骨质疏松是以骨量低下与易骨折为特征的全身性代谢性骨病, 其发病因素很多, 主要原因是骨重建失衡。骨重建是一个动态且持续的过程, 由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收来维持平衡。而骨形成与骨吸收过程的失衡则会导致相关的代谢性骨病, 例如骨质疏松^[1]。目前治疗骨质疏松的方案主要是采用抗骨吸收药物, 但只能延缓疾病的发展而不能逆转疾病的进程, 存在一定的局限性^[2]。因此, 寻找能够促进骨形成, 并减少骨吸收从而改善骨代谢的药物具有重要的开发价值。

BMPs (bone morphogenetic proteins) 是TGF-β (transforming growth factor β) 超家族中的成员之一, 为广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白^[3], 在骨发育与重建的调控中有着重要作用。其中BMP2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一^[4], 在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成骨细胞的分化成熟方面起着至关重要的作用, 参与成骨细胞分化以及骨细胞外基质合成与分泌, 促进骨形成, 增加骨量。转基因小鼠实验表明BMP2在骨再生过程中起到重要作用^[5]。BMP2主要通过经典的Smad信号通路调节成骨分化关键转录调控因子Runx2等的表达, 最终促进干细胞的分化。此外, BMP2在骨骼发育中也起到重要作用^[6]。基于此, BMP2已成为治疗骨质疏松治疗的重要靶点。

本研究利用实验室前期构建的表达受小鼠BMP2上游调控序列调控的荧光素酶报告基因的稳定转染细胞模型来寻找能够上调BMP2表达水平的活性化合物, 通过对国家新药 (微生物) 筛选实验室化合物库进行了近20 000样次筛选, 经过复筛, 得到阳性化合物E40071, 并对其进行了体外抗骨质疏松活性研究。

DMEM-高糖培养基、α-MEM培养基购于Thermo公司; 成骨细胞诱导培养基: 在α- MEM完全培养基中添加终浓度为10 mmol·L^-1的β-甘油磷酸钠 (TCI公司) 和终质量浓度为50 μg·mL^-1的L-抗坏血酸 (TCI公司)。破骨分化诱导培养基: 在DMEM-高糖培养基完全培养基中添加终质量浓度 为50 ng·mL^-1的重组小鼠sRANKL (Peprotech公司); 胎牛血清购于Gibco公司。G418购于Amresco公司。荧光素酶检测试剂盒购于Promega公司。Real-time PCR试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司。茜素红S购于Bellancom Life Sciences公司。

实验室前期构建的小鼠BMP2上游调控序列-荧光素酶报告基因的稳定转染细胞株BMP2-Luc MC3T3细胞 (简称PMB) 培养于含1 000 μg·mL^-1的G418和10% 胎牛血清的DMEM培养基中; 小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1 (subclone 14) 培养于含10% 胎牛血清的α-MEM培养基中; 小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中。所有细胞在37 ℃、5% CO₂条件下进行孵育, 当细胞生长至汇合度80%～90%, 按所需比例进行传代。

将处于对数生长期的模型细胞PMB按每孔5×10⁴个细胞数接种至96孔透明底白板。待细胞充分贴壁后, 移去原有培养基, 向每孔加入不含血清的DMEM培养基198 μL和待测样品2 μL, 使初筛化合物的终质量浓度为0.1 mg·mL^-1, 并以与待测样品相同浓度的DMSO为空白对照。18～24 h后吸弃培养基, 利用荧光素酶报告基因检测系统测定细胞荧光素酶活性。按如下公式计算化合物对荧光 素酶活性的相对上调率: 相对上调率 (%) = (待测样品组细胞荧光素酶活性/空白对照组细胞荧光素酶活性) × 100。将上调率≥150% 的化合物确定为初筛阳性化合物, 进一步进行复筛。

细胞接种方法同“高通量筛选”, 用无血清DMEM培养基将活性化合物从100 μmol·L^-1开始倍比稀释系列浓度, 待细胞充分贴壁后, 移去原有培养基, 每孔加入无血清DMEM稀释的不同浓度化合物的培养基200 μL, 每个浓度3个复孔。同时设立无化合物的培养基作为空白对照。18～24 h后吸弃培养基, 利用荧光素酶报告基因检测系统测定细胞荧光素酶活性, 分析化合物浓度与荧光素酶活性调节率之间的量效关系, 利用GraphPad Prism 5.0软件做出量效关系曲线, 得到化合物作用的半数有效浓度 (EC₅₀)。

MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞以 每孔2×10⁴个细胞数接种至96孔透明底白板, 培养18～24 h后吸弃培养基, 换为无血清α-MEM培养基稀释的系列浓度梯度化合物与空白对照, 每孔200 μL, 37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h。每孔加入5 mg·mL^-1 MTT溶液20 μL, 使其终质量浓度为0.5 mg·mL^-1, 37 ℃、5% CO₂条件下培养4 h后吸弃培养液, PBS 漂洗一次, 每孔加入DMSO 150 μL, 室温避光孵育15 min, 待结晶充分溶解后, 用酶标仪读取各孔在570 nm波长下的光吸收值。

以不同浓度的化合物 (0、0.01、0.1、1和10 μmol·L^-1) 处理MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞24 h, 利用TransZol Up (全式金) 提取总RNA。利用TransScript^®One-Stepg DNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转为cDNA。鼠BMP2 (GeneBank序列号: NM_007553) 引物序 列: 上游: 5'-GGGACCCGCTGTCTTCTAGT-3', 下游: 5'-TCAACTCAAATTCGCTGAGGAC-3'; 鼠Runx2(GeneBank序列号: NM_001146038) 引物序列: 上游: 5'-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3', 下游: 5'-ACT TGGTTTTTCATAACAGCGGA-3'; Osx (GeneBank序列号: NM_130458) 引物序列: 上游: 5'-GGAAAGGAG GCACAAAGAAGC-3', 下游: 5'-CCCCTTAGGCACTA GGAGC-3'; GAPDH (GeneBank序列号: NM_008084) 引物设计: 上游: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTT G-3', 下游: 5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。利用Roche公司的FastStart Universal SYBR Green PCR Master (Rox) 试剂盒进行Real-time PCR反应, 反应条件为95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火延伸1 min, 共40个循环。

以不同浓度的化合物 (0、0.01、0.1、1和10 μmol·L^-1) 处理MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞24 h, 收集细胞后, 利用细胞裂解液RIPA (普利莱基因技术有限公司) 裂解细胞, 提取总蛋白。用BCA试剂盒 (Pierce) 测定总蛋白浓度, 根据测定的总蛋白浓度, 用双蒸水将各管样品调整成相同浓度, 加入一定量的5×蛋白样品缓冲液。进行SDS- PAGE电泳, 转膜后以5% 脱脂奶粉封闭, 4 ℃孵育一抗过夜, 以TBST洗膜3次后孵育二抗1 h, 洗膜后曝光显色, 用Image J软件扫描蛋白条带, 从而定量分析蛋白表达水平的变化。抗体使用如下: 小鼠抗BMP2单克隆抗体 (1∶5 000; Sigma); 兔抗GAPDH单克隆抗体 (1∶1 000; 北京中杉金桥生物技术公司); 兔抗Smad1/5/8多克隆抗体 (1∶1 000; Santa Cruz); 兔抗磷酸化Smad1/5/8单克隆抗体 (1∶1 000; CST); HRP标记山羊抗兔二抗和HRP标记山羊抗小鼠二抗 (1∶2 000; 北京中杉金桥生物技术公司)。

MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞以每孔5×10⁵个细胞数接种至6孔板中, 待细胞充分贴壁后换为成骨分化培养基, 在37 ℃、5% CO₂条件下诱导12天, 3天换液一次。收集细胞, 冰PBS洗2次, 冰上超声处理 (10 w) 2次, 每次30 s。将处理后的样品4 ℃、12 000 ×g离心15 min。取上清液测定碱性磷酸酶 (ALP) 活性与蛋白浓度。取蛋白上清液100 μL加入含1.0 mg·mL^-1 pNPP (Sigma)、1 mol·L^-1二乙醇胺 (Sigma) 和0.5 mmol·L^-1 MgCl₂ 的缓冲液100 μL, 37 ℃避光孵育30 min, 每孔加入 3 mol·L^-1 NaOH 50 μL终止反应, 在405 nm波长下测定光吸收。BCA法测定样品蛋白浓度, 用于校正ALP活性。

(subclone 14) 细胞以每孔5×10⁵个细胞数接种至12孔板中, 待细胞充分贴壁后换为成骨分化培养基, 在37 ℃、5% CO₂条件下诱导21天, 3天换液一次。之后弃去培养液, 用PBS漂洗细胞2次。95% 乙醇固定细胞10 min, 双蒸水漂洗3次。用40 mmol·L^-1茜素红S溶液 (pH 4.2) 室温染色10 min。蒸馏水漂洗3次, 拍照。

抗酒石酸性磷酸酶 (tartrate- resistant acid phosphatase, TRAP) 破骨细胞形成检 测是通过对破骨细胞标志TRAP阳性的细胞进行计数来考察。利用酸性磷酸酶试剂盒 (387-A; Sigma) 进行TRAP染色。Raw264.7细胞以每孔2×10²个接种于96孔板, 待细胞贴壁后, 换为破骨分化诱导培养基, 37 ℃、5% CO₂条件下诱导6天, 3天换液一次。弃去培养液, 加入固定剂 (25.5% 柠檬酸盐溶液 + 66.3% 丙酮+ 8.2% 的37% 甲醛溶液) 固定30 s, 去离子水洗净, 加入配好的混合液 (萘酚AS-BI磷酸盐与酒石酸盐溶液) 37 ℃避光孵育1 h。去离子水洗后, 苏木素复染2 min。自然晾干后, 显微镜下观察。选取细胞核≥3个的TRAP阳性细胞为破骨细胞, 进行计数。

实验数据均以平均值 ± 标准差表示, 采用SPSS软件进行统计分析, 并用单因素方差分析进行数据统计, 组间进行t检验, P < 0.05时认为差异具有统计学意义。

用BMP2表达上调剂模型对国家新药 (微生物) 筛选实验室化合物库20 000多个合成的化合物 (主要包含苯并噁唑类、苯并噻唑类、吡啶类、喹啉类、噻吩类和吡唑并嘧啶类化合物等) 进行高通量筛选。经过初筛、复筛后, 找到具有上调BMP2活性的化合物E40071 (图 1), 分子式为C₁₉H₂₃N₅O, 相对分子质量为337.43, 化学名称为2-(4-(5-甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)哌嗪-1-基)乙-1-醇[2-(4-(5-methyl- 3-phenylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)piperazin-1-yl) ethan-1-ol]。

Figure 1

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Figure 1 Chemical structure of E40071

将不同浓度E40071作用于模型细胞后测定化合物作用下的荧光素酶表达活性, 从而得到化合物的量效关系曲线 (图 2)。结果显示, E40071在模型上的EC₅₀值为2.73 μmol·L^-1, 最大上调活性为160%。

Figure 2

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Figure 2 Dose-response curves for E40071 in Log scale. The cells were seeded in 96-well plates (5×104 cells/well) for 24 h and then treated with different concentrations of E40071 for 24 h. n = 3, x±s

为排除化合物可能的细胞毒性, 利用MTT比 色法检测E40071在0～100μmol·L^-1内对MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞存活与生长的影响 (图 3)。结果表明, E40071在0～100 μmol·L^-1内无明显细胞毒性。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Effects of E40071 on cell viability. The MC3T3-E1 (subclone 14) cells were treated with various E40071 concentra­tions and cell viability was assessed by MTT (3-(4,5-dimethyl­thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. n = 3, x±s

Runx2是调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录因子, 对于成骨细胞分化具有重要作用。同时, Runx2参与调控成骨细胞分化进程中细胞外基质蛋白的基因表达, 对成骨细胞发挥功能起到了重要的作用^[7]。Osx特异性地表达于骨中, 在Runx2下游发挥调控成骨分化的作用, 在胚胎形成期、出生后分化调控以及骨细胞的分化与功能方面均起到重要的作用^{[7, 8]}。实时荧光定量PCR结果表明, E40071能够上调MC3T3-E1(subclone 14) 细胞中成骨分化相关基因BMP2、Runx2和Osx的mRNA表达, 且在0.01 μmol·L^-1浓度下, 能够同时上调这3种基因的mRNA表达水平 (图 4A)。Western blot结果显示, E40071能上调BMP2和Runx2蛋白水平的表达, 并呈现一定 的剂量依赖性, 在1～10 μmol·L^-1下, 能够明显提高Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平 (图 4B和4C)。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Effects of E40071 on osteoblast marker genes expres­sion. The MC3T3-E1 (subclone 14) were treated with E40071 for 24 h. A: mRNA expressions of BMP2, Runx2 and Osx were determined by Real-time quantitative PCR analysis. B: BMP2, Runx2 and p-Smad1/5/8 were detected by Western blot analysis. Relative gene expression was normalized to GAPDH expression. C: Grayscale scanning. n = 3, x±s. P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

不同浓度E40071作用MC3T3-E1 (subclone 14) 12天后, ALP活性检测结果表明, E40071在0.01～10 μmol·L^-1内对MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞ALP活性均有一定的上调作用, 其中在0.1 μmol·L^-1下, 上调作用最为明显, 达到150% (图 5)。利用茜素红对0.1 μmol·L^-1 E40071作用下产生的钙化结节进行染色。结果显示, 加入含0.1 μmol·L^-1 E40071成骨分化培养基作用21天后, 矿化结节的形成增加, 表明其具有促进成骨分化的作用 (图 6)。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Effect of E40071 on osteoblast differentiation in MC3T3-E1 (subclone 14) cells. Measurement of alkaline phos­phatase (ALP) activity in MC3T3-E1 (subclone 14) cells. The cells were cultured in osteogenic medium and treated with E40071 for 12days. ALP activity was normalized with respect to total protein concentration. n = 3, x±s. P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Osteoblastic mineralization assay. MC3T3-E1 (subclone 14) cells were cultured in osteogenic medium, and treated with 0.1 μmol·L-1 E40071 for 21 days. Mineralization deposits were visualized by Alizarin red S staining. a: Blank (cells only); b: E40071 (0.1 μmol·L-1)

为评价E40071对破骨细胞分化的影响, 用含50 ng·mL^-1 RANKL的破骨分化培养基对Raw264.7细胞进行诱导, 3天后换为含不同浓度E40071的破骨分化培养基, 持续作用3天后进行TRAP染色。镜下观察发现, 加入各浓度E40071后, 破骨细胞减少 (图 7A)。对多核TRAP阳性细胞进行计数后, 结果表明, 仅在RANKL诱导下, 多核TRAP阳性细胞数为300个, 而当加入10 μmol·L^-1 E40071作用后, 破骨细胞明显减少至180个, 表明E40071能够明显抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成 (图 7B)。同时, 通过对破骨细胞分化标志MMP9 (matrix metalloproteinase-9) 和NFATc1 (nuclear factor of activated T cells c1)^[9]的表达水平进行检测, 结果表明, E40071能够明显降低MMP9和NFATc1的表达水平, 且在10 μmol·L^-1下最为明显 (图 7C和7D)。

Figure 7

Figure 7

Figure 7 Effects of E40071 on RANKL-induced osteoclast differentiation in RAW264.7 cells. A: Osteoclast differentiation was assessed by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)staining. RAW264.7 cells were incubated with (+) or without (-) RANKL (50 ng·mL-1) for stimulation of osteoclast differentiation. a: Blank (cells only); b: Control (RANKL 50 ng·mL-1); c: RANKL (50 ng·mL-1) + E40071 (0.01 μmol·L-1); d: RANKL (50 ng·mL-1) + E40071 (0.1 μmol·L-1); e: RANKL (50 ng·mL-1) + E40071 (1 μmol·L-1); f: RANKL (50 ng·mL-1) + E40071 (10 μmol·L-1). Magnification, 200×. B: RAW264.7 cells were differentiated into TRAP-positive osteoclasts after 3 days of RANKL (50 ng·mL-1) stimulation (middle). The number of TRAP-positive osteoclasts was decreased by treatment of E40071 (10 μmol·L-1) (right). RAW264.7 cells without RANKL were treated with DMSO as control (left). C: Protein levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and nuclear factor of activated T cells c1 (NFATc1) protein levels were quantified by Western blot analysis. D: Grayscale scanning. n = 3, x±s. P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

目前临床上治疗骨质疏松主要使用雌激素受体调节剂、双膦酸盐和降钙素等骨吸收抑制剂, 但是 这些药物只能抑制骨吸收, 不能促进骨形成。重组人甲状旁腺激素-特立帕肽作为唯一的促进骨形成剂 已应用于临床, 虽然疗效较好, 但其有诱发骨肉瘤的风险^[10]。因此, 寻找能够促进骨形成, 并抑制骨吸收的新药具有重要的研究意义。

BMP2是成骨细胞分化的重要调节因子^[4], 通过激活Smad信号传导和调节成骨基因转录而发挥其成骨作用^[11]。本研究利用实验室前期构建的BMP2表达上调剂高通量筛选模型, 对国家新药 (微生物) 筛选实验室化合物库进行了近20 000样次筛选, 为了提高初筛阳性率, 将初筛浓度由常用的10 μg·mL^{-1 [12]}提高至0.1 mg·mL^-1, 且本次筛选的20 000多个化合物分子量较小, 避免了大量高分子量化合物因为浓度过低而获得假阴性结果。通过筛选得到了20多个阳性化合物, 挑选其中一个阳性化合物E40071进行了系统的体外活性研究。毒性实验表明, E40071在0～100 μmol·L^-1内无明显细胞毒性, 为进一步的体外活性研究提供了可能。本研究考察了E40071对MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞成骨分化相关基因的mRNA与蛋白水平表达的影响, 结果表明, E40071能上调BMP2及其下游特异性转录因子Runx2、Osx的mRNA表达, 并通过促进Smad1/5/8蛋白磷酸化, 上调Runx2蛋白的表达。提示E40071能通过调节成骨分化的基因表达起到促进成骨分化的作用。

ALP是成骨细胞早期分化的指标^[13], 是常用的检测骨代谢活性的标志性指标^[14]。ALP活性实验结果表明, E40071对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1(subclone 14) ALP活性具有一定的上调作用, 能够 促进MC3T3-E1 (subclone 14) 细胞的早期分化, 且在0.1 μmol·L^-1下效果最明显。钙化结节是成骨细胞晚期分化的指标^[15], 通过对成骨样细胞钙化结节的诱导及茜素红染色来分析成骨细胞晚期分化的情况。结果表明, 0.1 μmol·L^-1的E40071能够促进成骨细 胞矿化结节的形成。上述两个体外活性实验均表明, E40071在体外具有较好的促进成骨细胞分化和促进骨形成作用。

破骨细胞主要分布于骨表面, 特异性表达TRAP, 可分泌蛋白酶及酸性物质溶解骨质。在RANKL存在的条件下, 小鼠巨噬细胞能够被诱导为破骨细胞, 因此, 可以此为模型来研究破骨分化^[16]。为了进一步 考察化合物对破骨分化的影响, 本研究利用TRAP 染色检测E40071对破骨细胞分化的作用, 结果表 明E40071能够抑制RANKL诱导的小鼠巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞, 同时能够降低破骨细胞分化标志MMP9和NFATc1蛋白的表达水平。以上结果表明, E40071在体外具有抑制破骨细胞分化的活性。

成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收动态平衡对维持生理状态骨代谢平衡具有关键作用。一旦骨重 建的平衡失调, 会导致全身骨量降低, 骨组织超微结构破坏和骨脆性增加, 这是骨质疏松疾病的主要病理机制。因此, 提高成骨细胞分化活性同时降低破骨细胞的活性, 是预防和治疗骨质疏松的重要靶点。本实验结果提示E40071可能通过影响成骨细胞与破 骨细胞的活性, 起到调节骨代谢平衡的作用, 为预防与治疗骨质疏松提供基础。但具体机制还需要进一 步研究。

综上所述, 利用BMP2表达上调剂筛选模型筛选得到E40071, 在体外同时具有较好的促进成骨细胞分化作用与抑制破骨细胞分化的活性, 能够改善骨代谢平衡, 为开发新型抗骨质疏松药物提供了实验依据。