2016, Vol. 51
2. 美国密苏里大学医学药理与生理学系, 哥伦比亚 65212;
3. 西南医科大学医学基础研究中心, 四川泸州 646000;
4. 美国密苏里大学医院与临床内科, 哥伦比亚 65212
2. Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, Columbia 65212, USA;
3. Research Center for Preclinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China;
4. Department of Internal Medicine, University of Missouri Hospital and Clinics, Columbia 65212, USA
据世界癌症报告估计: 2012年中国癌症发病人数为306.5万,约占全球发病的五分之一,癌症死亡人数为220.5万,约占全球癌症死亡人数的四分之一[1]。美国癌症协会的统计报告指出: 全美2013年癌症发病人数约为166万,癌症死亡人数约为58万[2]。因此,对肿瘤疾病进行有效的预防和治疗,是人类健康所面临的重大问题。三氧化二砷和青蒿素是从中药中分离提取的活性成分,越来越多的研究显示其具有良好的抗肿瘤活性[3]。本文对三氧化二砷和青蒿素的抗肿瘤分子机制进行综述,对当前的研究思路和数据进行比较分析并展望了中药单体化合物的应用前景。为了方便阐释,作者将研究者采用的细胞和动物肿瘤模型按照解剖学分类系统进行归类,对同一分类系统的肿瘤又按照其发生组织部位进行分段综述。
1 三氧化二砷三氧化二砷 (arsenic trioxide,ATO,分子式As2O3) 为矿物质砒霜的主要成分,我国学者在20世纪70年代首先将ATO用于急性早幼粒细胞性白血病 (acute promyelocytic leukemia,APL) 的治疗并取得了良好效果[4]。
1.1 ATO与造血组织恶性肿瘤已知多于98% APL患者具有易位细胞学特征,即维甲酸α受体基 因 (retinoic acid receptor alpha,RARα) 与早幼粒细胞性白血病基因 (promyelocytic leukemia,PML) 融合产生刺激APL细胞生长的融合蛋白PML-RARα[4]。Zhang等[3]通过细胞外苏素化检测和人宫颈癌HeLa细胞内哺乳动物双杂交检测发现,ATO可直接结合PML或PML-RARα锌指结构域内的半胱氨酸残基并诱发PML或PML-RARα蛋白低聚化,通过增加低聚化蛋白与小泛素样修饰蛋白SUMO (small ubiquitin- like protein modifier) 结合酶UBC9的相互作用或通过增加展现修饰的氨基酸位点,促进低聚化蛋白的苏素化,最终导致PML或PML-RARα蛋白泛素化水平增加诱发蛋白降解。
Kim等[5]认为ATO具有免疫调节属性,可以在慢性髓细胞性白血病K562细胞、APL和NB4细胞中上调C型凝集素样受体家族 (natural killer cell group 2D,NKG2D) 配体ULBP1 (UL16 binding protein 1) 的转录和翻译水平,使肿瘤细胞对自然杀伤细胞NK介导的细胞毒性易感。
1.2 ATO与消化系统肿瘤Subbarayan等[6]分析表明: ATO作用于人结肠癌HT29细胞和耐5-氟尿嘧啶 (5-FU) HT29FU细胞,导致胸苷酸合成酶TS (thymidylate synthase) 的转录和翻译的表达下调,指出ATO可作为肿瘤化疗的增敏剂。Gao等[7]发现ATO作用于胰腺癌Patu8988和Panc-1细胞可显著引起S期激酶相关蛋白2 (S-phase kinase-associated protein 2,SKP-2) 在转录和翻译水平降低,并使其下游调控基因FOXO1 (forkhead box protein O1,一种Forkhead家族转录因子) 和p53的表达明显上调,认为通过ATO抑制SKP-2是一种新的治疗胰腺癌策略。
Cui等[8]检测了人原发性肝细胞癌和人肝癌HepG2和Huh-7细胞中p16INK4a、Ras相关区域家族1A (Ras association domain family 1 gene,RASSF1A)、上皮钙黏附蛋白(epithe1ial cadherin,E-cadherin) 和谷胱甘肽巯基转移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1) 启动子区CpG岛的甲基化水平。发现4个基因的高甲基化状态在原发性肝癌病例中的检出率分别为40%、56 %、24% 和48%,在细胞系中这4个基因的低mRNA水平也表明CpG岛的高甲基化水平。进一步发现低浓度ATO通过抑制DNA甲基转移酶 (DNMT) 的转录和活性来使CpG岛去甲基化,从而恢复这些抑癌基因的表达水平。Beauchamp等[9]构建了一种hedgehog信号通路下游转录因子胶质瘤-关联癌基因同源物1 (glioma-associated oncogene homolog 1,GLI1) 的荧光素酶报告基因载体并转染HepG2等几种人肿瘤细胞,将ATO作用于转染细胞24 h,发现ATO不改变GLI1的转录水平但特异结合GLI1蛋白并抑制其活性,继而明显抑制其下游靶向基因锌指转录因子PTCH1 (patched homolog 1) 和生长阻滞特异性蛋白 (growth arrest specific 1,GAS1) 的转录,提示可针对具有hedgehog/GLI信号通路激活态的临床肿瘤进行ATO治疗。
Xiao等[10]建立了胃癌SGC-7901细胞的裸鼠移植模型,发现ATO实验组血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 的蛋白荧光强度和翻译水平明显下调,呈剂量和时间的依赖性。Li等[11]发现ATO下调人胃癌MGC803细胞的p53蛋白水平,检测到磷酸化AKT (protein kinase B,PKB) 即p-AKT蛋白表达先升高后降低。进一步发现ATO可上调Cbl (casitas B-lineage lymphoma,一类引起靶标蛋白的泛素化降解的E3泛素连接酶) 蛋白家族的c-Cbl和Cbl-b表达水平,认为可负性调控被ATO过度激活的PI3K/AKT信号通路,从而影响p53蛋白表达水平。Jia等[12]以分泌甲胎蛋白AFP的胃癌FU97细胞为模型,发现ATO明显下调AFP、信号转导与转录激活因子3 (STAT3) 和磷酸化STAT3的表达,同时导致Bcl-2表达明显下调以及Bax表达明显上调。认为ATO同时抑制AFP和STAT3并诱发细胞凋亡可为临床治疗分泌甲胎蛋白AFP且高表达STAT3的胃癌患者提供新的用药方案。
1.3 ATO与生殖系统肿瘤Zhang等[13]指出,由于启动子CpG岛的高甲基化,约三分之一的乳腺癌因缺少ERα (estrogen receptor alpha) 而导致使用雌激素受体拮抗剂他莫昔芬 (tamoxifen) 等内分泌疗法无效。以乳腺癌MDA-MB-435s细胞及裸鼠移植肿瘤为模型,发现ATO处理使DNA甲基转移酶1的表达受到抑制,ERα基因被去甲基化,ERα的重新表达呈现出对ATO的剂量依赖性。与对照组或他莫昔芬组比较,裸鼠移植瘤体积变小,因此ATO可作为ERα阴性乳腺癌的去甲基化试剂和内分泌疗法的增敏剂。Liu等[14]分析表明: 与单独使用药物相比,ATO联合放疗药物氯化锶 (89SrCl2) 可使人乳腺癌MCF7细胞Bcl-2基因表达水平明显下调,但不改变Bax的表达水平,认为ATO有效诱导Bcl-2/Bax比值下调而诱发凋亡。Zekri等[15]将表达人生长激素 (human growth hormone,hGH) 的载体稳定转染MCF7细胞,发现 与MCF7细胞相比,4 µmol·L-1 ATO明显促进细胞凋亡相关基因c-Myc、p53、Noxa (Bcl-2蛋白家族成员) 和Bax在MCF7-hGH细胞中的转录,而Bcl-2 mRNA水平下调,导致Bax/Bcl-2比值在MCF7-hGH细胞中明显上调,从而触发凋亡。同时还发现,永生化基因 (human telomerase reverse transcriptase,hTERT) 和浸润转移相关基因MMP-2 (matrix metalloproteinase-2)、MMP-9 (matrix metalloproteinase-9)、uPA (urokinase,一种丝氨酸蛋白酶家族成员)、uPAR (urokinase-type plasminogen activator receptor) 和E-cadherin的转录水平下调明显,提示4 µmol·L-1 ATO对富含hGH的乳腺癌细胞作用效果更显著。另外,细胞的克隆形成能力在MCF7-hGH细胞中降低,认为hGH增加了乳腺癌细胞对ATO的敏感度。Wang等[16]发现ATO通过激活胱天蛋白酶-3 (caspase-3) 和抑制hERG (the human Ether-à-go-go-related gene) 蛋白 (即钾离子通道α亚基) 表达水平来诱导MCF7细胞的凋亡,后续研究发现ATO通过上调微小RNA (microRNA,miRNA) 分子miR-328的表达来抑制hERG的表达,使乳腺 癌细胞的生长受到抑制[17]。Bakhshaiesh等[18]分析 认为,ATO通过下调一种募集DNA修复因子的蛋白PPM1D (protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta) 的转录水平来促进耐紫杉醇MCF7细胞的凋亡。
Zhang和Wang等[19]分析了ATO对人卵巢癌3AO、SW626和HO-8910PM细胞侵袭和转移相关基因的 表达影响,表明ATO抑制基质金属蛋白酶MMP-2 和MMP-9及其组织抑制因子TIMP-2 (tissue inhibitor of metalloproteinase 2) 的转录和翻译,但促进金属蛋白酶组织抑制因子TIMP-1的表达。Yuan等[20]分析发现,ATO通过降低p-AKT的表达并激活caspase-3和caspase-9来诱导人卵巢癌COC1和A2780细胞 的凋亡,而采用shRNA干扰技术沉默Bim (Bcl-2 interacting mediator of cell death) 蛋白的表达则可以阻止ATO诱导的细胞凋亡过程。
Yu等[21]指出: ATO激活人宫颈癌HeLa和SiHa细胞迁移和侵袭相关的E-cadherin 和caveolin-1 (小窝蛋白1,细胞表面穴样内陷中的主要膜内在蛋白) 而抑制NF-κB (nuclear factor-kappa B)、磷酸化IκB (p-IκB)、MMP-2和β-catenin (β-连环蛋白) 的蛋白 表达。Bae-Jump等[22]发现ATO使丝裂原活化蛋白 激酶/细胞外信号调节激酶 (mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase,MAPK/ ERK) 信号途径的p42/p44快速磷酸化,通过这一信号通路以剂量依赖的方式抑制子宫内膜癌Ishikawa和ECC-1细胞ERα在转录和翻译水平的表达。Yih等[23]研究了ATO对Rho GTP酶 (一种与肿瘤的侵袭转移密切相关的、具有GTP酶活性的Ras同源蛋白) 的影响。发现作用于人宫颈癌HeLa-S3细胞后,ATO增加了活性Rho GTP酶 (Rho guanosine triphosphatase,Rho GTPase) 水平,而采用RNA干扰技术沉默II型γ亚型磷脂酰肌醇-5-磷酸-4激酶 (phosphatidylinositol- 5-phosphate 4-kinase type-2 gamma,PIP4KIIγ) 不仅降低了ATO诱导的活性Rho GTPase水平,还减轻 了ATO诱导的纺锤体缺陷、细胞周期阻滞和细胞凋亡,由此指出ATO诱导的肿瘤细胞纺锤体异常与PIP4KIIγ/Rho信号途径相关联。
Rosenblatt和Burnstein[24]构建了雄激素受体 (androgen receptor,AR) 的表达载体以及含有雄激素受体应答元件ARE和前列腺特异抗原PSA增强子/启动子区的荧光素酶报告载体,分别转染人前列腺癌PC3、LNCaP和LAPC4细胞,发现ATO间接抑制了AR的转录活性。
1.4 ATO与泌尿系统肿瘤
Jutooru等[25]在膀胱癌KU7细胞中检测到特异蛋白家族 (specific protein,Sp) 成员Sp1、Sp3和Sp4以及cyclin D1、EGFR (epidermal growth factor receptor)、Bcl-2、生存素 (survivin) 和VEGF的表达下调,ATO抑制荷瘤无胸腺小鼠瘤体的生长并明显下调Sp1、Sp3和Sp4的表达。Cao等[26]研究了ATO对人膀胱癌T24细胞的影响,miRNA的微阵列检测和实时荧光定量PCR分析表明: miRNA-19a的表达被ATO明显下调,在T24细胞中沉默miRNA-19a则靶向上调PTEN的翻译表达并下调p-AKT蛋白水平,提示ATO通过miRNA-&nbs p; 19a作用于PTEN/AKT信号通路诱发细胞凋亡。
1.5 ATO与其他系统肿瘤Yang等[27]指出低水平Fas表达与骨肉瘤细胞的肺转移关联,他们观察到ATO处理后人骨肉瘤Saos-2细胞中Fas在转录和翻译水平的上调,提示这可能利于阻止骨肉瘤细胞的肺转移过程。Liu等[28]以表皮癌A431细胞为模型,发现高浓度ATO诱导p21蛋白表达而促进肿瘤细胞凋亡,这一过程被处于酪氨酸激酶c-Src/EGFR/PKB信号通路的TGIF (transforming growth-interacting factor) 所负性调控。认为抑制该负性调控效应可以提高ATO的临床抗肿瘤功效。
综上所述,三氧化二砷抗肿瘤的分子机制主要包括: ① 调节细胞周期调控蛋白而阻滞肿瘤细胞增殖; ② 调节细胞凋亡信号转导途径而诱发肿瘤细胞凋亡; ③ 调节细胞永生化基因,影响肿瘤细胞有丝分裂次数; ④ 调节血管生成和浸润转移相关基因,影响肿瘤细胞扩散; ⑤ 调节启动子甲基化和蛋白泛素化基因,开启或关闭蛋白功能; ⑥ 调节miRNAs抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡; ⑦ 调节肿瘤细胞DNA合成与损伤修复基因; ⑧ 关联信号转导通路基因; ⑨ 对其他蛋白的调节作用。
2 青蒿素青蒿素 (artemisinin,分子式C15H22O5) 主要是从中草药黄花蒿植物中分离提取的具有过氧基团的倍半萜烯内酯天然产物单体,在治疗疟疾的联合用药方案中青蒿素及其衍生物发挥了巨大的作用[29],屠呦呦由此获2015年诺贝尔医学与生理学奖也证明其重要的医疗价值。良好的临床疗效吸引了人们对其药用价值进行深入研究,继而揭示了青蒿素抗肿瘤的分子机制。
2.1 青蒿素与造血组织恶性肿瘤Anfosso等[30]采用数学模型将基于微阵列杂交分析获得的89个与 血管生成相关基因的mRNA表达水平与青蒿素的半数抑制浓度 (IC50) 相关联。结果表明: 30个基因的组成型表达明显与药物作用后的胞内应答有关,其中6个基因的表达与青蒿素的IC50显著相关,分别 为蓬乱蛋白同源物3 (DVL3)、神经元细胞黏附分子 (NRCAM)、基质金属蛋白酶11 (MMP11)、缝隙连接蛋白α4 (GJA4)、ATP结合盒转运蛋白G1 (ABCG1) 和一氧化氮合成酶2A(NOS2A) 基因。指出青蒿素的抗肿瘤活性至少部分与抑制肿瘤血管生成有关,认为青蒿素具有化疗药物的抗血管生成特征。
2.2 青蒿素与消化系统肿瘤Hou等[31]针对人肝癌细胞和动物模型的实验表明: 青蒿素通过降低参与细胞周期调控的cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4和E2F1,并促进p21和p27的表达来抑制肝癌HepG2和Hep3B细胞增殖。通过激活caspase-3、增加Bax/ Bcl-2比值和剪切型多聚二磷酸腺苷酸核糖聚合酶PARP (poly ADP-ribose polymerase,一种DNA修复酶)、抑制鼠双微体基因MDM2的表达来诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡。
Zhang等[32]发现青蒿素通过诱导人胃癌AGS和MKN74细胞的p53蛋白表达而抑制细胞增殖。Noori等[33]发现青蒿素诱导胰腺癌RIN细胞的凋亡过程与CD95-CD95L信号途径无关,以剂量依赖性的方式明显增加细胞的活性氧自由基水平从而开启内在细胞死亡的信号通路。
2.3 青蒿素与生殖系统肿瘤Sundar等[34]以MCF7细胞为模型,发现青蒿素通过影响ERα的启动子活性来下调ERα的表达水平,但不改变ERβ的表达水平。染色质免疫沉淀分析表明,青蒿素明显减低结合孕激素受体PR启动子的内源ERα水平。青蒿素与雌激素受体拮抗剂联用可协同降低ERα的表达。因此,青蒿素可以逆转乳腺癌细胞ERα/ERβ的表达水平进而抑制肿瘤细胞增殖。
Willoughby等[35]指出青蒿素抑制前列腺癌LNCaP细胞的CDK2和CDK4的启动子活性,快速下调CDK2和CDK4的表达。启动子区删除实验表明,CDK4启动子上游存在一个231 bp的青蒿素应答区,而位点特异突变表明,该应答区的-1531位点是青蒿素应答的必需位点,该位点特异性地被一种转录因子-刺激蛋白Sp1所结合,由此认为青蒿素通过干扰Sp1与CDK4启动子区的特异结合降低CDK4的转录水平而抑制人前列腺癌细胞的细胞增殖。
Tran等[36]在研究人Ishikawa细胞后也得到与Willoughby等[35]类似的结论,即青蒿素降低CDK2和CDK4的转录和翻译水平,但染色质免疫沉淀分析表明,此机制是通过干扰转录因子NF-κB的p50/p65亚基与CDK4启动子的结合而实现的。Mondal和Chatterji[37]对人子宫颈表皮癌ME-180细胞进行分析,发现青蒿素抑制ERα和VEGF的转录和翻译,也抑制端粒酶RNA亚基 (hTR) 和hTERT亚基的表达。
Gong等[38]将青蒿素与转铁蛋白 (transferrin) 偶联,处理人前列腺癌DU145细胞和MCF7细胞可引起凋亡抑制蛋白(survivin)、细胞周期蛋白 (cyclin D1) 和原癌基因 (c-Myc) 的表达下调,以及Wnt信号通路β-catenin的调控紊乱。在乳腺癌BT4 74细胞中,青蒿素与转铁蛋白偶联物引起survivin、c-Myc和HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) 的表达下调。研究的药物浓度能够抑制BT474细胞的生长但对正常乳腺MCF10A细胞无毒性。铁元素在 青蒿素抗疟研究中具有重要的激活作用[39],青蒿素与转铁蛋白偶联的抗肿瘤研究提示其抗肿瘤分子机制也与铁元素密切相关。
2.4 青蒿素与呼吸系统肿瘤Wang等[40]发现每天以50 mg·kg-1剂量口服青蒿素,连续服用2周可以阻止Lewis肺癌 (Lewis lung carcinoma,LLC) 细胞向淋巴结和肺的转移并提高小鼠存活率,这与青蒿素处理后VEGF-C (vascular endothelial growth factor C) 的显著下降有关。在LLC细胞内,青蒿素可同时对IL-1β诱导的p38促分裂素原活化蛋白激酶 (p38MAPK) 的激活和VEGF-C表达的上调进行抑制。Wu等[41]对人鼻咽癌CNE-1和CNE-2细胞的研究表明: 青蒿素抑制莫洛尼鼠白血病病毒插入位点基因BMI-1的转录和翻译。敲除BMI-1基因则可强化青蒿素引起的p16蛋白的上调和CDK4蛋白的下调作用,反之,过表达BMI-1对这两种蛋白的调节作用减弱。认为青蒿素通过下调BMI-1产生抑制鼻咽癌细胞生长的功效。
综上所述,青蒿素抗肿瘤的分子机制主要包括: ① 调节细胞周期调控蛋白而阻滞肿瘤细胞增殖; ② 调节细胞凋亡信号转导途径而诱发肿瘤细胞凋亡; ③ 调节细胞永生化基因,影响肿瘤细胞有丝分裂次数; ④ 调节血管生成和浸润转移相关基因,影响肿瘤细胞扩散; ⑤ 关联细胞凋亡信号转导通路基因; ⑥ 对其他蛋白的调节作用。
3 小结与展望本文基于肿瘤细胞和动物模型较为清晰地揭示了三氧化二砷和青蒿素抗肿瘤的分子机制,为药物的临床应用提供了依据。但尚存少许不足之处,主要包括: ① 没有明确指出所研究基因为野生型还是突变型。这一点至关重要,因为肿瘤细胞存在大量的基因变异,特别是抑癌基因和原癌基因,同一个基因的野生型和突变型功能可能不同甚至截然相反。这也 可能是相同药物浓度对某个蛋白的调节作用不一致的原因之一。② 仅揭示了药物作用靶点的少数几个分子指标或信号通路,没有进一步综合分析与之关联的其他指标和信号通路。如分析了p53的变化但没有同时分析与p53相结合的蛋白如MDM2,或者分析了STAT3信号通路但没有同时分析与其相关的MAPK信号通路。③ 对基因的功能分析不够全面。有些基因具有双重调节作用,如c-Myc可参与细胞增殖和细胞凋亡,而研究者通常只分析了一个方面的功能。
利用高通量测序解析药物作用机制并为个体 化治疗提供依据的抗肿瘤研究越来越受到人们的重视[42, 43]。针对以上三氧化二砷和青蒿素抗肿瘤的分 子机制研究,研究者可以考虑首先揭示肿瘤细胞的遗传背景,再综合分析重要的分子靶点和信号通路,同时要充分研究各靶点基因的功能。经费充足时可采用高通量大数据解析策略 (如RNAseq) 来获得较全面的药物作用分子机制,也可以采用反向遗传学结合生物信息学的方法来揭示药物作用靶点和抗肿瘤分子机制。Yue等[44, 45]采用蛋白质组学技术研究了来源于中药灵芝中的单体化合物灵芝酸 D、B、F、K、AM1抑制HeLa细胞增殖和促进其凋亡的分子机制,成功寻找到多种靶点蛋白。进一步利用蛋白质数据库信息结合生物分析软件进行分子对接 (molecular docking),构建了与灵芝酸D作用相关的蛋白质相互作用信号网络。
总之,中药源的单体化合物来源丰富,它们是临床药物开发的宝贵财富。三氧化二砷和青蒿素的临床应用提供了中药单体化合物治疗疾病的成功案例,与之媲美的全反型维甲酸和奎宁却在西方科学体系下得以研发。虽然开发体系不同,但目前大多数药物前体都会经过现代药物研发模式的改良优化,如修饰化学结构、延长半衰期、改善水溶性、降低细胞色素氧化酶诱导和神经毒性等。因此,笔者认为,如何与现代高通量药物筛选技术和新药研发体系相结合来获得更多的具有临床应用价值的中药单体化合物,是我国科研人员面临的重大问题与挑战。本文揭示的中药单体化合物的抗肿瘤分子机制可以更好地促进中药的现代化和国际化,也为临床肿瘤治疗提供依据。
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