药学学报  2016, Vol. 51 Issue (3): 450-454   PDF    
HPLC-MS/MS法测定人血浆中反式阿魏酸
李晓冰1, 石富国2, 何晓静1, 菅凌燕1 , 丁黎2     
1. 中国医科大学附属盛京医院药学部, 辽宁沈阳 110004;
2. 中国药科大学药物分析教研室, 江苏南京 210009
摘要: 建立灵敏、快速的反式阿魏酸(trans-FA)血浆浓度的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法,研究反式阿魏酸在健康中国受试者体内的药动学特征。血浆样品经乙酸乙酯液-液萃取,采用HederaODS-2色谱柱分离,流动相为甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵水溶液(含0.05%乙酸) (34:66),流速为0.4 mL·min-1;质谱采用Turbo-Ionspray电喷雾离子源和负离子多反应监测方式。反式阿魏酸在0.1~5 ng·mL-1内线性关系良好(r≥0.9992);方法的日间和日内精密度均小于9.2%,准确度为95.4%~111.4%;无基质效应,无残留效应;稳定性良好。所建立的HPLC-MS/MS分析方法快速、灵敏、准确、专属性强、重现性高,适用于健康中国受试者体内反式阿魏酸的药代动力学研究。
关键词: 反式阿魏酸     光化学稳定性     高效液相色谱?串联质谱     人血浆     药代动力学    
An HPLC-MS/MS method for the determination of trans-ferulic acid in human plasma
LI Xiao-bing1, SHI Fu-guo2, HE Xiao-jing1, JIAN Ling-yan1, DING Li2    
1. Department of Pharmacy, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China;
2. Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China
Abstract: In this study, we developed a sensitive and rapid HPLC-MS/MS method for the determination of trans-ferulic acid (trans-FA) in plasma samples, and investigated the pharmacokinetics characteristics in healthy volunteers. The plasma samples were extracted with acetic ether, and then separated on a Hedera ODS-2 column with a mobile phase of methanol and 5 mmol·L-1 ammonium acetate buffer solution containing 0.05% acetic acid (34:66) at a flow rate of 0.4 mL·min-1. Electrospray ionization source was applied and operated in the positive ion mode using MRM. The method exhibited a good linearity over the concentration range of 0.1-5 ng·mL-1 (r ≥ 0.9992). The values on both the occasions (intra-and inter-day) were all within 9.2%, and the accuracy was 95.4%-111.4%. No matrix effect and carry-over effect were observed. Trans-FA was stable in human plasma under different storage conditions. The developed HPLC-MS/MS method is rapid, sensitive, accurate, and reproducible, and suitable for the pharmacokinetic study of trans-FA in healthy Chinese volunteers.
Key words: trans-ferulic acid     photochemical stability     HPLC-MS/MS     human plasma     pharmacokinetics    

活血通络粉针是用于治疗缺血性脑卒中之急性期瘀血阻络证的复方中药制剂,该制剂由“桃红四物汤”简化成桃仁、赤芍、川芎组成,已经获得了国家食品药品监督管理总局的新药临床研究批件(批件号: 2004L01097)。阿魏酸 (ferulic acid,FA,图 1) 作为川芎的主要活性成分具有抑制血小板聚集、阻止静脉旁路血栓形成、抗动脉粥样硬化、清除自由基、增强免疫功能等多方面的药理活性[1, 2, 3, 4]

Figure 1 Chemical structures of cis-ferulic acid (cis-FA) and trans-ferulic acid (trans-FA)

FA不仅是川芎等中药的有效成分,还是植物细胞壁中的一种功能性酚酸类成分,普遍存在于谷物、坚果、茄子等[5,6]。FA的定量分析集中于成分分析[7,8],体内分析多运用质谱法研究[9,10],但分析测定过程中大多并未考虑FA的光不稳定性及食源性问题,致使样品降解或空白样品存在干扰,造成定量方法专属性差、准确度和灵敏度低。

本文以活血通络粉针为研究对象,首次建立了测定人血浆中trans-FA的HPLC-MS/MS方法,并将之应用于活血通络粉针剂的药代动力学研究,为活血通络粉针的临床合理应用提供理论和实验依据。

材料与方法 仪器

API4000质谱仪 (美国应用生物系统公司) 配有Turbo-Ionspray电喷雾离子源及Analyst Software (1.5.2) 数据采集软件; 美国Agilent 1260高效液相色谱系统 (G1312B四元泵,G4225A真空脱气机,G1367E自动进样器,G1330B柱温箱)。

药品与试剂

反式阿魏酸对照品 (trans-FA,中国食品药品检定研究院,批号: 110773-201012,含 量: 99.6%); 氢氯噻嗪对照品 (内标IS,中国食品药品检定研究院,批号: 100309-201103,含量: 99.8%); 活血通络粉针 (江苏康缘药业有限公司,产品批号: 120802,规格: 3 g/瓶,其中阿魏酸含量为0.2 mg; 6 g/瓶,其中阿魏酸含量为0.4 mg); 甲醇 (色谱纯,德国Merck公司)。

色谱条件

色谱柱: Hedera ODS-2色谱柱 (150 mm × 2.1 mm,5 μm,江苏汉邦科技有限公司); 预柱: C18保护柱 (4.0 mm × 2.0 mm,5 μm,美国Phenomenex公司); 流动相: 甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵水溶液 (含0.05% 乙酸) (34∶66); 流速: 0.4 mL·min-1; 柱温: 38 ℃; 进样量: 10 μL。

质谱条件

离子检测方式为多反应监测 (MRM); 离子化方式为气动辅助电喷雾离子化 (ESI); 碰撞气 (CAD): 9 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 气帘气 (CUR): 20 psi; 雾化气 (GS1): 70 psi; 辅助加热气 (GS2): 70 psi; 去簇电压 (DP): -30 V; 入口电势 (EP): -11 V; 碰撞能量 (CE): -21 V; 碰撞池出口电势 (CXP): -7 V; 辅助加热温度为500 ℃; 用于定量分析监测离子对: trans-FA,[M-H]-,m/z 193.0→133.8; IS,[M-H]-,m/z 296.0→205.0。

对照品溶液的配制

精密称取trans-FA对照品适量,置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得1 mg·mL-1 trans-FA储备液。精密量取该储备液适量,加入甲醇稀释分别配制成10 000、500、250、200、175、125、75、50、40、20、15和5 ng·mL-1trans-FA甲醇对照品溶液。trans-FA对照品溶液的配制全程避光进行,所有对照品溶液置于-20 ℃中保存待用。

IS对照品溶液的配制

用甲醇配制得1 mg·mL-1 IS储备液。加入甲醇逐级稀释得1 µg·mL-1 IS对照品溶液,所有对照品溶液置于-20 ℃保存待用。

血浆样品的预处理

于10 mL玻璃离心管中精密加入血浆样品1 mL,精密加入IS溶液 (1 µg·mL-1) 20 µL,涡旋混匀,加入1 mol·L-1盐酸溶液100 µL酸化,涡旋1 min,加入乙酸乙酯提取溶剂4 mL,涡旋 5 min后,于4 000 r·min-1离心10 min。取上层有机相于另一干净离心管中,40 ℃水浴中以氮气流吹干。分析前用流动相溶液150 µL复溶样品,涡旋3 min,于15 600 r·min-1离心5 min,吸取上清液转移至棕色自动进样器样品瓶中,进样量10 µL,进行HPLC- MS/MS分析,血浆样品的预处理全程避光进行。

光化学稳定性研究

在避光条件下,配制浓度为1 μg·mL-1 trans-FA甲醇溶液,分装至数个棕色自动进样器样品瓶中,在上述色谱条件及质谱条件下,于避光条件下分别室温放置0、1、2、4、8和12 h 后进行HPLC-MS/MS分析; 另取样品置于光照条件下分别室温放置5、10、20、30和60 min后进行HPLC-MS/MS分析,分别记录样品色谱图。

方法学考察

专属性

分别取6个不同个体的空白血浆100 μL,除不加内标外,其余按“血浆样品的预处理”项下操作,进行HPLC-MS/MS分析,获得空白血浆样品色谱图。将trans-FA和IS溶液分别加入空白血浆后,同法操作,得血浆样品色谱图; 取健康受试者给药后收集的血浆样品,同法操作,得健康受试者血浆样品色谱图。

残留效应

分别制备空白血浆 (不加入内标溶液) 和含trans-FA浓度为标准曲线定量上限 (ULOQ) 的血浆样品,按“血浆样品的预处理”项下操作进行HPLC-MS/MS分析,在高浓度样品进样分析后,分析空白溶液样品流动相,反复5次,记录色谱图。

标准曲线和定量下限

取10 mL离心管数支,分别精密加入不同浓度的trans-FA对照品溶液20 μL后以氮气流吹干,加入空白血浆1 mL,旋涡混匀,配成含trans-FA分别为0.1、0.4、0.8、1.5、2.5、3.5和 5 ng·mL-1的标准含药血浆,按“血浆样品的预处理”项下操作,制备标准曲线,并同时制备空白样品及空白加内标样品。计算trans-FA峰面积As和内标氢氯噻嗪峰面积Ai的比值f (f=As / Ai),同时计算空白血浆样品的trans-FA的峰面积As0与内标峰面积Ai的比值ƒ00 = As0 / Ai),分别以各标准含药血浆样品trans-FA的ƒ值扣除空白血浆的trans-FA的ƒ0值后的ƒ’值为纵坐标,以trans-FA的血药浓度C为横坐标,用加权最小二乘法 (W = 1/X 2) 进行回归运算,得标准曲线方程。

精密度和准确度

制备含trans-FA分别为0.3、1和4 ng·mL-1的标准含药血浆样品,每个浓度平行配制5份,并配制一条标准曲线,按“血浆样品的预处理”项下操作,共配制3个分析批,计算各标准含药血浆样品trans-FA的ƒ值扣除随行标准曲线中空白血浆的trans-FA的ƒ0值后的ƒ'值,代入当批的标准曲线求得实测浓度及实测浓度准确度,计算批内和批间精密度。

基质效应、提取回收率

取6个不同个体的空白血浆,除不加内标外,其余按“血浆样品的预处理”项下操作,分别制备空白血浆复溶上清液适量,记录每种空白血浆相对应的trans-FA的峰面积A0。按“血浆样品的预处理”项下分别制备6个不同个体的空白血浆复溶上清液适量,加入适量trans-FA对照品溶液及内标溶液,配制成含trans-FA为0.3、1和4 ng·mL-1的含药血浆样品,每个浓度平行配制6份进行HPLC- MS/MS分析,记录trans-FA和内标峰面积 (A) 并分别计算trans-FA峰面积和内标峰面积的平均值 (B); 以水代替空白血浆,其余操作同上,每个浓度平行配制3份进行HPLC-MS/MS分析,记录trans-FA和内标峰面积并分别计算trans-FA峰面积和内标峰面积的平均值 (C); 按“精密度和准确度”项下操作,配制含trans-FA为0.3、1和4 ng·mL-1的标准含药血浆样品,每种浓度配制5份进行HPLC-MS/MS分析,记录trans-FA和内标峰面积 (D)。计算trans-FA的基质效应的公式为ME (%) = (A - A0) / C × 100%; 计算IS的基质效应的公式为ME (%) = A / C × 100%; 计算trans-FA和IS的提取回收率的公式为R (%) = D / B × 100%。

稳定性

配制含trans-FA质量浓度为0.3和4 ng·mL-1的标准含药血浆样品若干份,3份于配制好后按“血浆样品的预处理”项下操作处理并立即进行HPLC-MS/MS分析,并在测定完成后在进样器样品盘中放置7 h后再次进样分析; 3份室温放置7 h后分析; 3份配制好后反复冻融3次后分析; 3份配制好后于-20 ℃冰冻57天后,取出解冻再分析; 6份配制好后按“血浆样品的预处理”项下操作处理获得残渣样品,3份残渣样品于室温放置7 h后进行处理分析; 3份残渣样品于-20 ℃冰冻56h后进行处理分析; 记录色谱图。同时在避光条件下分别考察了trans-FA和内标的甲醇储备液 (均为1 mg·mL-1) 分别在室温放置13.5 h、-20 ℃冷冻保存88天的稳定性 (n = 3)。

药代动力学研究

12名健康受试者,男女各半,年龄21~28岁,男性体重60~79 kg,女性体重46~60 kg,体质量指数BMI在19.0~24.0内,在签署知情同意书并经全面体检合格后纳入本次试验。临床试验经医院伦理委员会同意。试验前两周及实验期间未服用其他任何药物。受试者于第1天晚18:00入住I期病房,第2天上午6:30空腹静脉输注活血通络粉针 (剂量: 3 g),输液时间持续4 h (静脉输注,以适量氯化钠注射液充分溶解,再以氯化钠注射液250 mL稀释,采用输液泵恒速静脉输注,4 h输完)。给药过程中自由饮水,给药结束后2 h统一进食标准餐,进食时间不超过30 min。于给药前 (零时) 及静脉输注开始后0.5、1、1.5、2、3和4 h及输液结束后0.08、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12和20 h分别采集静脉血约5 mL,置肝素化离心管中,分离血浆后于-80 ℃保存待测。经过清洗期1周 (第2天服药后至第9天服药前),受试者于第8天晚18点再次入住I期病房,第9天进行活血通络粉针剂量为9 g的药动学试验,除剂量外其他均按第2天给药方案进行。受试者给药结束后避免剧烈运动,不长时间卧床。第10天经医生体检允许后方可离开I期病房。

结 果 1 trans-FA光化学稳定性

trans-FA甲醇溶液在避光条件下室温放置12 h,结果未见降解 (RSD ≤ 1.4%)。在光照条件下迅速降解,1 h内降解近60%,且降解产物在trans-FA的选 择性离子监测通道内有质谱响应,证明此物质与trans-FA有相同的分子质量,且有相同的产物离子碎片,结合相关文献[11,12],鉴定此物质为顺式阿魏酸 (cis-FA)。结果表明,trans-FA具有光不稳定性,在光照条件下可迅速转化为cis-FA,所以样品的处理与分析均应在避光条件下进行。

2 方法学确证 2.1 选择性

结果表明,trans-FA和IS的保留时间分别为3.82和1.37 min,色谱峰峰形良好,无杂峰干扰测定,基线平稳。本方法选择性好,能准确测定血浆中trans-FA的浓度,且灵敏度较高,典型色谱图见图 2

Figure 2 Representative MRM chromatograms of trans-FA and hydrochlorothiazide (IS). A: Blank plasma sample; B: Blank plasma sample spiked with the trans-FA at LLOQ (0.1 ng·mL-1) and IS; C: A plasma sample from a healthy Chinese volunteer at 4.5 h after a single intravenous infusion administration of 9 g HTLPI (Huo-Xue-Tong-Luo powder injection)
2.2 残留效应

血浆样品分析中trans-FA和内标无残留效应。

2.3 标准曲线和定量下限

血浆样品中trans-FA的标准曲线的典型权重回归方程: f = -0.023 13 + 0.557 1 × C (r/span> = 0.999 2)。结果显示,trans-FA在0.1~5 ng·mL-1内线性关系良好,定量下限为0.1 ng·mL-1,定量下限的RSD为7.7%,准确度在90.1%~107.7%之间。

2.4 精密度与准确度

trans-FA的批内精密度均小于9.2%,批间精密度均小于7.3%,准确度在95.4%~111.4% 之间; 结果表明,本方法的准确度与精密度的相对标准偏差 (RSD) 均小于15%,符合生物样品分析要求。

2.5 基质效应、提取回收率

结果表明,低、中、高3个浓度下trans-FA的提取回收率为 (79.9 ± 4.0) %、(83.0 ± 0.9) % 和 (79.2 ± 5.8) %; 内标 (IS) 的提取回收率为 (69.0 ± 6.4) %。基质效应稳定,3个浓度下trans-FA的基质效应为 (107.3 ± 3.4) %、(104.9 ± 4.1) % 和 (111.6 ± 0.8) %; IS的基质效应为 (103.5 ± 3.2) %,RSD均在15%以内,表明所建立的方法回收率高,结果稳定,无基质效应的影响。

2.6 稳定性

结果表明,trans-FA血浆样品及其残渣样品稳定性良好; 血浆样品处理后的上清液在进样器中放置7 h稳定性良好。trans-FA和内标的甲醇储备液 (均为1 mg·mL-1) 稳定性良好,相对误差均小于 ± 2%。

3 人血浆中trans-FA的药代动力学

12名健康受试者分别单次静脉滴注低剂量 (含阿魏酸0.2 mg)、高剂量 (含阿魏酸0.6 mg) 活血通络粉针后血浆中trans-FA的平均血药浓度-时间曲线见图 3,用DAS2.0程序进行曲线拟合,药动学参数见表 1

Figure 3 Mean plasma concentration-time curves of trans-FA in healthy Chinese subjects after a single intravenous infusion of 3 g (containing 0.2 mg of FA) or 9 g (containing 0.6 mg of FA) of HTLPI. n = 12,x±s

Table 1 Pharmacokinetic parameters of trans-FA in healthy Chinese subjects after a single intravenous infusion of 3 g (containing 0.2 mg of FA) or 9 g (containing 0.6 mg of FA) of HTLPI. n = 12,x±s
讨 论

阿魏酸有cis-FA和trans-FA两种立体异构体,cis-FA为黄色油状物,不易结晶,较难获得对照品,而trans-FA为正方形结晶或纤维结晶。trans-FA为食源性的酚酸类成分,存在于大量日常饮食中。通过对不同来源的人空白血浆进行提取,发现空白血浆中不仅存在trans-FA,而且存在其光降解产物cis-FA,所以必须选择合适的色谱条件使trans-FA与其他内源性成分基线分离,从而保证样品测定的准确性。本实验对水相中加入的醋酸铵浓度进行了优化,发现在加入5 mmol·L-1时,样品响应最好,定量下限可达到0.1 ng·mL-1,灵敏度高。

为满足样品测定灵敏度的要求,trans-FA的血浆样品的前处理方式采用了液-液萃取法。由于trans-FA含有羧基,极性较强,故选择常用的乙酸乙酯作为提取溶剂。在优化提取方法时,主要考察了生物样品进行酸化时加入酸量与提取回收率的关系,同时考察了1 mL血浆样品中加入不同浓度盐酸溶液时样品的提取回收率,最终发现在提取时于1 mL血浆样品中加入1 mol·L-1盐酸溶液100 µL,样品的提取回收率最高。

trans-FA为食源性成分,人体内均存在不同浓度水平的阿魏酸,所以无法对表观分布容积 (Vd) 和清除率 (CL) 进行准确评价,本次试验仅估算Cmax、AUC和t1/2等主要药动学参数。结果表明,trans-FA在人体内半衰期较短,仅为约0.5 h,所以本次试验未对受试者进行饮食控制,仅要求受试者于给药前一晚进行空腹过夜。

本研究结果表明,静脉滴注高剂量 (0.6 mg) 活血通络粉针后,trans-FA的血药浓度最大也不到 5 ng·mL-1,远低于阿魏酸的微克级药理活性浓度范 围[13]。究其原因,一方面是由于制剂本身的trans-FA含量不高,临床常用的阿魏酸钠注射剂的规格多为0.1 g[14]; 另一方面,活血通络粉针具有多种活性成分,作为臣药的川芎,其活性成分trans-FA是否会与其他两味药材的活性成分 (芍药苷、苦杏仁苷) 产生体内药物相互作用,从而使trans-FA在人体内的药动学行为受到影响仍需要进一步的研究。

参考文献
[1] Srinivasan M, Sudheer AR, Menon VP. Ferulic acid:therapeutic potential through its antioxidant property[J]. J Clin Biochem Nutr, 2007, 40:92-100.
[2] Koh PO. Ferulic acid modulates nitric oxide synthase expression in focal cerebral ischemia[J]. Lab Anim Res, 2012, 28:273-278.
[3] Suzuki A, Kagawa D, Fujii A, et al. Short-and long-term effects of ferulic acid on blood pressure in spontaneously hypertensive rats[J]. Am J Hypertens, 2002, 15:351-357.
[4] Zhang LM, Wang HS, Wang T, et al. Ferulic acid ameliorates nerve injury induced by cerebral ischemia in rats[J]. Exp Ther Med, 2015, 9:972-976.
[5] Mattila P, Hellström J. Phenolic acids in potatoes, vegetables, and some of their products[J]. J Food Compos Anal, 2007, 20:152-160.
[6] Russell W, Duthie G. Plant secondary metabolites and gut health:the case for phenolic acids[J]. Proc Nutr Soc, 2011, 70:389-396.
[7] Wu YY, Shang YM, Cai SQ. HPLC finger print of the components of Radix Angelicae Sinensis[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2008, 43:728-732.
[8] Yang F, Xiao YS, Zhang FF. High performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis of Radix Angelica Sciensis[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2006, 41:1078-1083.
[9] He B, Qing L, Ying J, et al. A UFLC-MS/MS method for simultaneous quantitation of spinosin, mangiferin and ferulic acid in rat plasma:application to a comparative pharmacokinetic study in normal and insomnic rats[J]. J Mass Spectrom, 2012, 47:1333-1340.
[10] Li N, Liu CH, Mi SQ, et al. Simultaneous determination of oleanolic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, kaemperol and quercetin in rat plasma by LC-MS-MS and application to a pharmacokinetic study of Oldenlandia diffusa extract in rats[J]. J Chromatogr Sci, 2012, 50:885-892.
[11] Liu XF, Liu YQ, Zhao P, et al. Determination of trans-ferulic acid and cis-ferulic acid in 7 medicinal materials by RP-HPLC[J]. Res Pract Chin Med (现代中药研究与实践), 2009, 23:34-37.
[12] Ding MY, Ma SW, Liu DL. Stability of ferulic acid and its existing form in Ligusticum chuanxiong and Angelica sinensis[J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草药), 2004, 35:28-30.
[13] Mancuso C, Santangelo R. Ferulic acid:pharmacological and toxicological aspects[J]. Food Chem Toxicol, 2014, 65:185-195.
[14] Guo LX, Li XQ. RP-HPLC assay of sodium ferulate injecttion[J]. Chin J Pharm Anal (药物分析杂志), 2007, 27:444-446.