目前, 在多种中枢神经系统疾病的机制研究及其防治药物筛选中, 虽有较相似于人体疾病临床症状和病理特征的动物模型可供选择。但在研究细胞与细胞、细胞与胞外基质以及细胞与药物之间相互作用的深层机制时, 采用体外细胞模型更为方便和准确, 甚至某些实验需要在体外培养的细胞模型上才能进行观察。动物细胞的体外培养, 因能精确控制其理化环境, 模拟其在体病理状态, 具有样品均一性、重复性高和经济等优点, 并可实现规范化和规模化。因此, 原代或细胞系来源的神经元、胶质细胞和血管内皮细胞等脑组织细胞^[1], 已被广泛用于多种中枢神经系统疾病研究及其治疗药物筛选。

然而, 对中枢神经系统疾病所进行的体外研究, 大多局限于单细胞培养。比如: 用血管内皮细胞构建血脑屏障^[2], 用神经元损伤模拟脑卒中损伤^[3]。该类研究方式虽然取得了一定的研究成果, 但其脱离了细胞在体内与其他细胞之间相互作用和依存的环境, 其结果并不可靠或对所研究疾病的治疗并未具有实质性指导意义。正如过去50年大量的脑卒中研究采用单神经元保护实验, 其结果至今没有研究出临床上有效的神经保护剂^{[4, 5]}。

在生理和病理条件下, 体细胞之间以及细胞与胞外环境之间均具有复杂的相互作用。这使研究者逐渐意识到, 对疾病及其治疗药物的体外研究, 不能仅仅关注单细胞在体外的增殖和反应, 更重要的是要关注它们是否具有与在体相似的表型, 是否如在体一样具有与其他细胞或胞外环境共同参与对刺激的应答反应。后者对后续临床研究更有提示作用。为满足这一需求细胞共培养技术应运而生。细胞共培养体系较之单细胞培养物能更好地模拟体内环境, 更接近细胞在体性状, 便于观察细胞与细胞以及细胞与胞外环境之间的相互作用, 为疾病的分子机制研究和新药研发提供更好的体外实验技术平台。

细胞共培养是将两种或两种以上的细胞 (来自同一组织或不同的组织) 同时或先后培养在同一环境中, 使其在一定程度上相似于在体的形态结构与功能, 用于观察细胞之间的作用或者共同的作用。目前, 共培养的研究目的主要有以下几方面: ① 研究共培养体系中细胞间相互作用, 如观察星形胶质细胞的分泌物 (营养因子) 促进神经干细胞分化^[6]。② 研究共培养体系中细胞与胞外环境之间的相互作用。共培养细胞之间相互作用可促使胞膜分泌胞外基质, 其成分包括间质胶原、纤连蛋白、蛋白多糖或层黏连蛋白等, 这与细胞的体内微环境相似, 利于维持细胞的立体构型和促进细胞的功能表达, 便于观察细胞与胞外环境之间的相互影响。如将神经胶质瘤细胞与神经元共培养, 细胞相互作用后, 观察神经元对胶质瘤细胞纤维连接蛋白表达的影响^[7]。③ 将共培养体作为一个模拟在体组织或器官的整体模型, 用于复杂疾病的机制研究及其防治药物研发中的效果观察。在模拟的病理损伤条件下, 研究共培养模型中细胞的应激反应以及细胞与细胞之间、细胞与胞外环境之间的相互作用及其与在体相似性, 并进一步用于深入的疾病机制研究, 以及观察药物作用于细胞的效果, 进行治疗药物的初步筛选^[8]。

二维共培养是将两种或两种以上细胞种植在同一界面上直接接触共培养; 或在不同界面上单独培养, 然后通过培养液发生相互作用。

① 直接混合共培养。在一定条件下, 将两种或两种以上细胞按一定比例混合后直接培养在同一界面上。如采用出生24 h内的大鼠大脑皮层神经元和胶质细胞进行混合培养。纯化两者比例接近1：1, 模拟体内神经元与胶质细胞共生状态, 探讨神经系统疾病的发病机制和相关药物研究中细胞之间相互作用^[9]。也有研究运用小鼠皮层原代神经元与胶质细胞1：1的比例混合培养, 比较给予白细胞介素33 (IL-33) 对混合共培养和单独培养的神经元分别作用, 发现共培养体中神经元死亡率显著高于单独培养, 其机制为IL-33刺激神经胶质细胞释放炎症介质所致, 而IL-33对于单独培养神经元没有影响^[10]。上述培养方式可反映两种细胞之间的动态交互作用和影响, 可用于研究相互作用密切的两种细胞。但在研究一种细胞使另外一种细胞发生细胞器功能变化或分泌型物质表达变化时, 由于无法将两种细胞分开, 存在不能准确定位的问题。② 滋养层共培养。将一种细胞培养在生长介质上, 当其生长到一定密度时, 再将另一种细胞接种到该细胞层上面共培养。Shi等^[11]用原代培养的大鼠海马神经元种植在预先培养好的皮层星形胶质细胞层上, 观察到共培养的神经元状态较佳, 存活时间长, 突触前结构发育良好。还有研究将大鼠原代皮层神经元接种于培养瓶中, 再将纯化后的小胶质细胞接种于神经元上, 二者共培养24 h后, 给予炎症损伤, 观察到小胶质细胞可以防止神经元细胞死亡^[12]。该培养方式可以很好地模拟细胞分布层次比较明确的在体组织, 但也存在由于无法将两种细胞分开而导致的不能准确定位及定量问题。

即在相同或不同培养环境下孵育两种或以上的细胞, 使细胞与细胞之间通过培养液发生相互作用。该共培养体系的建立主要有3种方式:

① 将一种细胞的培养上清液 (含有该细胞表达的多种生长因子或刺激因子) 用于培养另外一种细胞。如将原代神经元进行缺氧并复氧处理后, 收集不同时间的神经元培养液, 再与小胶质细胞共培养, 探讨不同的神经元损伤度对小胶质细胞表型的影响^[13]。另将星形胶质细胞与凋亡诱导的PC12细胞共培养 后, 收集共培养的上清液, 观察对骨髓基质细胞 (BMSCs) 向神经元分化的影响^[14]。有研究者在运用脂多糖 (LPS) 作用鼠性神经小胶质细胞株BV-2后, 取不同时间点的上清液与大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞共培养, 探讨小胶质细胞在炎症刺激下分泌的细胞因子对神经细胞凋亡的影响^[15]。这种培养方式属于单向作用的非接触式共培养, 可反映细胞在特定条件下的定向反应, 可以进行定位和定量分析。但是只适用于观察某种状态下细胞的旁分泌作用, 不能反映细胞相互之间的动态交互作用。

② 将培养有一种细胞的玻片放入培养有另一种细胞的培养皿中共培养。将贴有胶质细胞的盖玻片放入生长有海马神经元的培养皿中, 并通过硫铵素缺乏条件培养基培养, 比较单独培养和与胶质细胞共培养的海马神经元存活情况。结果发现, 单独培养的神经元细胞在硫铵素缺乏第7天死亡率为50%, 而与胶质细胞共培养的神经元完全无死亡且轴突生长锥形态完整^[16]。Rathinam等^[17]将星形胶质细胞培养玻片置于含有神经元的孔中共培养, 研究鱼藤酮和百草枯对神经元细胞损伤时星型胶质介导的神经保护作用。结果表明, 与星形胶质细胞共培养时神经元的凋亡可被阻止, 并发现星形胶质细胞介导的神经保护作用是依赖于谷氨酸循环。这种培养方式的两个细胞之间存在着分泌因子的动态交互作用, 也可以将细胞准确分开, 利于定位和定量研究。但是, 由于细胞间没有直接接触, 对于一些需要细胞之间接触才能表达的功能则无法进行, 如观察星形胶质细胞和神经元突触之间的连接功能则无法采用这样的方式进行研究。

③ 细胞transwell小池插入式共培养。这种共培养研究是现代体外模型研究中运用比较广泛的。在 比较神经元和星形胶质细胞的3种共培养方式对神经元纯度影响时发现, 将神经元接种在培养板孔底, 同时将星形胶质细胞培养在transwell小池微孔膜上所培养的神经元纯度高, 且操作简单^[18]。另有研究表明, 将大鼠原代雪旺细胞 (SCs) 与脂肪来源干细胞 (ADSCs) 按2：1比例于transwell共培养小池中共培养, 与单纯培养的脂肪来源干细胞相比较, 发现共培养1天即可观察到ADSCs向神经元样细胞形态改 变, 胞体变小且有多个神经细胞样突起; 同时SCs也发生形态变化, 细胞体积增大、周围突起增多且变粗大^[19]。此方法诱导效率高, 能刺激干细胞向神经元样细胞分化, 可为神经构建提供种子细胞来源。该培养方式与上述②描述的培养方式本质类似, 细胞间同样无法实现直接接触; 但若选用合适孔径的transwell小池, 该方式亦可用于观察一些趋化因子对细胞迁移的诱导作用。

三维细胞培养是指将不同谱系的细胞, 种植在具有三维结构的不同材料载体上共同培养, 细胞之间可以直接接触, 能够在三维立体空间结构中形成迁移、生长, 构成三维的细胞-载体复合物^[20]。所培养的细胞具有更多在体的整体功能或反应。目前, 三维共培养系统的构建主要有以下几种方式:

该培养方式是将细胞培养在三维结构的生物载体^[21] (如明胶蛋白、凝胶、琼脂和塑料毛细纤维管) 上并保持较高密度, 使其形成组织类聚集物。目前, 该类共培养涉及的技术较多, 包括凝胶和海绵技术、中空纤维、球体、转动室系统、藻酸盐活细胞固定术、滤膜培养皿以及神经聚集物培养技术等。Cucullo等^[22]将成人脑微血管内皮细胞系和星形胶质细胞系先后种植在改变了孔隙的中空纤维 (包被了基质的一种三维纤维管) 中, 建立血脑屏障炎症模型, 验证了免疫细胞在炎症状态下可透过血脑屏障。将PC12和SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤系) 共培养在转动室系统 (包被了基质的一种液流控制系统) 中, 并模拟微重力环境, 观察到神经细胞株突触的伸长率小于静态培养, 表明微重力条件培养利于维持细胞的低分化特性^[23]。Nishitsuji等^[24]将原代培养的周细胞和血管内皮细胞接种在transwell小池微孔膜 (两侧包被了基质的一种通透性薄膜) 的两侧共培养, 用以模拟血脑屏障并观察载脂蛋白E对其屏障功能的影响, 发现载脂蛋白E以一种独立的方式调节屏障的紧密连接形成。该类培养方式既可以同时观察细胞通过旁分泌和直接接触的两种方式形成的交互作用和动态变化, 也可以将生长在不同界面的细胞分开, 满足定位和定量研究需要。

器官型共培养是按照细胞在体分布特点, 将不同种类细胞培养在适宜的三维载体上, 用以构建与在体组织相似的组织等同培养物。该类共培养利于形成与在体相似的结构性微环境, 保持细胞的极性和生长分化特性, 便于观察可扩散的旁分泌及信号转导等细胞间的相互作用, 正广泛应用于软骨、骨骼肌、韧带、血管、肝和膀胱等不同部位组织的代用品构建^{[25, 26]}。目前, 用于器官型共培养的三维载体主要有组织工程性构建物和微孔滤池两大类。以组织工程性构建物作为载体的三维共培养, 是将可相互作用的细胞按一定比例和顺序种植在经过基质处理过的可降解生物支架内, 形成具有相似于在体结构和功能的组织。在研究施万 (Schwann) 细胞对神经轴突的体外修复作用中发现, Schwann细胞在经过纤连蛋白处理的海藻酸盐凝胶支架中, 能促进损伤坐骨神经的神经再生^[27]。滤池技术是依据细胞在体分布结构, 将相互作用的不同类型细胞按一定比例和顺序, 种植在与培养板配套的transwell小池微孔膜上下界面和培养板孔底, 构建与在体结构和功能相似的组织或器官。有人采用被广泛用于构建血脑屏障模型的transwell小池, 将原代培养的大鼠大脑皮层3种细胞种植在不同界面 (将神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞分别种植在培养板孔底、微孔膜下侧和微孔膜上侧), 构建了模拟脑神经血管单元的体外模型^[8]。并发现, 所建立的三细胞共培养体系细胞之间具有明显的相互促进生长的整体协同效应, 具有与在体“脑神经血管单元”相似的部分生理功能; 在缺氧复氧损伤条件下, 该共培养体系具有类似于在体脑组织细胞之间相互保护、抵御损伤的功能。

中枢神经系统是人体最重要、最复杂的系统, 主导并协调其他系统的功能发挥及配合。该系统的功能紊乱或障碍往往导致严重的疾病, 甚至致残或死亡, 而且其病因和病理机制是复杂多样的。越来越多的研究者致力于从多角度研究该系统的多种疾病, 组织细胞的体外共培养技术因而在中枢神经系统生理、病理研究及其疾病防治药物研发中的作用日显突出。

缺血性脑卒中是指因脑部血液循环障碍, 缺血、缺氧所致的局部脑组织坏死或软化, 其在脑卒中疾病中所占比例为87% 左右^[28]。除极少数在发病3 h内给予重组组织纤溶酶原激活剂的缺血性脑卒中患者有效外, 至今尚无有效的治疗方法。导致该困境的主要原因是脑卒中的病理机制涉及能量障碍、兴奋中毒、炎症反应、氧化损伤、离子失衡、梗死周围去极化及程序性细胞死亡等多个方面^{[29, 30]}, 而且这些影响因素交互作用, 共同损害大脑的多种细胞成分^{[31, 32]}。

缺血发生时, 梗死中心区组织细胞在短时间内坏死, 而半暗带区的大量细胞则在较长时间内持续性凋亡^[33], 因此, 抑制半暗带细胞凋亡成为缺血性脑卒中治疗策略之一。将PC12细胞给予氯化钴 (CoCl₂) 损伤后, 与骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs) 以不同的比例直接混合培养, 观察PC12细胞的凋亡率。结果表明, BMMSCs能抑制CoCl₂损伤诱导的PC12细胞凋亡, 且其保护机制可能与上调促红细胞生成素表达有关^[34]。此共培养模型为将BMMSCs应用于脑卒中后期的半暗带损伤修复治疗提供了实验依据。但该培养模型使用PC12细胞为肾上腺嗜咯细胞瘤株, BMMSCs细胞也非脑组织细胞, 而且采用CoCl₂损伤; 这与脑卒中缺血时损伤的机制及其细胞受损的实际状态有较大差异。

缺血性脑卒中发生时, 会导致兴奋性氨基酸在细胞外蓄积, 从而对神经元产生毒性导致其凋亡^[35]。分别将原代星形胶质细胞、神经元单独培养以及用transwell小池将其共培养, 并结合使用谷氨酸盐抑制剂, 研究培养液中谷氨酸/谷氨酸盐的量。结果表明, 只有将星形胶质细胞与神经元共培养时, 星形胶质细胞才显现出谷氨酸盐清除作用, 神经元对谷氨酸毒性的敏感性才会增加; 这部分解释了神经元与星形胶质细胞在急性缺血性脑卒中过程中谷氨酸代谢和兴奋性毒性机制^[36]。该细胞模型为研究脑卒中急性期兴奋性氨基酸中毒机制提供了较好的体外模型。

血-脑屏障将脑内、外的血液循环选择性隔离, 并限制屏障外有害物质及大分子药物随血液进入大脑^[37]。脑缺血再灌注时, 氧化剂、蛋白水解酶、炎症因子释放, 影响内皮细胞紧密连接, 改变血脑屏障的通透性, 加重脑损伤^[38]。Kuhlmann等^{[39, 40]}分别用牛脑微血管内皮细胞或猪脑微血管内皮细胞与大鼠脑皮层星形胶质细胞共培养在transwell小池微孔膜不同界面模拟血脑屏障, 并用缺氧后再复氧处理模拟缺血再灌注损伤, 研究缺血再灌注损伤下血脑屏障通透性改变机制及药物作用靶点。该研究结果为急性脑卒中后溶栓治疗中保护血脑屏障的完整性提供了思路。但该培养方式中如能使用同种属动物的原代脑微血管内皮细胞和原代星形胶质细胞共培养, 其建立的模型更加适合有关血脑屏障功能方面的体外研究。

脑卒中的病理过程涉及多种机制导致的多细胞损伤, 体外模型也要求从多靶点、多途径研究发病机制。“脑神经血管单元”是在脑卒中防治过程中提出的、反映大脑结构和功能动态整体性的基本单位, 包括脑微血管 (内皮细胞、周细胞、基底膜)、胶质细胞、神经元以及胞外基质等组分^[41]。本课题组^[8]将原代培养的大鼠皮层星形胶质细胞接种于transwell小池 (具有物质通透性, 用于模拟替代微血管基底膜) 膜下侧、原代培养的大鼠皮层脑微血管内皮细胞接种于transwell小池膜上侧, 再与原代培养的皮层神经元共培养模拟“脑神经血管单元”, 并用氧糖剥夺再灌注损伤模拟在体的缺血再灌注损伤。结果发现, 3种细胞共培养后, 在正常培养和损伤处理过程中, 较之单细胞培养或者双细胞培养模型, 更具有类似于在体“脑神经血管单元”的主要细胞成分、基本生理功能及基本病理变化。该模型是目前涵盖大脑原代细胞种类最多的共培养模型, 除可用于研究脑卒中急性期病理变化之外, 在适当改变损伤条件基础上, 还可作为慢性缺血性脑卒中机制研究及其治疗药物筛选的体外工具。

帕金森病 (PD) 是较常见的与年龄相关的神经退行性疾病, 其已知病因还包括遗传因素、环境因素、氧化应激、线粒体功能障碍以及泛素—蛋白酶体功能异常等^{[42, 43]}。该病发病机制主要是: 黑质多巴胺能神经元丢失导致传入纹状体的多巴胺递质大量减少, 使乙酰胆碱作用相对增强而出现的一系列运动减少和肌张力增高症状^[44]。

多巴胺神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶 (MPTP), 多用于体内外多巴胺能神经元损伤模型^{[45, 46]}, 其在单胺氧化酶B的作用下代谢成MPP⁺, 后者被多巴胺能神经细胞摄取后形成自由基, 从而引起氧化应激增强和线粒体功能损伤, 造成神经细胞的死亡。采用神经胶质瘤细胞 (U87) 替代神经胶质细胞, 用SH-SY5Y细胞替代多巴胺能神经元, 将二者以1：1的比例混合共培养后, 用神经毒素MPTP处理24 h, 收集共培养细胞的条件培养 基用于培养免疫T细胞。结果表明, 在共培养条件下, 损伤的多巴胺神经元和神经胶质细胞可导致外周血T细胞的数目减少或抑制增殖的活性^[47]。该模型混合运用两种二维培养方式, 探讨帕金森疾病中病理状态下的神经元对外周免疫系统的影响。此模型可供研究细胞与细胞之间的相互作用, 及其旁分泌对微环境中其他细胞的影响, 可以用于多个机制的同时研究。

帕金森病理状态下, 炎症因子和其他毒性细胞因子释放, 可促进小胶质细胞活化和少部分星形胶质释放活性氧, 引起兴奋性毒性和氧化应激反应, 导致黑质多巴胺能神经元丧失; 同时, 胶质细胞又可以释放神经营养因子而对神经元起保护作用^[48]。Terashvili等^[49]将多巴胺神经元细胞系种植在原代海马星形胶质细胞层上面共培养时, 星形胶质细胞产生的花生四烯酸代谢物细胞色素P450表氧化酶和14,15-环氧二十碳三烯酸 (14,15-EET), 可保护由过氧化氢诱导的多巴胺神经元氧化应激损伤, 14,15-EET还可以增强细胞活力。这表明14,15-EET对多巴胺神经元具有保护作用, 提示可将其研发为帕金森病的新治疗药物。与上一种培养方式不同的是, 采用的原代细胞, 更能贴合体内研究来解释细胞间相互作用关系。

神经祖细胞能自我更新, 在外界因素的引导下分化为具有特定功能的神经细胞。有研究表明^[50], 多巴胺神经元定位在纹状体和中脑中形成。Liu等^[51]将纹状体细胞的条件培养液与人胎脑祖细胞在低氧下共培养, 发现人胎脑祖细胞分化为多巴胺神经元的阳性率增高。结果表明, 降低氧气浓度可以促进多巴胺神经元的生成。此模型应用原代人脑神经细胞, 与在体环境的研究最接近。从神经元的保护作用到神经元的再生, 也给中枢神经疾病研究带来新思路。

阿尔茨海默病 (AD) 是老年人常见的神经系统退行性疾病, 其病理特征为老年斑、神经元纤维缠结、神经元缺失、海马锥体细胞颗粒空泡变性及血管淀粉样变等。AD病因至今未明, 目前发现其发病与脑内β淀粉样蛋白 (β-amyloid, Aβ) 的过量沉积有关。Aβ可导致钙稳态失调、自由基形成过多、活性氧产生、神经细胞对各种伤害性刺激的反应增强或放大以及神经细胞的凋亡^[52]。

活性氧与淀粉样前体蛋白 (APP) 裂解产物的沉积是AD中神经元丢失的原因之一。Qin等^[53]将过表达野生型APP或三倍突变APP的SH-SY5Y细胞与小胶质或巨噬细胞系分别混合共培养时发现, 小胶质细胞可产生活性氧而导致神经元死亡, 尤以表达三倍突变APP的SH-SY5Y细胞死亡更加明显; 而巨噬细胞系虽与小胶质细胞有类似的作用, 但由于缺乏小胶质细胞的NADPH氧化酶亚型, 而未引起SH-SY5Y细胞的死亡。这提示, 在AD的细胞模型中, APP的产生依赖小胶质细胞的活化和NADPH氧化酶的表达。

Aβ积累生成老年斑, 刺激胶质细胞活化, 引起慢性炎症反应, 对神经元造成损伤^[54]。Culbert等^[55]将正常小胶质细胞种植在原代脑皮层神经元生长层上混合共培养, 用LPS和干扰素刺激小胶质细胞, 观察小胶质细胞的炎症反应以及对神经元的毒性; 并同时将由MAPK激酶2 (MK2) 缺乏的转基因小鼠获得的小胶质细胞与神经元细胞共培养, 两组作对比。结果表明, 正常的小胶质细胞受炎症刺激后可促使共培养神经元死亡, 而MK2缺乏的小胶质细胞对LPS和干扰素刺激引发炎症以及对共培养神经元的损伤均较小。该研究表明, MK2是小胶质细胞炎症反应通路的关键调节信号。此模型采用原代细胞混合培养, 更能体现神经元与胶质细胞之间旁分泌的相互作用, 可运用于炎症相关的AD体外机制研究。

AD疾病过程中, 血管发生淀粉样病变。Liu等^[56]将原代脑微血管内皮细胞和皮层组织块分别培养在transwell小池微孔膜的上、下侧, 建立了一个可多靶点研究AD脑神经血管损伤机制的模型。在模型中加入Aβ_25-33损伤后, 发现共培养体系跨内皮电阻降低, 特征性酶活性降低, F-肌动蛋白纤维减少, 线粒体损伤增多; 给予胆碱酯酶抑制药卡巴拉汀后, 这些变化可以逆转。研究证明, 在AD病程中, 神经与血管可以相互作用, 其机制涉及胆碱酯酶活性异常。此模型可运用于血管病变导致神经元损伤引起血管性老年痴呆的机制研究。

肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 是累及上运动神经元 (大脑、脑干和脊髓), 又影响到下运动神经元 (颅神经核和脊髓前角细胞) 及其支配的躯干、四肢和头面部肌肉的一种慢性进行性变性疾病, 与AD、PD同为神经系统变性疾病^[57]。

当小胶质细胞被激活后, 会释放许多潜在的神经毒性物质, 进而损伤运动神经元。Wen等^[58]运用小胶质细胞系 (BV-2) 的上清液 (未经LPS活化的BV-2上清液、LPS活化的BV-2上清液、添加NOS抑制剂并经LPS活化的BV-2上清液) 与运动神经细胞杂交瘤细胞株(NSC-34) 共培养, 分析共培养中BV-2培养液对NSC-34死亡相关肿瘤坏死因子受体 (TNFR1和TNFR2) 表达的诱导作用。结果发现, 在使用和不使用抑制剂情况下, 用活化后BV-2上清液共培养的神经细胞, 其TNFR1无论在转录水平还是蛋白表达水平都有上调。而TNFR2受体并没有参与这一诱导过程。该研究有助于进一步解释由小胶质细胞活化诱导的运动神经元变性机制。此模型采用的非接触式共培养模型, 可以直接研究细胞分泌因子对细胞的影响, 而此疾病主要针对的是运动神经元, 细胞株不能完全反映神经元的损伤机制。

ALS病例中5%～10% 是家族遗传性的, 其中20% 病患中发现有铜/锌超氧歧化物 (SOD1) 基因发生突变^[59]。Kunze等^[60]将小鼠胎鼠皮层的原代神经元与经人野生型或突变型SOD1基因转染的星形胶质细胞, 分别种植在一种微流体控制装置的两侧, 建立神经元和星形胶质细胞间代谢物相互影响的共培养体系, 经过谷氨酸处理后, 观察神经元密度和突触蛋白的变化以及氧化应激反应。结果发现, SOD1基因突变的星形胶质细胞可致神经元密度降低约45%、神经元突触蛋白丢失; SOD1基因野生型星形胶质细胞则不会影响神经元密度和其突触蛋白的表达, 而且还可减少其氧化应激反应。该模型选用小鼠脑皮层神经元细胞, 而非运动神经元, 对ALS主要累及运动神经元的病变机制不相吻合; 如能使用该微流体控制装置将原代运动神经元与SOD1基因突变的星形胶质细胞共培养, 其研究结果将更加符合ALS疾病中细胞间的相互作用机制。

通过密度梯度离心分离大鼠胚胎腹侧脊髓富含运动神经元的细胞并接种在单层高度富集的新生大鼠Schwann细胞非融合的玻璃板上共培养, 观察Schwann细胞对运动神经元生长影响。发现共培养运动神经元可以存活至少3周或更长时间。此运动神经元与Schwann细胞共培养体系中, 神经元突触连接形成一个自发活动的神经网络, 可测量到膜电位与钙的瞬时表达^[61]。该培养方法为研究兴奋性毒性提供了一种细胞共培养模型, 也可用于进一步研究肌萎缩性侧索硬化症可能机制。

运动神经元的修复与再生, 是脊髓损伤研究的热点。常用策略是减少炎症, 抑制胶质瘢痕形成^[62]。有研究采用4日龄新生大鼠取其脊髓, 切成350 μm厚度, 放入transwell小池中, 在加入外周神经移植物共培养, 给予不同浓度的米诺环素, 观察米诺环素对运动神经元的存活率的影响。结果表明, 高剂量米诺环素通过抑制共培养中小胶质活化引起的炎症反应, 而提高运动神经元细胞的存活率^[63]。此模型中运用三维培养研究, 更贴近在体的研究, 能对多个机制进行阐述, 可为药物治疗后脊髓损伤中运动神经元的修复提供参考模式。

由于缺乏在体的多种诱导分化因素, 随着培养代数的增加, 细胞去分化现象明显, 其特定的表型消失^[64], 此时的细胞再用以模拟其在体变化就缺乏部分在体功能的特征性反应。原代培养的细胞在形态和功能上与它们的亲代组织细胞具有最大的相似性, 因此, 其在体外模拟的病理损伤条件可以最大程度模拟其在体时的病理变化和反应。

一方面, 中枢神经系统疾病过程中, 损害的细胞不仅仅是神经元, 其邻近具有支持和功能互作的细胞和胞外基质同样受到损害^[65], 而且还会产生相互影响。另一方面, 相同组织不同细胞群之间的相互作用会影响彼此表型的级联变化, 促使细胞充分表达其在体分化特征^[64]。因此, 在建立研究中枢神经系统疾病的体外细胞模型时, 应尽可能多使用病变组织所涉及的主要细胞类型。

体外培养的细胞如果缺乏三维结构, 细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用会减弱, 其表型也不会得到充分呈现。三维培养能使细胞在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 细胞间的直接接触和分泌因子流通增加, 可模拟在体时细胞的形态结构和功能。而目前, 原代神经细胞三维共培养的例子较少。随着组织工程的新兴发展, 应用不同三维结构材料的载体共同培养多种中枢神经系统细胞, 将成为神经科学以后发展的趋势和热点。

“脑神经血管单元”是由微血管 (包括内皮细胞、周细胞、基底膜)、星形胶质细胞、神经元、胞外基质以及其他胶质细胞组成的, 反映大脑结构和功能的基本单位^[41]。因此, 选用合适的三维培养载体, 按细胞在体分布特点, 建立一种覆盖被模拟病理脑组织所有或主要细胞类型的、具有功能性的细胞共培养模型, 对于医学、药学研究, 将具有里程碑式意义。

目前, 中枢神经系统细胞共培养在技术及应用上仍存在一些需要探索或改进的问题: 如与在体相似的细胞外微环境控制、细胞的去分化和选择、培养载体的生物相容性等, 这些问题有可能在今后的研究中逐步得到完善。随着细胞培养技术的发展, 中枢神经系统细胞共培养将会为中枢神经系统疾病的机制研究及其治疗药物的临床前研究做出更大贡献。