2. 湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心, 湖南长沙 410128;
3. 中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050
2. Veterinary Herb Resources and Drug Development National-local Joint Engineering Research Center, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
3. Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
左氧氟沙星是以4-喹诺酮为母核的人工合成抗菌素,因其具有抗菌谱广、抗菌效率高和体内生物利用度好等特点,已成为临床上广泛使用的抗菌类药物之一[1,2]。据2011~2013年国家药品不良反应监测年度报告,喹诺酮类药物的严重不良反应报告数量居抗感染药物不良反应/事件的前三位,左氧氟沙星药物的不良反应报道居该类药物的首位。药物不良反应除药物自身理化性质外,与药物中的杂质也有密切关系[1,3]。根据ICH指导原则,对于原料药和制剂中存在的工艺相关杂质 (impurity,IMP) 和降解产物 (degradation product,DP),尤其是超过鉴定阈值或随着时间呈增加趋势的杂质必须进行杂质结构研究,并建立杂质的定量分析方法,为杂质的限度控制和药物的质量控制提供必要的数据支持[4]。
基于LC-MS/MS技术的多反应离子监测 (multiple reaction monitoring,MRM) 方法具有灵敏、准确和选择性强等特点,能够有效地排除干扰离子,因此被广泛用于复杂样品体系中微量成分的定量分析[5, 6, 7, 8]。本课题组前期开展了基于LC-MS/MS技术的左氧氟沙星原料药中微量杂质的定性分析方法研究,利用该方法结合强制破坏实验对药物原料药中可能产生的杂质结构及其来源进行了阐明,鉴定出20个左氧氟沙星相关的杂质[9]。由于实验室的强制破坏条件并不完全代表原料药和制剂生产、存储和流通等环节中实际的化学或环境影响因素,因此有必要对市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行分析检测,了解杂质在制剂中的实际存在状况。
本研究开展了基于LC-MS/MS技术的药物制剂中杂质的定量分析与筛查方法研究,针对市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行全面、准确、快速地检测,完成不同厂家的市售药物制剂中杂质的筛查检测,并对其质量进行初步评价,为左氧氟沙星药物制剂的质量控制及安全性评价提供参考。
材料与方法 仪器与试药Agilent 1200 Series快速高效液相色谱仪 (安捷伦公司,美国); QTRAPTM四极杆-线性离子阱串联质谱仪 (QTRAP 5500,美国AB Sciex公司),配备Turbo Ion spray (ESI) 离子源以及Analyst 1.5.1数据采集和处理系统; 分析天平 (METTLER TOLEDO AG135型,梅特勒-托利多仪器有限公司); Eppendorf微量移液器和移液管。左氧氟沙星对照品 及氧氟沙星杂质A对照品均购自中国食品药品检定研究院; descarboxyl levofloxacin,desmethyl levofloxacin hydrochloride和N,N-desethylene levofloxacin hydrochloride,购自加拿大TRC (Toronto Research Chemicals Inc.) 公司。左氧氟沙星季铵盐由中国医学科学院医药生物技术研究所王玉成研究员课题组提供。左氧氟沙星片剂、胶囊和滴眼液等均为市售药品; 甲醇和甲酸 (色谱纯) 购自Merck公司; 实验用水为娃哈哈纯净水。
对照品溶液的配制分别精密称取上述各对照品适量,加甲醇超声溶解并定容,得到质量浓度约为0.5 mg·L-1的溶液,作为储备液。吸取上述储备液各适量体积,混匀配制成所需浓度的混合标准品溶液。
样品预处理取片剂样品各10片,分别研细,备用; 取胶囊样品各10粒,取内容物,分别混匀,备用; 液体制剂样品直接取样不需经预处理。
供试品溶液的配制取上述预处理后的市售 制剂样品各适量,分别加入一定体积的甲醇,固体制剂样品分别超声提取1 h,放至室温后补足失重,离心取上清液各适量,加甲醇稀释至含左氧氟沙星约 2 μg·mL-1,备用。液体制剂样品直接用甲醇稀释至 相应浓度,备用。样品制备过程中随行空白溶剂,得到空白样品溶液。
色谱条件采用Agilent Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6 mm,5 μm) 色谱柱 (含在线过滤器); 流动相为甲醇 (A)-0.3%甲酸水 (B),采用梯度洗脱,进样前用起始流动相预平衡色谱柱5 min,梯度洗脱条件为 t (min)/A%: 0/5→8/22→18/22→30/60→35/60→36/5; 柱温为30 ℃; 流速为1.0 mL·min-1,柱后分流约30%注入质谱仪; 进样体积为5 μL。
质谱条件在ESI正离子模式下检测,离子源温度为450 ℃,喷雾电压 (IS) 为5.5 kV,雾化气 (GS1) 压力为60 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa),辅助气 (GS2) 压力为40 psi,入口电压 (EP) 为10 V; 采用MRM扫描方式测定,Q1和Q3的分辨率均设为Unit; 被列入MRM方法中的每个杂质选取 [M+H]+ 分子离子与两个相对丰度最高或特异的子离子组成离子对 (transition),对其解簇电压 (decluster potential,DP) 和碰撞能量 (collision energy ,CE) 进行了优化,优化后参数如表 1所示。
方法学考察 吸取各对照品储备液适量,配制系列浓度的混合对照品溶液; 选取其中一个浓度的对照品溶液和空白样品溶液,按上述LC-MS/MS方法进行分析,考察方法的专属性。
配制系列浓度的对照品溶液,按上述色谱和质谱条件进行LC-MS/MS谱分析,以提取离子色谱峰峰面积值对浓度进行线性回归并计算相关系数。
取混合对照品溶液逐步稀释进样,考察该方法下各目标化合物的检测限及定量限; 取同一浓度的混合对照品溶液在上述实验条件下连续进样6次,进行仪器的精密度考察; 取相同厂家同一批号样品,按“供试品溶液的配制”项下方法制备供试品溶液6份 (含左氧氟沙星约20 ng·mL-1),在上述实验条件下进样,进行重复性实验。
取相同厂家同一批号样品9份,加入3个浓度的药物和杂质对照品,每个浓度平行3份,按“供试品溶液的配制”项下方法进行样品溶液的制备,进行LC-MS/MS分析,将目标待测物的提取离子色谱峰峰面积代入线性回归方程计算目标待测物的浓度、测定值与理论值的差值,考察方法的准确性。
取同一浓度的混合标准品溶液,在LC-MS/MS分析条件下,对流速、柱温和流动相酸水浓度等进行考察,计算目标化合物的提取离子色谱峰峰面积的RSD值,对方法的耐用性进行考察。
结 果 1 LC-MS/MS 分析方法建立和验证 1.1 专属性取2 ng·L-1的混合对照品溶液和空白样品溶液进行LC-MS/MS分析,在与杂质对照品相同保留时间的出峰位置,空白样品无干扰,左氧氟沙星对照品和杂质对照品的保留时间见表 2。
按上述LC-MS/MS方法对精密度、检出限和定量限进行考察,药物及杂质的日内精密度RSD在0.83%~4.09%,日间精密度RSD在2.41%~12.84%,方法对各杂质的检出限在0.16~11.77 ng·mL-1,定量限在0.50~39.24 ng·mL-1。
1.3 线性关系通过对系列混合对照品溶液进行LC- MS/MS分析,由Analyst 1.5.1的数据处理软件给出各目标化合物的线性回归曲线和相关系数 (表 2)。
1.4 重复性选取厂家4 (批号: 113005) 为代表样品,平行制备6份供试品溶液,进行LC-MS/MS分析。因杂质离子的提取离子峰面积值偏小,不在线性范围内,因此仅计算了左氧氟沙星药物本身的相关数据,其RSD为0.11%。
1.5 加样回收率左氧氟沙星对照品按50%、100%和150% 三个水平在已知含量的样品粉末中添加,杂质对照品的添加量为0.05、0.1和0.2 mg,按供试品溶液的配制方法制得样品溶液,进行LC-MS/MS分析。除化合物 (离子对: 282.1→264.1) 的回收率为63.21%,其余目标化合物的回收率在80%~105%。
1.6 耐用性取同一浓度的混合对照品溶液,对可能影响分析条件的流速 (0.8、1.0和1.2 mL·min-1)、柱温 (25、30和35 ℃) 和流动相酸水浓度 (0.2%、0.3% 和0.4%) 进行考察,除上述条件外按设定的LC-MS/MS分析条件进样分析,计算各目标分析物浓度的RSD为2.52%~3.93%,表明该分析方法耐用性良好,不易受分析条件的微小波动影响。
2 市售左氧氟沙星中杂质的LC-MS/MS筛查按照“供试品溶液的配制”项下方法制备供试品溶液,在上述实验条件下进行测定,结果见图 1和表 3。从19个不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂样品 (S1~S19) 中仅检出了表 1所列的5种杂质,包括1种工艺相关杂质 (IMP-1) 和4种降解产物 (DP-8、DP-12、DP-14和DP-15),这些降解产物分 别在酸性 (DP-8)、光照 (DP-12和DP-14) 和氧化 (DP-15) 条件下由药物降解生成[9]。不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂中杂质的含量存在较大差异,S14~S16三个厂家的样品中杂质含量远低于其他厂家。DP-14在所有样品中均被检出且含量较其他杂质相对偏高,其次为DP-12和DP-15。
由于杂质对照品的获取成本高,因而针对所有可能杂质建立定量分析方法具有很大难度。本研究利用LC-MS/MS分析的高灵敏和高特异性,建立了一种同时检测左氧氟沙星药物制剂中20种杂质的筛查方法。对于不能够获取对照品的15种杂质,利用不加校正因子的主成分自身对照法对市售左氧氟沙星制剂中的这些杂质进行定量筛查,能够更加全面地获得药物中杂质的存在情况和含量水平。
本研究建立的LC-MS/MS定量分析方法专属性强、灵敏度高,可定量检出制剂中相对于药物含量高于0.1% 的杂质,能够满足ICH相关指导原则分析方法的要求。利用该方法对不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行了筛查,从所有样品中仅检测出5种杂质,分别为IMP-1、DP-8、DP-12、DP-14和DP-15。除IMP-1为原料药中带入的工艺杂质,DP-8等杂质均为左氧氟沙星在酸性、光照和氧化条件下降解产生的主要杂质[9]。在实验室强制破坏实验条件下产生的降解产物大多数未被检出,分析认为与强制破坏条件相比,实际制剂样品在生产、运输或储存过程中的条件均相对温和,因此大多数杂质不会产生或者含量不一定会增加。但如果保存条件不 当或工艺条件未能得到很好控制,上述杂质就会产生或含量增加而被检出。此方法获得的检测结果能 够反映最终药品制剂的质量情况。另外,通过与文献[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]进行比较,工艺杂质IMP-1是左氧氟沙星的N4' -甲基季铵类化合物,在左氧氟沙星制剂中的检出报道尚属首次。
研究结果表明,不同厂家的药品杂质控制水平存在一定的差异,其中S14~S16三个不同厂家药 物制剂中所检出杂质的含量均低于0.01%,而另外16个市售制剂中杂质的含量相对较高,尤其是S12和S17~S19四个不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂中杂质含量明显偏高。结合本课题组前期研究结果,作者认为本研究中不同厂家制剂样品的检测结果产生的明显差异可能与制剂生产工艺或工艺参数控制的不同有关。
本研究建立的LC-MS/MS分析方法较LC-UV[10, 17]方法具有更好的专属性和灵敏度; 在不需要全部对照品的情况下,可针对更广泛的杂质种类和市售制剂品种开展定量分析和质量评价工作,为客观评价左氧氟沙星药物质量及质控水平提供了有效手段。
[1] | Domagala JM. Structure-activity and structure-side-effect relationships for the quinolone antibacterials[J]. J Antimicrob Chemother, 1994, 33:685-706. |
[2] | Kresse H, Belsey MJ, Rovini H. The antibacterial drugs market[J]. Nat Rev Drug Discov, 2007, 6:19-20. |
[3] | Mandell L, Tillotson G. Safety of fluoroquinolones:an update[J]. Can J Infect Dis, 2002, 13:54-61. |
[4] | ICH Guidelines Q3A(R1). Impurities in New Drug Substances[M]. Geneva:IFPMA, 2002. |
[5] | Yu X, Warme C, Lee D, et al. Characterization of a low-level unknown isomeric degradation product using an integrated online-offline top-down tandem mass spectrometry platform[J]. Anal Chem, 2013, 85:8964-8967. |
[6] | Wu CS, Wang CH, Zhang JL, et al. Separation, determination of six impurities in methotrexate drug substance using ultraperformance liquid chromatography[J]. Chin Chem Lett, 2014, 25:447-450. |
[7] | Wang MJ, Hu CQ. Impurity profiling of macrolide antibiotics by liquid chromatograpy-mass spectrometry[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48:642-647. |
[8] | Li J, Huang HW, Zhang H, et al. The impurity profiling of simvastatin and its tabletsby UPLC-MS/MS[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2014, 49:672-678. |
[9] | Zheng YJ, He JM, Zhang RP, et al. An integrated approach for detection and characterization of the trace impurities in levofloxacin using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2014, 28:1164-1174. |
[10] | Lalitha DM, Chandrasekhar KB. A validated stabilityindicating RP-HPLC method for levofloxacin in the presence of degradation products, its process related impurities and identification of oxidative degradant[J]. J Pharm Biomed Anal, 2009, 50:710-717. |
[11] | Yoshida Y, Sato E, Moroi R. Photodegradation products of levofloxacin in aqueous solution[J]. Arzneimittelforschung, 1993, 43:601-606. |
[12] | The United States Pharmacopeia Convention. The 35th Revision of the United States Pharmacopeia (USP 36)[S/OL]. http://www.usp.org/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/revisions/levofloxacin.pdf. |
[13] | Chinese Pharmacopoeia Commission. The Pharmacopoeia of the People's Republic of China (中华人民共和国药典)[S]. 2010 ed. Part II. Beijing:China Medical Science Press, 2010:106-108. |
[14] | The Japanese Pharmacopoeia (English Electric Version), 16th ed. 2012. |
[15] | Sateesh JN, Subbareddy GV, Jayaveera KN, et al. A validated stability-indicating isocratic LC method for levofloxacin in the presence of degradation products and its process-related impurities[J]. Acta Chromatogr, 2012, 24:23-36. |
[16] | Wang WJ, Li T, Li J, et al. HPLC-MS identification of degradation products of levofloxacin[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2012, 47:498-501. |
[17] | Tian HW, Yang BT, Wang MC. Analysis of impurity spectrum of domestic levofloxacin hydrochloride eye drops[J]. Chin Pharm Affairs (中国药事), 2014, 28:255-259. |