2. 中国检验检疫科学研究院综合检测中心, 国家质检总局毒理重点实验室, 北京 100176;
3. 天津医科大学第二医院泌尿外科, 天津市泌尿外科研究所, 天津 300211
2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Test Center, Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine Key Laboratory of Toxicology, Beijing 100176, China;
3. Department of Urology, Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China
近几十年来,对于不同种类的实体瘤,化疗均可以起到有效的治疗作用,但由于其特异性较差而导致的严重不良反应也是临床主要的问题所在[1, 2]。随着对肿瘤分子机制的深入研究,基因治疗显示出更好的应用前景[3, 4],其中一种有效的治疗策略就是 利用自杀基因。自杀基因编码可以产生无毒的酶,这种酶能有效地催化低毒性的药物前体反应生成剧毒化疗药物,进而诱导癌细胞发生凋亡[5],如胞嘧啶脱氨酶基因 (CD) 就可以催化低毒药物5-氟胞嘧啶 (5-fluorocytosine,5-FC) 转化为化疗药物5-氟尿嘧啶 (5-fluorouracil,5-FU) 用于实现癌症的治疗[6],从Mullen等[7]在1992年的第一次报道至今,CD基因已经被许多研究小组证明能够在体外和体内实现对许多类型肿瘤起到生长抑制作用。
基因载体是影响基因治疗效果的关键因素,目前常用的载体分为病毒载体和非病毒载体两种[8, 9]。其中病毒载体已被证明具有一定的安全风险[10, 11],而非病毒载体以其明确的化学结构、无免疫原性、易于合成和修饰等优良性质得到了广泛的认可[12, 13]。在以往的研究中,本课题组开发了一种新的以季戊四醇衍生物为核的聚酰胺-胺型树枝状大分子 (polyamidoamine,PAMAM)[14, 15, 16, 17],其第五代产物 (G5 PD dendrimer) 在多种肿瘤细胞系中呈现出较高的转染效率和较好的生物相容性,展现出良好的应用前景。
本文中首先构建了含绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因片段的pCD-EGFP-N1融合质粒,然后利用G5 PD dendrimer介导pCD-EGFP-N1对3种不同的肿瘤细胞进行转染,从RNA和细胞荧光强度水平上对转染效果进行了评价,同时对于G5 PD dendrimer介导自杀基因抑制肿瘤细胞增殖效果进行研究。在实验中同时选择商用基因载体PEI 25 kDa作为对照。
材料与方法 药品与试剂支化聚乙烯亚胺 (bPEI,branched polyethyleneimine,分子质量为25 kDa) 和5-FC (美国Sigma-Aldrich公司); 质粒pEGFP-N1由南开大学生命科学院龙加福教授课题组惠赠,并在大肠杆菌DH5α中进行扩增,用质粒抽提试剂盒 (德国Qiagen公司) 进行提取; HindIII和KpnI以及T4连接酶 (日本TaKaRa生物公司); 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT)、DMEM培养基、1640培养基、L-谷氨酰胺和氨苄青霉素 (美国Gibco公司); 人肝癌细胞株HepG2细胞、人鼻咽癌细胞株KB、人肺腺癌细胞株A549 (中国医学科学院肿瘤细胞库); G5 PD dendrimer (南开大学药学院和天津市分子药物研究重点实验室自制)。
仪器凝胶成像仪 (ImageMaster VDS,瑞典Pharmacia公司); Nano ZS激光纳米粒度测定仪 (英国Malvern公司); 倒置荧光显微镜 (日本Olympus公司); 酶标仪 (Multiskan GO,美国Thermo公司); 流式细胞仪 (FACS Count,美国BD Bioscience公司)。
质粒pCD-EGFP-N1的构建CD基因片段 (477 bp) 由北京AuGCT公司合成,质粒pEGFP-N1图谱如图 1所示。为了在大肠杆菌DH5α内同时表达CD和EGFP基因,首先利用正向引物的5'-CCCAAG CTTCAATGCATCATCATCAT-3' 和反向引物5'-GCGGTACCCTCACCAATATCTTCAA-3' 扩增CD的cDNA。用限制性内切酶HindIII和KpnI分别酶切pEGFP和CD基因片段得到带有互补黏性末端的载体和目的基因片段,用T4 DNA连接酶连接后转入DH5α中,通过双酶切电泳图谱证实了CD基因的插入。
G5 PD dendrimer与pCD-EGFP-N1质粒(1 μg) 分别按质量比从0.1∶1到4.0∶1混合在总体积为8 μL的PBS中。将混合物在室温下孵育30 min,然后进行0.8% (w/v) 琼脂糖凝胶电泳实验 (80 V,40 min),EB染色。
复合物粒度分析通过将不同质量的G5 PD dendrimer与10 μg质粒DNA混合于1 mL超纯水中,制备G5 PD dendrimer/pCD-EGFP-N1复合物,室温孵育30 min制备复合物。在90°散射角下测量粒径大小,并通过累积分析测定其平均流体力学直径。
细胞培养人肝癌细胞株HepG2细胞培养在含10% 胎牛血清的DMEM培养基内,人鼻咽癌细胞株KB和人肺腺癌细胞株A549培养在含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基内,培养条件为37 ℃和5% CO2。
体外转染及表达分析3种细胞均按每孔2×104个接种于48孔板中培养24 h。转染前用PBS清洗细胞1~2次并更换无血清培养基继续培养。将G5 PD dendrimer与pCD-EGFP-N1质粒混合并孵育30 min形成复合物,并依次加入到各孔中 (每孔0.5 μg DNA),48 h后通过倒置荧光显微镜观察转染结果。阳性对照采用PEI 25 kDa。
RT-PCR实验收集对数生长期细胞,提取总RNA,按RT-PCR试剂盒说明扩增CD片段,检测各细胞中CD的mRNA表达水平,鉴定CD基因在细胞中的表达 (CD基因上游引物P5: 5'-CTGGGAACGG CGAATATGCT-3'; 下游引物P6: 5'-CGAATAACGTA CCGGAACCT-3')。
MTT法验证自杀基因抑制肿瘤细胞增殖效果用G5 PD dendrimer/pCD-EGFP-N1复合物分别采用优化的处方量转染A549、KB和HepG2细胞。48 h后,加入不同浓度 (0~20 mmol·L-1) 的5-FC培养基替换。分别孵育1、2、3和4天后,每孔加入MTT溶液 (5 g·L-1的PBS溶液) 20 μL,4 h后用DMSO 溶解晶体并用酶标仪在570 nm处进行测定,通过以下公式计算细胞存活率: 细胞存活率 (%) = (ODsample / ODcontrol)×100%。
统计分析所有实验数据均采用均值 ± 标准差 (x± s),并用t检验和方差分析进行分析。
结果 1 重组质粒pCD-EGFP-N1酶切验证将CD基因插入EGFP基因片段的上游,这样就可以通过观测绿色荧光蛋白的表达量来评价CD基因是否有效地转入细胞,以此作为细胞转染条件的优化筛选方法。
用限制性内切酶进行鉴定,如果质粒正确连接,会被HindIII和KpnI切成带有酶切位点相应黏性末 端HindIII和KpnI双酶切的载体pEGFP片段和目 的基因CD片段两部分,分别为4 700 bp和477 bp。重组质粒pCD-EGFP-N1的双酶切验证如图 2所示。与预期结果一致,证明质粒构建成功。对酶切鉴定正确的重组质粒pCD-EGFP-N1进行测序,进一步证实所插入的CD基因序列与初始的序列完全一致,这表明CD基因已成功克隆于原核表达载体pEGFP中。
G5 PD dendrimer与pCD-EGFP-N1可以通过静电相互作用形成复合物,这一过程通过凝胶电泳实验加以证明。从图 3的结果可以看出随着G5 PD dendrimer比例的升高,G5 PD dendrimer/pCD-EGFP-N1复合物的形成趋于稳定,质粒的负电荷也会被载体中和甚至转为正电性,因此对应泳道不会出现亮带。电泳结果显示,在G5 PD dendrimer与pCD-EGFP-N1质量比0.2∶1时条带完全消失,表明复合物形成。一般来讲,复合物形成的比例越低,载体与质粒的结合能力越强。
用动态光散射法测定G5 PD dendrimer/pCD- EGFP-N1复合物的粒径。如图 4所示,当G5 PD dendrimer与pCD-EGFP-N1分别按照质量比为1.0∶1和2.0∶1时形成的复合物颗粒尺寸分别为103.4 nm和102.6 nm,并且粒径均一度较高。
采用3种人源肿瘤细胞系作为模型考察G5 PD dendrimer的转染性能。由图 5所示,G5 PD dendrimer可以有效介导pCD-EGFP-N1转染3种细胞,其中当G5 PD dendrimer与pCD-EGFP-N1以质量比1.0∶1时形成的复合物体系转染效率最高。图 6是对应的流式细胞分析结果,由图可知,在不同细胞中随着复合物中G5 PD dendrimer的含量增加,转染效率均呈现出先升高再下降的趋势,这是由于G5 PD dendrimer的增加会使复合物表面的电位呈现弱正电性,从而增强细胞的摄取[18],而其含量太高会导致复合物正电性增强,呈现出一定的细胞毒性。此外,流式结果也表明G5 PD dendrimer/pCD-EGFP-N1在3种细胞中的转染效果普遍高于阳性对照PEI 25 kDa,这个结果与荧光图片反映的趋势保持一致。
为了检测转入外源性基因后,各种肿瘤细胞有无外源CD基因mRNA水平的转录,通过RT-PCR对转染CD基因的癌细胞、空载体转染的癌细胞及亲本细胞的基因组进行了分析,图 7中第2~4泳道出现了亮带,说明pCD-EGFP-N1在3种肿瘤细胞中均有效实现了转染,同时根据条带的亮度可以发现在第二泳道A549细胞中的RNA条带较为明显,结果显 示,3种肿瘤细胞均可扩增出CD的片段,而空载体转染的癌细胞和亲本细胞均未扩增出相应片段,其中在A549细胞中的表达效果相对较为明显。
CD基因表达的胞嘧啶脱氨酶可以使无毒的5-FC转为具有细胞毒性的5-FU。通过在细胞中加入不同浓度 (0~20 mmol·L-1) 的5-FC考察转染CD基因抑制细胞增殖的能力。图 8分别显示了CD基因对于3种细胞抑制增殖的效率。结果提示,没有转染CD基因的细胞在与5-FC接触3天以上,其存活率仍在90%以上; 当延长培养时间至4天,且5-FC浓度达到10 mmol·L-1时,细胞的存活率开始下降,但仍能达到70%以上。而经过转染的细胞其抑制增殖的能力一定程度上依赖于5-FC的浓度和细胞孵育时间。首先,随着5-FC药物浓度的增加,3种细胞均呈现了存活率下降的趋势; 其次,随着孵育时间的延长,3种细胞的存活率明显降低。这说明,转染的细胞中CD基因均能正常表达出高含量的胞嘧啶脱氨酶,随着5-FC药物浓度的增加,更多的5-FU被转换并导致细胞发生增殖抑制,而且孵育时间的延长也会加速酶的转化能力,从而使5-FU的含量增加,明显地降低肿瘤细胞的存活率。而在经过转染的3种细胞中,CD基因诱导KB细胞的增殖抑制效率最低,当5-FC浓度为20 mmol·L-1且孵育时间为4天时,细胞的 存活率才达到最低值,约为40% 左右。而CD基因诱导A549细胞发生增殖抑制的效率最高,当5-FC浓 度为5 mmol·L-1时,2天内就可使细胞的存活率降低到25%。
为了更好地比较G5 PD dendrimer和PEI之间 的转染效率,选取A549细胞作为模型,选取最优条件进行转染,48 h后加入不同浓度的5-FC测定胞嘧啶脱氨酶的表达情况。由图 9的数据可以看出,在未加入5-FC时,PEI组的细胞存活率仅为52.98%,说明PEI自身较高的正电荷会导致一定的细胞毒性,相比之下,G5 PD dendrimer组的细胞成活率则达到90%以上,说明该材料具有较好的生物相容性。当加入不同浓度的5-FC后发现,随着5-FC浓度的增加,PEI组的细胞增殖没有明显的变化,而G5 PD dendrimer组的细胞增殖抑制则呈现一定的药物浓度依赖性,在5-FC浓度较低时其对细胞增殖抑制的作用不如PEI组明显,一方面是由于PEI本身具有一定的细胞毒性,另一方面是由于G5 PD dendrimer组转染阳性细胞的个数要比PEI组多,这可以从图 6B的流式结果中得到证明。当5-FC的浓度较低时,胞嘧啶脱氨酶与药物接触不够,催化效率不高; 当药物浓度持续增高时,胞嘧啶脱氨酶转化能力提高; 当药物的浓度增加到20 mmol·L-1时达到峰值,G5 PD dendrimer组的细胞存活率最终也低于PEI组,因此说明G5 PD dendrimer相比于商用转染试剂PEI 25 kDa具有更 低的毒性和更高的转染自杀基因抑制癌细胞增殖的性能。
自杀基因用于肿瘤治疗已有多年的研究历史,其中以单纯疱疹病毒胸腺激酶 (herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK) 基因/苷昔洛韦 (ganciclovir,GCV) 系统与CD基因/5-FC系统为目前研究最深入、临床应用最早、最广泛的两种自杀基因系 统[19, 20]。但是目前的研究表明,限制自杀基因治疗的主要瓶颈在于自杀基因如何有效地传递到肿瘤部位,传统的病毒载体普遍具有安全性较低的问题,而常用的阳离子载体如脂质体和PEI等则具有较高的毒性和较低的转染效率,近年来聚酰胺-胺型树枝状高分子由于其表面富含氨基且具有特殊的三维球状空间结构在基因载体方面展现出良好的应用前景[21, 22]。因此本文拟通过一种新型的聚酰胺-胺型树枝状大分子G5 PD dendrimer来实现自杀基因的有效传递。
PD dendrimer是一种以季戊四醇衍生物为核心,并通过12个方向发散生长而成的聚酰胺-胺型树枝状高分子。这种特殊的核分子结构不仅决定了PD dendrimer在较低代数的时候即具有较高数量的末端氨基数目,而且也导致其三维拓扑结构与经典的聚酰胺-胺类树枝状分子有所不同。以前的研究发现,G5 PD dendrimer的表面拥有384个氨基,数目介于传统乙二胺 (ethylenediamine,EDA) 为核的G6 (256个) 和G7 dendrimer (512个) 之间,而且可以与质粒DNA形成物理化学性质非常稳定的复合物。转染实验结果表明,G5 PD dendrimer在多种细胞系中的 转基因效率要明显高于G7 EDA dendrimer和PEI 25 kDa,这也说明了这类载体的转染性能是表面氨基数和三维拓扑结构协同调控的结果[17],相类似的研究结果在使用G5 PD dendrimer介导siRNA转染 细胞的工作中也得到了印证[23]。在此基础上,本文对G5 PD dendrimer介导自杀基因抑制肿瘤细胞增殖的性能进行了评价。结果表明,经由G5 PD dendrimer转染的细胞中CD基因均能正常表达出高含量的胞嘧啶脱氨酶,且在给予少量5-FC的情况下也能短时间内诱导细胞增殖抑制,而随着5-FC药物浓度的增加及其与细胞孵育时间的延长,更多的5-FU被转化出来并抑制细胞增殖[24]。这一趋势在与PEI 25 kDa的对比中也得到了体现。
综上所述,G5 PD dendrimer作为基因载体系统具有安全性较高、转染效率较好的特点,且该系统携带的遗传物质可以从siRNA到融合质粒DNA,显示出较好的应用前景。
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