期酒精暴露后,与对照组相比,NeuN阳性细胞密度明显降低 (图 1a~c),且酒精高剂量组较酒精低剂量组变化更明显 (P < 0.05)。
大脑皮质大多数神经元细胞的树突表面有丰富的树突棘,它参与构成神经细胞之间的信息传递的基本结构——突触后成分。因此,神经细胞树突棘的密度能够间接反映出神经细胞之间形成的信息传递结构——突触数量的多少。本实验利用DiI散射标记大脑皮质神经细胞侧树突的树突棘。长期酒精暴露 后,大脑皮质神经细胞侧树突的树突棘密度较对照组明显降低,但酒精高、低剂量组之间差异不显著 (图 2)。
突触是神经细胞之间形成的信息传递的特化结构,突触素是表达于突触前成分内突触小泡上的跨膜蛋白,突触素的密度可间接反映突触数量的多少,从而可以推测神经细胞之间信息传递的状况。长期酒精暴露后突触素阳性斑点较对照组明显减少,但酒精高、低剂量组之间差异不显著 (图 3)。
本研究利用BrdU[22]标记增殖的神经干细胞,观察长期酒精暴露后海马齿状回颗粒下层神经干细胞的增殖情况。长期酒精暴露后,海马齿状回颗粒下层增殖的神经干细胞数量较对照组明显减少。酒精高、低剂量组之间差异不明显 (图 4)。
细胞凋亡普遍存在于生物界,既发生于生理状态下,也发生于病理状态下。长期酒精暴露对中枢神经系统中的神经细胞的凋亡也产生明显影响,以小鼠海马齿状回门区部位为例,与对照组比较,长期酒精暴露后caspase 8表达阳性细胞数明显增多,但酒精高剂量组与酒精低剂量组之间差异不明显 (图 5a~c)。图 5d为NeuN与caspase 8双标,提示凋亡细胞即为神经细胞。
神经系统中的c-Fos,正常情况下表达水平较低,其生理状态下的主要功能是参与细胞的生长、迁移和分化等过程。在神经系统受损情况下,与神经细胞的继发性损害有关,可出现一定程度的表达升高。作者的观察结果与以上结论相似,即: 长期酒精暴露后海马齿状回门区c-Fos的表达较对照组明显增加,但酒精高、低剂量组之间差异不显著 (图 6a~c)。图 6e显示长期酒精暴露后,c-Fos蛋白表达明显增加。
乙醇能影响许多神经递质系统,可抑制兴奋性谷氨酸受体和促进抑制性GABA (γ-aminobutyrate) 受体[23]。谷氨酸受体上调以及GABA受体下调会导致震颤、幻觉 (视觉、听觉、触觉)、癫痫或震颤性谵妄,伴随严重的注意力受限、警觉性不稳定、躁乱和情绪不稳定[24]。反复的酒精滥用和戒断不仅造成戒断早期症状,而且会造成谷氨酸诱导的兴奋性毒性和永久性神经损伤,进而导致更持久的神经疾病,包括老年痴呆症[25]。本研究结果表明,长期酒精暴露可导致神经细胞的树突棘和细胞之间信息传递结构——突触密度降低。树突棘是神经细胞之间形成突触联系的主要部位,树突棘及其形成的突触广泛参与神经细胞之间的信息传递,在中枢神经系统信息传递过程中具有至关重要的作用。长期酒精暴露后树突棘及其形成的突触密度降低,但这些改变并不具有剂量依赖性,提示本实验结果不支持轻至中度的酒精暴露对神经系统具有保护作用的观点,无论是低剂量还是高剂量酒精暴露对神经系统的影响都是负面的。树突棘发育趋势是从早期长的树突棘向晚期短的树突棘过渡,从稀疏向稠密过渡[26]。树突棘数量减少,它所参与形成的突触数量也就相应减少,通过对酒精暴露前后突触素密度改变的研究,从另一个角度印证了酒精暴露可明显降低神经系统中突触的密度(突触素主要标记突触前成分中突触小泡,其密度变化可以间接反映突触数量的变化)。在突触正常发育过程中突触前成分中的突触小泡的增多标志着突触的成熟[27],因此突触小泡数量减少会导致由其所携带的并最终释放到突触间隙的神经递质也相应减少,直接影响神经细胞之间信息传递功能,会使神经细胞之间信息传递明显减弱。因此,长期酒精暴露可诱导神经细胞发育及神经细胞之间信息传递的延迟。
神经元核抗原是一种表达在成熟神经细胞胞核中的特异性核蛋白。本研究显示,长期酒精暴露组NeuN所标记的成熟神经元的数量明显减少。此结果提示在中枢神经系统中,一方面通过细胞凋亡清除机体生长发育过程中异位细胞或退化细胞; 另一方面通过神经干细胞的不断增殖、迁移补充缺失的神经细胞,从而维持生物体的基本形态,对组织和器官的塑形具有重要意义。由于长期酒精暴露的刺激使得中枢神经系统中的神经细胞凋亡数量明显增加,同时海马齿状回颗粒细胞下层神经干细胞的增殖也受到明显的抑制。神经细胞凋亡数量的增加和神经干细胞增殖数量的减少这两方面因素相互叠加,可能共同导致长期酒精暴露后中枢神经系统中的成熟神经细胞密度的降低,从而出现中枢神经系统的功能障碍,甚至威胁人们的生命。
神经系统中的c-Fos,在生理状态下参与细胞的发育、信息传递等过程[28]。脑损伤后c-Fos表达明显增强,提示其与神经细胞的继发性损害有关。本研究观察到对照组中c-Fos表达水平很低,长期酒精暴露刺激下c-Fos表达水平明显升高。因此认为c-Fos的表达水平升高可能是对中枢神经系统损伤刺激的一种反应,神经细胞对损伤的这种应激反应有可能干预了细胞核的修复功能,并且在神经细胞凋亡的信号转导和caspase激活等过程中发挥了一定作用,从而促进细胞凋亡,进一步导致了继发性损害过程的发生。
综上所述,通过长期酒精暴露动物模型的建立,免疫荧光和DiI散射等染色方法的应用,对于长期酒精暴露对中枢神经系统的改变进行了较为详细的研究,得出长期酒精暴露能够导致大脑皮质神经细胞树突棘的数量减少和突触超微结构的改变,以及抑制神经干细胞的增殖和促进细胞的凋亡等结论。提示长期酒精暴露会导致神经细胞发育及神经细胞之间信息传递的延迟,可能是导致患者精神发育迟滞、智力低下的主要原因之一。
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