药学学报  2016, Vol. 51 Issue (2): 264-271   PDF    
细胞穿膜肽在药物递送系统中的研究进展
范博1,2, 金明姬1, 黄伟1, 王启明1, 高钟镐1     
1. 中国医学科学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室/药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室, 北京 100050;
2. 山西医科大学药学院, 山西太原 030001
摘要: 细胞膜是蛋白质、核酸及药物分子进入细胞的主要生物学屏障。近年来的研究发现细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)能够有效地将小分子药物、蛋白质、肽类、核酸片段以及纳米载体(如脂质体、聚合物胶束、无机纳米粒等)转运穿过细胞膜。本文就细胞穿膜肽的分类及其在介导小分子药物、蛋白质及多肽、核酸和纳米载体特别是"智能"纳米载体等的转运入胞作用进行了讨论。
关键词: 细胞穿膜肽     药物递送系统     纳米载体    
The development of cell-penetrating peptides in drug delivery system
FAN Bo1,2, JIN Ming-ji1, HUANG Wei1, WANG Qi-ming1, GAO Zhong-gao1     
1. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines/Beijing Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulation, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;
2. School of Pharmaceutical Science, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract: Cell membrane serves as the natural barrier. Cell-penetrating peptides (CPPs) have been a powerful vehicle for the intracellular delivery of a large variety of cargoes cross the cell membrane. The efficiency of intracellular delivery of drugs, proteins, peptides and nucleic acid, as well as various nanoparticu-late pharmaceutical carriers (e.g., liposomes, polymeric micelles and inorganic nanoparticles) has been demon-strated both in vitro and in vivo. This review focuses on the CPPs-based strategy for intracellular delivery of small molecule drugs, proteins, peptides, nucleic acid and CPP-modified nanocarriers.
Key words: cell-penetrating peptide     drug delivery system     nanoparticle    

细胞膜是蛋白质、核酸及药物分子进入细胞的生物学屏障。如何将药物安全有效地递送至靶部位,突破细胞膜屏障、促进药物进入细胞是药物递送系统尚需解决的主要问题。1988年Green等[1]首次报道了HIV-1的转录反式激活蛋白Tat具有穿透多种细胞膜的作用。随后,一系列通过耗能或非耗能形式跨过多种细胞膜的小分子多肽 (其长度一般不超过30个氨基酸) 被发现,并被命名为穿膜肽 (cell penetrating peptides,CPPs)[2]。这些穿膜肽能够内化进入哺乳动物、植物和细菌的细胞内,有效地转导具有生物活性的分子、药物和药物载体穿过细胞膜 [3, 4, 5]

1 细胞穿膜肽的分类

CPPs是一大类由10~30个氨基酸组成的短肽,也称为蛋白质转导域 (protein translocation domain,PTD) 或“特洛伊木马”肽 (Trojan horse peptides) 或转导肽 (transduction peptide) 等。到目前为止,已发现了多种CPPs,主要包括转录反式激活蛋白 (Tat)[1]、VP22[6]、transportan[7]、模型两亲性肽 (MAP)[8]、信号转导肽[9]和富含精氨酸序列肽[10]

大多数已知的CPPs不具备明显的组织特异性 或细胞类型特异性,而是依赖于生理pH环境下氨基酸 (主要是富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸残基) 的正电荷序列和细胞表面带负电荷的糖蛋白之间的静电相互作用而发挥作用。在生理pH条件下精氨酸的胍头基可以和细胞表面膜上带负电的磷酸基和硫酸基产生氢键结合,进而产生细胞内化作用。赖氨酸与精氨酸含有相同的净正电荷,但不含有胍头基,当其单独作用时穿过质膜的效果会差些。Lindgren和Langel[3]发现肽序列中氨基酸的数量和次序 (主要是精氨酸) 决定着CPPs的转导性。因此,根据它们在序列、疏水性和极性等方面的特征,CPPs大致可以分为3类。

1.1 阳离子型肽

此类肽富含精氨酸,具有高度净正电荷且几乎不含酸性氨基酸残基,主要包括R9[11]、Tat[12]、hLF[13] 和 (RXR)4[14]等。研究表明阳离子CPPs需要包含至少8个正电荷才能有效地被细胞摄取[15]。阳离子CPPs在进入细胞时一般不会引起细胞应答反应,却会影响细胞膜的完整性和活性。

其中两种阳离子型肽值得一提,第一种是核定位信号序列肽 (nuclear localization sequences,NLSs),NLSs是一种较为特殊的阳离子型细胞穿膜短肽[7],富含赖氨酸 (K)、精氨酸 (R) 或脯氨酸 (P) 残基,可以穿过核孔复合体转运进入细胞核。NLSs一般又可以分为两种: ① 单分型NLSs (monopartite NLSs): 最初发现于猿猴病毒40 (SV40) 大T抗原中,它是 一段4~8个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的短肽 (PKKKRKV),其核心序列可表示为K(K/R)X(K/R); ② 双分型NLSs (bipartite NLSs): 这类核定位信号以核质蛋白的核定位序列 (KRPAATKKAGQAKKKK) 为典型,它是由两簇碱性氨基酸残基组成,两簇碱性序列之间被10~12个非保守氨基酸残基间隔,其序列通式可以表示为R/K(X)10-12RRKK。由于大多数NLSs的电荷数量恰好小于8,所以NLSs不是有效的CPPs,但常被用来与疏水性肽序列共价连接以获得可以被有效摄取的两亲性CPPs。还有一种是抗菌肽 (antimicrobial peptides,AMPs),抗菌肽是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码、核糖体合成 的一类小分子活性多肽,是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。抗菌肽在进入细胞的过程中会损伤细菌的细胞膜,具有杀菌剂的性质。在体外,几分钟内就可杀伤革兰阳性菌、革兰阴性菌、寄生虫、病毒及肿瘤细胞。常见的抗菌肽有LL-37、S413-PV和Buforin 2等。

1.2 两亲性肽类

由亲水结构域和疏水结构域构成,其所带正电荷主要依赖于赖氨酸残基,而两亲性的特征是由其一级结构和二级结构决定的。

一级结构的两亲性CPPs一般分为两种: 一 种是疏水结构域与NLSs共价连接,包括MPG[16]、penetratin[17]和CADY[18]等。以MPG为例,MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV) 的亲水区是SV40 NLS PKKRKV,而疏水区则是源自HIV糖 蛋白41的融合序列,两个区域通过WSQP连接键连接; 另一种则是全部由天然蛋白质分离获得,如血管内皮-钙黏蛋白 (pVEC)[19]、ARF (1-22)[20]和BPrPr (1-28)[21]

二级结构的两亲性CPPs具有α-螺旋的空间构 象,其亲水性氨基酸残基 (亲水端可以为阳离子、阴离子或极性基团) 和疏水性氨基酸残基分别位于螺旋结构的不同表面。富含脯氨酸序列或多聚脯氨酸序列的肽是此类肽的代表,它们都含脯氨酸-吡咯烷基团[22],在水中能形成螺旋状结构,如包含50% 脯氨酸残基、来源于玉米储藏蛋白的芳香箭头肽 (sweet arrow peptide,SAP),其序列为VRLPPP。

1.3 疏水性肽

此类CPPs仅含非极性残基,目前仅发现少量的疏水性CPPs,比如从整合素β3中发现的信号序列VTVLALGALAGVGVG以及卡波济成纤维细胞生长因子 (AAVALLPAVLLALLAP)[15]

一方面,不同类型的CPPs具有不同的穿膜行为; 另一方面,与CPPs相连的药物或载体的大小及理化性质、肽的长度和浓度以及细胞类型等因素都显著影响其穿膜效应。

2 细胞穿膜肽与药物或载体的连接方式

CPPs能够输送种类繁多的物质进入细胞,被转运物质的理化性质也不尽相同。因此,需要不同的连接方法将CPPs与被转运物质连接。其中,连接方式对CPPs在摄取水平和方式上有重要影响。

2.1 共价连接

共价连接是最常见的方法。通过稳定或可裂解的化学键 (如巯基-马来酰亚胺、酰胺键、二硫键和硫酯键) 将CPPs与被运送物质结合。在许多情况下,尽可能地选择可裂解的化学键来保证被运送物质的释放而发挥其生物功能。例如,二硫键是一种可逆性化学键,在胞浆大量还原剂谷胱甘肽或还原酶的存在下,二硫键可以发生断裂将被载药物释放。然而,从化学观点来看,CPPs共价连接技术在方法学上对被连接物有严格的限制,并且可能改变被连接物的生物活性,尤其是带电荷的寡核苷酸或siRNA。

2.2 非共价连接

基于该方法与载体结合的大多数是两亲性CPPs,如MPG肽、Pep-1肽与核酸、蛋白等,还有阳离子型的Tat和寡聚精氨酸。非共价结合相对比较简单,包括静电作用和疏水作用。运用非共价结合方法可以实现核酸和蛋白质等生物活性大分子的胞内递送并保留其生物活性。由于CPPs与核酸类药物进行化学连接存在困难,因此CPPs介导的基因递送系统通常采用基于静电作用的非共价连接方式。但需要注意的 是,与大分子量的阳离子聚合物相比,CPPs的分子质量较小,其结合并压缩核酸类药物的能力相对较弱,所形成络合物的结构通常不够紧密而不利于基因转导。因此,将CPPs与大分子阳离子聚合物共价连接后,再通过静电作用的非共价连接方式与核酸类药物形成络合物,能够获得较好的基因递送效率。

3 细胞穿膜肽在药物递送方面的应用

细胞穿膜肽具有强大的运输潜能,迄今为止,CPPs已经有效地介导了不同分子量和粒径的物质进入细胞,如蛋白质、抗体、核酸 (寡核苷酸、cDNA、RNA和siRNA)、荧光染剂、纳米粒、病毒、量子点、磁共振成像造影剂和小分子药物等。

3.1 小分子药物

P-糖蛋白的过度表达是肿瘤多药耐药性的重要机制之一,Mazel等[23]将P-糖蛋白外排泵的底物多柔比星连接到CPPs上,显著增加了多柔比星对脑肿瘤细胞的毒性作用。Lindgren等[15]将甲氨蝶呤和两个不同肽类 (YTA2 和YTA4) 相连,结果表明,与游离药物相比,甲氨蝶呤-CPPs共价物对靶酶二氢叶酸还原酶的作用提高了15~20倍,同时体外多药耐药模型显示其可用于克服MDA-MB-231细胞对甲氨蝶呤的耐受性。Zhou等[24]将2',5'-寡腺苷酸四聚物 (2-5A) 与短链Tat肽用化学方法结合产生2-5A-Tat嵌合体,此嵌合体可以被细胞吸收并能在完整的细胞中活化核糖核酸酶。

3.2 肽类和蛋白质

蛋白质或多肽类药物可以用于许多疾病的治疗,但是分子量大和亲水性极大地限制了它们透过细胞膜的能力而导致其生物利用度低。近年来,许多学者开始利用CPPs来介导肽类药物的递送,其中Tat、penetratin和合成聚精氨酸等是常用的CPPs。Perea等[25]通过噬菌体展示技术筛选得到一种可以抑制酪蛋白激酶2磷酸化的环状九聚氨基酸长肽—P15 (酪蛋白激酶2在人体许多肿瘤中表达异常),将Tat与P15相连后给予荷瘤小鼠瘤内,结果发现瘤重大幅下降。与完整的免疫球蛋白G (immunoglobulin G,IgG) 相比,单链Fv (single-chain Fv,scFv) 抗体片段血清半衰期短,被肿瘤组织摄取也更为迅速,但由于scFv在组织中的滞留时间短导致其在肿瘤部位的净沉积剂量较低而明显限制了scFv在放射免疫疗法中的应用。为了提高scFv在肿瘤组织的摄取量和滞留时间,Jain等[26]将penetratin和Tat分别与scFv相连,结果发现给药后24 h,对照组 (未连接肽)、penetratin组和Tat组在肿瘤组织中滞留百分比分别为27.25%、79.84% 和48.55%,且Tat组在正常肺部组织摄取量明显增加但penetratin组在其他组织中的摄取没有增加。

3.3 核酸

CPPs也可以作为核酸类大分子如寡核苷酸类,包括核酸肽 (PNA) 和siRNA、质粒DNA等的载体,在基因表达的调节中可以靶向作用于细胞质或细胞核[27, 28]。Davidson等[29]将penetratin连接到siRNA有义链的5' 末端,没有经过进一步纯化而将其有效地递送进入初级神经细胞中引起了蛋白产物的下调。Chiu等[30]将Tat连接到siRNA上,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化结合物,该结合物能够沉默报告基因的表达。

3.4 纳米载体

纳米载体较难跨过细胞脂质膜,这大大地限制了其体内外应用,但将CPPs与纳米粒相连形成复合体后往往能克服这种困难。

3.4.1 脂质纳米载体

脂质体是粒径为50~1 000 nm的脂质囊泡,被广泛用于药物载体。研究发现表面经Tat肽修饰的、粒径约200 nm的脂质体可以有效地将药物递送到胞内[31],而且药动-药效学结果表明,递送效率与肽的数量、肽序列、细胞来源和培养时间相关。Torchilin等 [31, 32, 33]将Tat与脂质体相连,与无Tat肽修饰的普通质粒-脂质复合物相比,体外实验表明Tat肽-脂质复合物提高了质粒pEGFP-N1进入癌细胞的递送率和转染率。脂质体进入细胞1 h后仍在胞浆中保持完整的形态; 入胞后2 h,脂质体迁移进入细胞核周围区域; 9 h后,Tat修饰的脂质体开始在核周围区域分解。Khalil等[34]将八聚精氨酸 (R8) 与脂质体相连并考察了R8不同修饰密度对脂质体的细胞摄取和胞内转运的影响。结果发现,低密度R8修饰的脂质体主要通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞,在溶酶体内发生降解; 高密度R8修饰的脂质体则主要通过巨胞饮作用进入细胞且不易被溶酶体降解,脂质体上不同R8密度产生不同基因表达水平的原因主要是由不同的胞内转运途径所引起,而不是由于细胞对脂质体的不同摄入量。研究者进一步将质粒DNA压缩包入高密度R8-脂质体,基因表达提高了3倍。Dasai等[35]将Tat肽连接到固体脂质纳米粒上用于经皮给药。在体外细胞模型中,通过激光共聚焦显微镜和拉曼共聚焦显微镜观察发现,对照组纳米粒主要分布在毛囊层 (皮下深度约80 μm),经Tat修饰的纳米粒在毛囊层和表皮层 (皮下深度约120 μm) 均可观察到; 与对照组相比,Tat-脂质纳米粒使塞来昔布的经皮渗透能力提高了3~6倍。

3.4.2 聚合物纳米载体

经CPPs修饰后的聚合物胶束或纳米粒为提高难溶性生物活性药物和核酸类药物的胞内递送提供了有效手段。与未经修饰的胶束相比,Tat肽修饰的PEG-PE胶束增加了其与肿瘤细胞的相互作用,给药浓度为5和50nmol·L-1时,Tat-PEG- PE组都显著提高了紫杉醇对MCF7和4T1细胞的 毒性 (P < 0.05)。体内研究发现,通过对肿瘤组织进行TUNEL检测,Tat-PEG-PE组细胞凋亡更为明显[36]。Cheng等[37]制备了一种PEG-PLGA纳米粒用于递送siRNA,并在纳米粒表面连接了两种不同的配体: 叶酸和penetratin。通过这两种配体发挥协同作用,该 双功能化纳米粒与细胞的亲和性增加,细胞对纳米粒的结合能力和摄取能力增强,基因沉默效率提高。Han等[38]将PAMAM树状大分子和Tat肽与细菌磁性纳米粒 (bacterial magnetic nanoparticles,BMPs) 相连,构建了一种具有穿膜作用的靶向siRNA递送系统 (Tat-BMPs-PAMAM),用于脑部肿瘤的基因治疗。与对照组相比,Tat-BMPs-PAMAM /psiRNA-EGFR更好地下调了U251细胞的EGFR表达,显著抑制了U251细胞的增殖和侵袭能力。在U251裸鼠皮下瘤模型中,Tat-BMPs-PAMAM 治疗组的肿瘤生长速率减慢,肿瘤蛋白 (EGFR、P-AKT、MMP-2/9、PCNA、VEGF、Bcl-2和cyclin D1) 表达显著下调,细胞凋亡数量明显增加。Jiang等[39]用R8与叶酸共同修饰了PEG化聚乙烯亚胺 (0.6 kDa)-β-环糊精,用于递送质粒DNA。结果表明,叶酸介导的入胞作用和R8介导的穿膜作用共同提高了质粒DNA体内外的转染率。此外,经Tat修饰的壳聚糖纳米粒不仅可以有效地转染pDNA[40],而且递送功能性siRNA能显著抑制小鼠乳腺癌的生长和转移,延长荷瘤鼠的生存期,研究发现[41, 42]生理盐水组与裸siRNA组的小鼠在接种后第56天时全部死亡,而纳米粒组的小鼠生存期延长至69天。

3.4.3 无机物纳米载体

近年来,无机纳米载体以其独特的性质获得了研究者的广泛关注,CPPs可以提高无机纳米载体 (包括硅、铁、金和银等材料制成纳米粒) 的胞内递送效率。Josephson等[43]将粒径约为40 nm的右旋糖酐包衣的超顺磁性氧化铁纳米粒 (SPIONs) 与Tat肽相连,与未经修饰的纳米粒相比,淋巴细胞对SPIONs的摄取效率提高了100倍左右。Santra等[44]设计了一种粒径约为70 nm、经Tat肽修饰的荧光纳米探针——Tat-异硫氰酸荧光素-硅纳米粒 (Tat-FSNPs),它可以标记人肺腺癌 (A549) 细胞,且能够有效地穿过大鼠的血脑屏障。Oh等[45]研究了粒径在2.4~89 nm之间的Tat肽-PEG-金纳米粒的细胞摄取和胞内分布情况,结果发现,金纳米粒 (AuNP) 的细胞摄取依赖于纳米粒表面的穿膜肽,但是AuNP的胞内定位则由其粒径决定。粒径介于5.5~8.2 nm间的粒子只有部分被运送至细胞质内,16 nm以上的金纳米粒则不会进入细胞,而是分布在细胞外围或细胞外发生聚集。

3.5 刺激响应型“智能”纳米载体

尽管CPPs具有相当大的临床应用潜能,但是也存在一些重要的缺点和局限性。首先,CPPs的特异性差,可以进入任何与之接触的细胞内,可能会对正常组织产生毒性。第二,穿膜肽在到达靶部位之前存在体内稳定性问题。为了防止CPPs在血浆中发生酶解,目前可采取的措施有: ① 对其进行空间保护; ② 使用具有蛋白酶抗性的D型肽取代L-氨基酸形式; ③ 将CPPs包入“智能”纳米载体中,在纳米载体运行的第一阶段,非特异性CPPs被聚合物或靶向抗体空间保护 (即所谓的“隐藏”),当到达靶部位后,在局部环境的作用下,载体表面的保护基团通过刺激敏感性共价键的断裂而与载体分离,将CPPs暴露出来进而发挥其穿膜作用。临床研究发现,肿瘤、梗死和炎症部位常常存在低pH值、高温和基质金属蛋白酶等“局部环境”,加热、辐射、超声、射频和磁场等外界刺激常常可以用来触发CPPs的暴露。

Koren等[46]设计了一种多功能刺激敏感性脂质体递送系统,该系统在脂质体表面连接了3种基团: ① 肿瘤特异性2C5单克隆抗体 (mAb 2C5); ② Tat肽连接的短链PEG; ③ 位于长链PEG和PE之间可降解的pH敏感性腙键。在正常生理pH下,Tat分子被长链PEG和mAb 2C5“隐藏”,当短暂 (15~30 min) 暴露于酸性环境 (pH 5.0~6.0) 后,腙键断裂,PEG保护去除,Tat肽暴露出来发挥其穿膜作用。这里的mAb 2C5不仅可以介导载体对肿瘤的主动靶向,而且可以提高载体与肿瘤细胞的相互作用,与被“隐藏”的Tat肽发挥协同作用。在肿瘤细胞的酸性环境下,与未经修饰的Doxil相比,包载了阿霉素的这种多功能性载体,提高了细胞对载体的摄取作用,增强了药物对细胞的毒性。Lee等[47]设计了一种“弹出”系统,该系统是由两种嵌段聚合物自组装形成的: PLA3kD- b-PEG2kD-b-polyHis2kD-Tat和polyHis5kD-b-PEG3.4kD。PLA3kD嵌段构成了纳米粒的疏水核,被PEG2kD和PEG3.4kD组成的亲水壳所环绕。在正常生理pH下,polyHis2kD处于非离子化状态,与其相连的Tat肽分子紧密地绑定在纳米粒表面,而被长链PEG3.4kD“隐藏”; 当处于肿瘤的弱酸环境时,polyHis发生离子化作用使得亲水壳带正电。结果说明,静电排斥作用克服了疏水作用,引起polyHis2kD-Tat弹出表面,pH触发的Tat肽暴露于肿瘤环境中。Wang等[48]构建了一种纳米靶向复合胶束,该复合胶束是将构象可变的聚谷氨酸-聚乳酸嵌段共聚物和Tat肽修饰的PEG- DSPE嵌段共聚物通过自组装方式形成。在血液循环中,聚谷氨酸链段可以屏蔽Tat肽的跨膜递送功能,防止其针对正常细胞发挥跨膜递送作用。同时,这种屏蔽作用还可以保护Tat肽,防止其被酶解而失去跨膜递送活性。该复合胶束首先通过EPR效应在肿瘤组织内蓄积,实现被动靶向。然后,在肿瘤组织弱酸性条件下聚谷氨酸链段发生构象转变暴露出Tat肽,进一步发挥Tat肽的跨膜递送作用,促进载体中药物吸收。聚谷氨酸的构象转变还可以在胶束外壳中形成通道,加速药物释放。

在多功能性基因递送载体中常常出现纳米载体经PEG化修饰后产生细胞摄取量减少和核内体逃逸下降等问题,因此有学者采用特异性配体、可裂解的PEG系统或核内体融合/裂解肽等方式来克服。Kale等[11, 13]制备了一种载有质粒pGFP的PEG化脂质体,该系统表面连接了Tat肽 (PE-PEG-Tat),并用具有pH敏感性酰腙键将PEG嵌段与PE相连 (mPEG-HZ- PE)。当脂质体在EPR效应下到达肿瘤部位后,肿瘤细胞低pH的微环境使酰腙键断裂,脱掉PEG外壳,暴露出隐藏的Tat肽,然后Tat肽再介导脂质体进入肿瘤细胞内。基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs) 是一组位于细胞外基质结构上具有极大同源性、能够降解细胞外基质蛋白的内肽酶总称。研究 发现[49]许多肿瘤组织的MMPs表达上调且酶催化反应可以放大MMPs的作用效应,因此MMPs成为侵袭性和转移性肿瘤的理想靶点。Harris等[50]开发了 一种基于MMPs敏感和EPR效应的磁性荧光纳米粒。研究者将被葡聚糖包裹的氧化铁磁性纳米粒通过对MMP-2敏感的多肽片段 (GPLGVRGC) 与PEG相 连,用来掩饰CPPs。该纳米粒在血液循环中稳定,避免了非特异性相互作用,当纳米粒通过EPR效应蓄积在肿瘤部位后肿瘤组织中的MMPs促使对其敏感的化学键断裂,PEG脱离将CPPs暴露,CPPs介导的细胞穿膜作用被激活。该结果通过荧光和核磁共振成像得到了证实。

4 细胞穿膜肽应用的安全性问题

CPPs为促进药物转运入胞开辟了一条新的途径,但是若将其应用于临床尚有几个问题需要进行全面深入的研究: 第一,明确CPPs的转运特征,包括转运的机制、效率和动力学等; 第二,阐明CPPs介导的药物递送系统在体内的组织分布和药动学; 第三,CPPs进入体内后对组织和细胞潜在的毒副作用以及是否会引起机体的免疫应答反应等。

CPPs一般通过作用于细胞膜和细胞器膜或与细胞组分相互作用而对细胞产生毒性[51, 52]。研究发现,与细胞作用时间、CPPs的长度和浓度、CPPs相连载体种类和细胞类型等因素都会影响穿膜肽的毒性[53]。体外研究发现,不同长度的Tat衍生肽其毒性随着长度和剂量不同而发生改变,Tat48-85在较高浓度 (100 μmol·L-1) 时仍不会对HeLa、CHO和神经元细胞产生毒性[53-55],但是Tat37-60在浓度较低 (100 nmol·L-1) 时即引起HeLa GH、HL116和CCL39细胞发生坏 死[56]。MAP通过破坏细胞膜杀死微生物细胞[57]。当浓度超过1 μmol·L-1时,MAP对小牛主动脉内皮细胞产生较强的毒性作用[58]

目前,对CPPs的体外毒性评价较多,但其体内毒性的考察受到限制。较少研究者针对CPPs的体内毒性、免疫原性及可能产生的不良反应进行较为系统和全面的评价。只有少数文献报道了CPPs应用于体内研究时所产生的毒性。Olson等[59]发现D-型寡聚精氨酸 (R9) 在静脉给药剂量大于5 μmol·kg-1时会引起严重的全身毒性,小鼠因呼吸衰竭而死亡。Bolton等[60]发现,当penetratin剂量大于10 μg时会引起脑部神经细胞死亡和炎症细胞聚集,但剂量为1 μg时显著减轻。而Low等[61]研究发现penetratin还会通过与Toll样受体通路相互作用而影响内源性免疫系统。因此,只有对CPPs的体内外行为进行全面深入评价,才能防止其对正常组织产生不良反应,只在靶部位发挥治疗作用。

5 展望

药物递送系统在到达靶部位前必须克服多重生物学屏障,提高药物递送效率不仅可以减少给药剂量,而且可以避免过量药物对正常组织产生的毒副作用。虽然CPPs在体内外实验中能够协助各类活性分子进入细胞内发挥作用,为疾病治疗带来了新的希望,但CPPs缺乏组织特异性和细胞类型特异性,且在生理条件下易发生蛋白酶水解,这些“缺陷”推动了基于生理学或微环境特征而设计定向于靶组织或靶细胞的“智能”递送平台的发展,使其在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运及细胞免疫学等研究领域具有良好的应用前景。如何控制“智能”载体的响应灵敏度、克服较高的组织间质液压 (interstitial fluid pressure,IFP) 以及促进药物深入组织内部发挥药效等是基于CPPs的药物递送系统亟需解决的主要问题,也是将此项技术应用于临床的关键所在。

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