药学学报  2016, Vol. 51 Issue (3): 380-387   PDF    
基于网络药理学的元胡止痛滴丸治疗原发性痛经的作用机制研究
韩彦琪1,2,3, 许浚1,2,3, 张喜民4, 张铁军1,2,3 , 任一杰4, 刘昌孝1     
1. 天津药物研究院, 天津 300193;
2. 天津市中药质量控制技术工程实验室, 天津 300193;
3. 中药现代制剂与质量控制技术国家地方联合工程实验室(天津), 天津 300193;
4. 甘肃陇神戎发制药有限公司, 甘肃兰州 730101
摘要: 探究元胡止痛滴丸治疗原发性痛经的多成分、多靶点、多途径作用机制,建立其"化合物-靶点-通路-疾病"的网络药理研究模式。针对元胡止痛滴丸中28个入血成分(22个原型化合物及6个代谢产物),利用PharmMapper服务器建立化合物-靶蛋白网络,通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库对获取的靶点进行相关通路分析,最后利用Cytoscape软件构建元胡止痛滴丸的"化合物-靶点-通路-疾病"网络图。预测实验表明, 28个入血成分的作用靶点约为109个,共涉及通路111条,其中52个靶点蛋白和31条通路与原发性痛经相关。元胡止痛滴丸可能通过作用于和激素调节、中枢镇痛、解痉、炎症及免疫相关的蛋白靶点及通路,起到治疗原发性痛经的作用。
关键词: 反向分子对接     网络药理学     元胡止痛滴丸     原发性痛经     作用机制    
Network pharmacology-based study on mechanism of Yuanhu Zhitong Dropping Pills in the treatment of primary dysmenorrhea
HAN Yan-qi1,2,3, XU Jun1,2,3, ZHANG Xi-min4, ZHANG Tie-jun1,2,3, REN Yi-jie4, LIU Chang-xiao1     
1. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China;
2. Tianjin Engineering Laboratory of Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;
3. National and Local United Engineering Laboratory of Modern Preparation and Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine(Tianjin), Tianjin 300193, China;
4. Gansu Longshenrongfa Pharmaceutical Co., Ltd., Lanzhou 730101, China
Abstract: This study was designed to explore the mechanism of Yuanhu Zhitong Dropping Pills (YHZT) in the treatment of primary dysmenorrhea by pharmacological network technology and establish a research approach of "Compound-Target-Pathway-Disease" network. Twenty-eight compounds absorbed into blood including 22 prototype and 6 metabolites of YHZT were submitted to PharmMapper and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) bioinformatics softwares to predict the target proteins and related pathways respectively. The network of "Compound-Target-Pathway-Disease" was constructed and analyzed using Cytoscape software. The in silico prediction results showed that the 28 constituents of YHZT affected 111 pathways through 109 target proteins. Among them, a total of 52 proteins and 31 pathways were related to the primary dysmenorrhea. The effect of YHZT on primary dysmenorrhea may be dependent on regulation of the proteins and pathways related with hormonal regulation, central analgesia, spasmolysis, inflammation and immunoregulation.
Key words: reverse molecular docking     network pharmacology     Yuanhu Zhitong Dropping Pills     primary dysmenorrhea     mechanism    

原发性痛经, 指非盆腔器质性病变引起的痛经, 为内分泌功能失调所致, 症见下腹及腰部痉挛性疼痛, 严重时伴随头痛、恶心、呕吐、腹胀、腰酸和腿痛等。流行病学研究表明痛经是目前妇科最常见疾 病, 运用不同的调查方法, 其发病率在20%~90% 之间, 为影响妇女正常工作和生活质量的常见原因。其发病率高、波及范围广及造成的经济损失、社会危害引起了全世界范围的广泛关注[1]。原发性痛经发病因素复杂, 其主要发病机制是前列腺素和白三烯的增高, 病理改变为子宫平滑肌和子宫壁螺旋动脉强烈收缩、缺血和缺氧[2]

元胡止痛滴丸为中医传统组方药, 由延胡索 (醋制) 和白芷两味药材组成, 主要功能为理气、活血、止痛, 临床用于气滞血瘀的胃痛、胁痛、头痛及痛经等。前期化学成分和药理作用研究[3, 4, 5, 6, 7]表明, 元胡止痛滴丸主要含有生物碱类和香豆素类成分, 对痛经模型动物镇痛作用明显, 对大鼠离体子宫收缩有解痉作用, 是主要的药效物质基础。Liu等[8]研究发现, 延胡索白芷配方药液镇痛效果显著, 对外周血中前列腺素、单胺类及β-内啡肽有显著影响, 其作用有多靶点的特点。Chen等[9]发现, 元胡止痛片对痛经大鼠的镇痛效果可能为延胡索乙素和欧前胡素的协同作用, 其机制可能是通过减少氧化应激, 抑制过度炎症反应以及通过抑制胞外Ca2+内流来缓解离体大鼠子宫平滑肌的痉挛。虽然目前对元胡止痛方的药理研究已有较多报道, 但针对元胡止痛滴丸多成分、多靶点及多途径治疗原发性痛经的作用机制研究仍不够系统和全面。

网络药理学以高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索为基础, 运用网络建模和网络分析等手段来预测不同节点与属性间的相关性, 是近年来的新兴学科[10, 11]。与传统药理方法的耗时多、产出少、研究不全面的特点相比, 网络药理学融合了系统生物学和多向药理学的思维, 整合生物学网络与药物作用网络, 超越单靶点思想的束缚, 从多靶点的研究策略出发, 分析药物在网络中与节点或网络模块的关系, 实现药物作用的综合网络分析[12]。网络药理学已被应用到生命科学的众多领域, 其中以分子对接、药物-靶点构建及网络特征分析为基础的多靶点网络调控的研究模式被逐渐用于中药主要活性成分、潜在靶点群的预测和中药作用机制的阐 述[13, 14]。故在本研究中, 作者尝试以网络药理学的方法对元胡止痛滴丸入血成分治疗原发性痛经的作用机制进行全面探究, 构建其“化合物-靶点-通路-疾病”的网络药理图, 为后续实验研究提供理论依据。

材料与方法

实验材料 ChemBioOffice2010; PharmMapper服务器(http://59.78.95.61/pharmmapper/); UniProt数据库 (http://www.uniprot.org/); 生物分子功能注释系统 (Molecule Annotation System, MAS 3.0) 数据库 (http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/); 京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 通路数据库 (http://www.genome.jp/kegg/); Cytoscape2.6.0软件。

实验研究思路

本实验关于元胡止痛滴丸治疗原发性痛经的网络药理学实验思路示意图见图 1

Figure 1 The schematic map of the network pharmacology
目标化合物的选取

中药发挥药效作用的物质基础是化学成分的组合, 中药中虽有众多成分, 但只有被吸收入血的成分才能产生作用。因此, 基于绝大多数药物在动物体内起作用必须被吸收进入血液这一原理, 在网络药理学实验研究中, 即以元胡止痛滴丸中的入血成分为研究对象。通过整合本课题组前期关于元胡止痛滴丸入血成分实验研究结果及查阅相关文献[15, 16, 17, 18], 确定了延胡索中10个生物碱类入血原型成分 (原小檗碱型: 延胡索乙素、延胡索甲素、去氢延胡索甲素、小檗碱、四氢小檗碱、巴马汀、黄连碱; 阿扑啡型: d-海罂粟碱; 原托品碱型: 原阿片碱、α-别隐品碱) 及白芷中12个香豆素类入血原型成分 (欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、8-甲氧基异欧前胡内酯、白当归素、白当归脑、佛手柑内酯、花椒毒素、补骨脂素、茴芹内酯、蛇床子素、东莨菪素) 和6个代谢物 (M1~M6), 共28个目标化合物进行实验研究。化合物具体信息见表 1

Table 1 Detail information of 28 compounds. Source 1: Corydalis yanhusuo W. T. Wang; 2: Angelicae dahuricae Radix; 3: Tetrahy­droberberine; 4: Tetrahydropalmatine; 5: Oxypeucedanin; 6: Protopine
元胡止痛滴丸入血成分的潜在靶点预测

使用ChemBioOffice2010软件绘制28个入血成分的 结构, 将其存为MDL sdf. 格式, 并导入PharmMapper服务器进行潜在靶点的预测分析, 参数设置如下: Generate Conformers: Yes; Maximum Generated Con­formations: 100; Select Target Set: Human Protein Target Only; Number of Reserved Matched Targets: 100。PharmMapper服务器采用反向分子对接的方法, 以活性小分子为探针, 通过对Targetbank、Drugbank、Binding DB和PDTD四大数据库[19, 20]进行快速检索而获得化合物的靶点信息, 并根据匹配结果的相似度进行打分和排序。但由于此服务器检索得到的蛋白靶点命名存在部分不规范问题, 故需将检索结果进一步输入UniProt数据库得到靶点蛋白的官方命名。通过本部分操作, 可建立“化合物-靶点”信息网。

相关通路获取及分析 本实验将获取的靶点蛋白信息导入MAS 3.0数据库, 即可得到靶点的相关通路信息。参数设置如下: Species: Homo sapiens (Human); Molecule Type: Protein; Database Symbols: GenBank ACC; Functions: Gene, mRNA, Protein, Pathway; Regulation Threshold: Up 2.0, Down 0.5。另外, KEGG包含的通路数据库储存了基因功能的相关信息, 通过图形来表示细胞内的生物学过程。利用此数据库可以对由MAS 3.0得到的通路进行注释及分析。

元胡止痛滴丸“化合物-靶点-通路-疾病”网络的构建 以选取的28个入血成分、预测出的作用靶点、作用通路以及通路注解和对应疾病5个方面为节点 (node), 在Excel表格中建立彼此对应关系, 之后导入到Cytoscape 2.6.0软件, 用Network Analyzer插件构建并分析元胡止痛滴丸“化合物-靶点-通路-疾病”的网络药理图[21]。若其中某一靶点为某一化合物的潜在作用靶点, 则二者以边 (edge) 连接起来。节点间的连接原则为当化合物作用靶点与作用通路的相关靶点相同, 则将化合物与作用通路以边关联起来。通过建立化合物-蛋白-通路、化合物-蛋白-化合物、蛋白-化合物-蛋白、通路-蛋白-通路、蛋白-通路-蛋白等5种连接, 构建全面完整的网络图。在建立网络药理图的基础上, 通过网络分析, 探究元胡止痛滴丸28个入血成分的多靶点多通路的治疗作用。

结果 1 元胡止痛滴丸潜在作用靶点分析

通过PharmMapper服务器反向分子对接实验, 预测出了28个入血成分的作用靶点为109个, 其中与原发性痛经相关的靶蛋白有52个 (表 2), 共出现频数为371次。对化合物-靶点网络的总体特征分析发现, 28个入血成分中既存在一个化合物与多个蛋白靶点结合的作用, 同时也存在多个化合物与同一个靶蛋白作用的现象, 表明元胡止痛滴丸的多活性成分、多靶点的作用特点。对预测得到的52个靶蛋白进一步分析发现, 脑啡肽酶 (MME)、单胺氧化酶B (MAOB) 与中枢镇痛相关; 纤维母细胞生长因子受体1 (FGFR1)、一氧化氮合酶 (NOS3)、转化生长因子β-2 (TGFB2)、黏着斑激酶 (PTK2) 等与平滑肌痉挛相关; 17β-雌二醇脱氢酶1 (HSD17B1)、雌激素受体磺基转移酶 (SULT1E1)、雌激素受体 (ESR1)、性激素结合球蛋白 (SHBG) 等与激素调节相关; 白三烯A4水解酶 (LKHA4)、组胺N-甲基转移酶 (HNMT)、造血前列腺素D合成酶 (PTGD2)、白细胞介素-2 (IL2)、NOS3等与炎症相关; 双特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶1 (MAP2K1)、糖原合成酶激酶3β (GSK3B) 等与免疫相关。据此推测, 元胡止痛滴丸可能通过与中枢镇痛、激素调节、平滑肌痉挛、抗炎和免疫等相关靶蛋白结合起到治疗原发性痛经的作用。

Table 2 Information of 52 related protein targets
2 元胡止痛滴丸潜在靶点的作用通路注释及分析

将预测出的靶点通过MAS 3.0及KEGG进行 通路注解及分析, 得到111条作用通路, 31条与原 发性痛经相关 (表 3)。其中与激素调节 (hormonal regulation) 相关通路有6条, 包括雄激素雌激素代谢、促性腺激素释放激素信号通路、视黄醇代谢、C21甾类激素代谢、肾素血管紧张素系统和酪氨酸激酶信号通路。与中枢镇痛 (central analgesia) 相关通路有6条, 包括刺激神经组织的配体-受体相互作用通路、轴突导向、Wnt信号通路、钙离子信号通路、转化生长因子-β和氮代谢。与平滑肌解痉 (spasmolysis) 相关通路有12条, 包括黏着斑、过氧化物酶体增殖体激活受体、血管内皮生长因子、缝隙连接、黏着连接、紧密连接、肌动蛋白细胞骨架调节、表皮生长因子受体、肾素血管紧张素系统、转化生长因子-β、丝裂原活化蛋白激酶和钙离子信号通路。与炎症(inflammation) 相关通路有7条, 包括丝裂原活化蛋白激酶、Toll样受体、血管内皮生长因子、Fc epsilon受体I、花生四烯酸代谢、黏着斑和组氨酸代谢信号通路。与免疫调节 (immunoregulation) 相关通路有8条, 包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、T/B细胞受体、补体系统、自然杀伤、转化生长因子-β、酪氨酸激酶信号通路和抗原加工与转运信号通路。

Table 3 Information of 31 related pathways

利用Cytoscape软件建立了元胡止痛滴丸的“化合物-靶点-通路-疾病”网络图 (图 2)。直观地呈现了28个化合物、52个靶蛋白、31条作用通路、5种作用途径和原发性痛经疾病间的关联。

Figure 2 The “Compound-Target-Pathway-Disease” network of Yuanhu Zhitong Dropping Pills (YHZT)
讨论

通过对元胡止痛滴丸“化合物-靶点-通路-疾病”网络进行分析发现, 方中生物碱和香豆素两大类成分均作用于多个靶点和通路, 体现出复方制剂多成分、多靶点、多通路整合调节的作用特点。两类成分既有共同的作用靶点群及通路群, 又各有偏重, 通路涉及激素调节、中枢镇痛、解痉、炎症及免疫等各个环节, 各通路群间通过共有靶点连接, 显示出不同成分间的多靶点协同作用。

从网络分析结果来看, 延胡索生物碱 (延胡索乙素、延胡索甲素和四氢小檗碱) 和白芷香豆素 (氧化前胡素和欧前胡素) 都偏重于与磷脂酶A2、造血前列腺素D合酶、白三烯A4水解酶、白细胞介素-2和一氧化氮合酶等蛋白结合, 通过调节多条炎症相关通路来影响花生四烯酸的合成与代谢, 降低体内前列腺素 (PG) 等炎性因子的含量。大量研究已证明PG和白三烯 (LT) 的增高是原发性痛经的主要发病机制[2, 22, 23]。另有报道, 白芷的醋酸乙酯部位具有抑制NO、PGE2和iNOS生成的作用; 欧前胡素能抑制花生四烯酸代谢产物的产生而达到抗炎效果; 延胡索乙素可以通过调节MAPK信号通路抑制炎症介质的分泌, 起到抗炎作用[24, 25]。综合这些结果, 部分印证了本研究的网络预测结果, 因此推测止痛功效与炎症通路相关。

脑啡肽是一种内源性阿片肽, 广泛分布于外周和中枢神经系统, 是中枢神经系统重要的镇痛介质。但由于脑啡肽在体内易被酶解失活, 使其在大脑组织中的镇痛作用时间十分短暂, 其中脑啡肽酶和氨肽酶是主要的脑啡肽降解酶[26]。反向对接实验结果表明, 与白芷中的香豆素类成分相比, 延胡索中的生物碱类化合物如四氢小檗碱、延胡索甲/乙素、巴马汀、原托品碱和别隐品碱等更倾向于与脑啡肽酶结合, 参与中枢镇痛相关通路。而香豆素类成分如氧化前胡素、补骨脂素等则更侧重于调节与平滑肌痉挛有关的信号通路。据此推测, 元胡止痛滴丸可能是通过生物碱类成分的中枢镇痛作用和香豆素类成分的解痉作用而达到治疗原发性痛经的效果。

原发性痛经与月经周期中的性激素变化密切相关。前列腺素在原发性痛经的形成中起到至关重要的作用, 而其生成却受性激素的调节。黄体中期雌激素高峰促进月经前期子宫内膜PGF2α生成增加; 孕激素可以促进雌二醇 (E2) 转化为无活性的雌酮, 从而减少前列腺素的生成, 降低子宫平滑肌舒缩活性而缓解原发性痛经[27, 28]。网络药理结果表明, 生物碱及香豆素类化合物都能较好地与雌激素受体磺基转移酶、性激素结合球蛋白、雌激素受体等蛋白结合, 参与雄激素雌激素代谢、促性腺激素释放激素通路、C21甾类激素代谢等激素调节通路, 进而起到缓解原发性痛经症状的作用。

在对潜在作用靶点的通路注释中发现, 延胡索生物碱类化合物和白芷香豆素类化合物都能作用于和免疫调节相关的通路,如T细胞受体、B细胞受体、补体系统、自然杀伤和抗原加工与转运等信号通路, 所以推测元胡止痛滴丸可能会通过增强机体免疫起到辅助治疗作用。但关于此方面的研究还鲜有报道, 仍需后续实验的进一步验证说明。

在本研究中, 以复方中药元胡止痛滴丸28个入血成分为研究对象, 通过网络药理学的手段分析了上述成分可能的作用靶点及作用途径。建立了一条“化合物-靶点-通路-疾病”的复方中药网络药理学的研究模式, 初步揭示了元胡止痛滴丸治疗原发性痛经的多维调控网络, 为下一步深入研究元胡止痛滴丸的作用机制奠定基础。

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