2016, Vol. 51
抗肿瘤靶向药物的广泛应用,明显地提高了肿瘤治疗的客观缓解率和5年生存率,重新燃起了人类“控制肿瘤”的希望。不过,部分患者治疗6～12个月后出现的耐药性 (drug resistance) 导致治疗失败,已经成为目前肿瘤研究的热点问题之一。随着基因组学、网络药理学的发展,新一代测序技术和单细胞分析等相关技术在肿瘤患者分群和药效评价中的应用,促进了对肿瘤异质性 (tumor heterogeneity) 及耐药性产生机制的深入了解。大量的研究结果表明,肿瘤异质性是引起耐药性的主要原因。在抗肿瘤精准治疗及研发抗肿瘤新药的过程中,上述问题也是需要认真面对和解决的难题。
1 肿瘤异质性及其产生机制 1.1 肿瘤异质性的概念肿瘤异质性是指同一种肿瘤内存在不同基因型的细胞而导致其表型的不一致性。根据其来源可分为患者异质性 (patient heterogeneity) 和瘤内异质性 (intratumor heterogeneity)[1]。患者异质性指相同类型的肿瘤在不同患者个体中所出现的差异,而瘤内异质性指同一患者个体身上的同一部位肿瘤内存在的明显差异。肿瘤异质性是肿 瘤治疗过程中疗效出现明显差异、产生耐药性的主 要原因。
近10多年来,靶向药物的广泛应用开创了肿瘤治疗的新时代,在征服肿瘤的策略中,普遍的观点认为通过深入研究肿瘤发生和演化的调节机制,发展多种特异性的靶向药物,就能达到目标,瘤内异质性的证实对此提出了严峻的挑战。2012年,Gerlinger 等[2]对4例肾癌患者治疗前后的样本进行外显子测 序和染色体多倍性分析,取材位点包括在同一患者的同一块肿瘤的不同部位,发现2/3以上的基因突变是不同的,许多抑癌基因如SETD2、PTEN、KDM5C缺失或突变失活,甚至是在同一块肿瘤内,同时表达“预后良好”与“预后不良”的基因。
1.2 肿瘤异质性对肿瘤研究和治疗的意义深入研究肿瘤异质性,有助于分析肿瘤产生的机制、演化规律,解释肿瘤治疗过程中出现不同反应性的原因。近年来,肿瘤免疫疗法的良好疗效受到极大的鼓舞,得到了全球研究者的高度重视,也被投资者广泛关注,甚至有人乐观预测从此人类就能“根治肿瘤”、“战胜癌症”。实际上,如何选择免疫治疗的作用靶点仍然是治疗的难点,并不是所有肿瘤均适合免疫疗法,其根本的原因还是肿瘤异质性在作祟。肿瘤异质性对肿瘤的生物标志物预测也提出了挑战,如果取材的部位过少,就有可能影响检测评价的效果[1]。
1.3 肿瘤异质性产生的机制肿瘤异质性的产生机制可以追溯到正常的人体细胞。近年来,随着单细胞全基因组测序技术的发展,发现正常细胞中每个细胞都是不同的: 基因组、表型、发育阶段以及基因随机性表达,均可造成同一组织起源的一群细胞之间的异质性[3]。只不过是人体的功能受整体的调节机制所控制和协调,部分细胞的异质性对正常生理功能并没有明显的影响。
关于肿瘤异质性的来源,最为普遍的观点是来自肿瘤干细胞。肿瘤干细胞是指肿瘤中存在的一小群具有无限自我更新能力的干细胞样细胞,可以演化成表型不同的细胞群,具有强致瘤性。受细胞分化、克隆演化和微环境等因素影响,导致表型与功能的异质性[4]。异质性的保持与随机性相关。通过流式细胞仪把乳腺癌细胞分为3个亚群: 干细胞样亚群、基础细胞亚群和官腔上皮亚群。将3个亚群的细胞继续培养,每个亚群仍然产生3个亚群,细胞中存在随机性的转换机制,保持干细胞样细胞的平衡[5]。
细胞融合可能是具有转移能力的肿瘤细胞异质性的来源。使用乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MA11与人正常骨来源的基质多能细胞共培养,可以观察到自发融合成杂合细胞,分析DNA含量为非整倍体; 把杂合细胞接种到免疫缺陷的小鼠上,具有致瘤性,可以观察到转移能力明显增强的乳腺肿瘤[6]。
从遗传角度分析异质性,肿瘤细胞的遗传物质不稳定性是原因之一,肿瘤细胞是异倍体。在结肠癌中,发现3个与DNA复制相关的基因MCD4、MEX3C和ZNF516,上述基因的丢失导致DNA复制时出现应激,导致出现异倍体和异常的染色体,从而出现异质性的肿瘤细胞[7]。三阴性的乳腺癌是目前治疗的难点。使用单细胞基因组测序技术,追踪乳腺癌细胞的克隆演化,可以观察到异常染色体只出现在肿瘤的早期,三阴性的乳腺癌细胞点突变逐步增加,提高了13倍,而雌激素受体阳性的细胞没有发现明显的点突变,该结果解释了乳腺癌治疗效果差异的分子机制[8]。
利用H-Ras基因突变作为克隆标记物,深入分析人乳腺癌细胞系不同克隆之间保持异质性的机制,发现Wnt信号通路的活化能促进不同克隆的合作,具有不同H-Ras突变的亚群和周围没有突变的亚群,通过正常细胞产生Wnt分子维持异质性[9]。使用小鼠模型,分析MDA-MB-468乳腺癌不同亚克隆的生长情况,发现非细胞自主性生长是保持瘤内克隆异质性的原因。少数快速生长的细胞通过克服环境限制和细胞间竞争,引起肿瘤塌陷[10]。肿瘤如何突破空间限制？通过建立模型和实验方法结合,发现在临床显示症状的时间内,即使少数优势细胞也能取代原来的肿瘤质量,限制了瘤内异质性的产生,该机制与耐药性产生的机制相同[11]。
2 抗肿瘤靶向药物的耐药性抗肿瘤靶向药物 (antitumor targeted agents) 是指通过作用于特定靶点而抑制肿瘤细胞增殖和生长的药物。目前主要有小分子化合物和抗体药物2大 类,作用的靶点多数在细胞膜表面的酪氨酸激酶及其相关的信号通路,如表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receiptor,EGFR) 和Raf蛋白等。大量抗肿瘤靶向药物在临床的应用,极大地提高了治疗肿瘤的疗效。
2.1 肿瘤耐药性的概念耐药性是指患者对某类抗肿瘤药物未出现治疗响应的现象。可以分为治疗前 就已经存在的天然耐药性(natural resistance),以 及治疗过程中逐步出现的获得型耐药性 (acquired resistance)。就细胞毒抗肿瘤药物而言,耐药性的机制研究已经进行了30多年,细胞膜上具有外排泵功能的蛋白如P-糖蛋白的过度表达,是发生耐药性的主要原因。虽然抗肿瘤靶向药物明显地提高了临床疗效,但仍然有部分患者在治疗6～12个月后出现耐药性,导致治疗失败。鉴于靶向药物只是对少数肿瘤患者有效,目前更多地研究治疗后出现的获得型耐药性。
对耐药性结肠癌全基因组测定的结果表明,耐药性机制十分复杂,也包括外排泵功能的变化。对 92例患者肿瘤的全基因组分析,发现抑癌基因RB1、NF1、RAD51B和PTEN的失活十分常见,在原发性耐药中可以观察到CCNE1的扩增; 此外,还常检测到BRCA1与外排泵基因MDR-1启动子的融合。该 研究[12]表明,难治性结肠癌的耐药性是多种基因互作的结果,导致对细胞毒药物和靶向药物治疗均不响应。
2.2 靶点突变引起的耐药性肿瘤对靶向药物耐药的常见突变是靶点突变,导致药物失去作用。从第一个靶向药物伊马替尼出现以来,靶向药物的耐药性已经有大量的报道。AZD9291是一种专门针对含EGFR T790M突变的非小细胞肺癌的靶向药物,口服效果良好。使用来自血浆的循环DNA,分析7例对AZD9291耐药的患者样本,发现其中一例出现C797S的突变。继续分析最初对AZD9291治疗有反应,后来出现耐药的15例患者,分为3种类型: 6例出现C797S突变; 5例仍然维持T790M突变但未出现C797S突变; 4例丧失了T790M突变[13]。结果表明,靶点突变导致耐药的机制比较复杂。
2.3 激活靶向相关的信号通路引起耐药性靶向药物维莫非尼 (vemurafenib) 特异地作用于含有B-Raf V600E错义突变的肿瘤,对80% 突变黑色素瘤具有良好的治疗效果,但对含有相同突变的结肠癌患者,有效率仅为5%,导致巨大差异的原因是负反馈激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 信号通路。使用RNA干扰技术筛选激酶基因文库,发现维莫非尼在结肠癌中能负反馈地激活表皮生长因子受体EGFR,导致其失效; 使用EGFR的抑制剂与维莫非尼合用,明显地抑制了结肠癌的增殖[14]。部分黑色素瘤细胞对维莫非尼耐药的一种机制是抑制SOX10蛋白,导致转化生长因子β(transformation growth factor β,TGF-β) 信号通路的激活进而上调EGFR的表达,产生了耐药性[15]。在黑色素瘤中存在非基因组变化引起的对靶向药物的耐药性。由于转录或甲基化等原因,导致c-Met、LEF1和YAP1蛋白表达失调,凋亡敏感性降低,出现耐药。此外,这些耐药细胞丢失免疫细胞CD8功能和抗原呈递能力,对程序性死亡蛋白-1 (programmed death-1,PD-1)/PD-L1免疫药物耐药[16]。
2.4 外泌体引起的耐药性外泌体 (exosome) 是指分泌到细胞外,具有膜结构的小囊泡。外泌体含有信使RNA或微小RNA,参与信息传递,介导耐药性的形成。在神经胶质成纤维瘤患者中,检测到针对EGFR靶向药物的染色体外DNA介导耐药性[17]。细胞基质影响乳腺癌的药物反应,有一种含有RNA的外泌体把耐药性传递给乳腺癌细胞,其作用机制与Notch3/STAT1抗病毒信号通路有关[18]。使用小鼠和人多发性骨髓瘤细胞,观察骨基质细胞来源的外泌体对耐药性的影响,发现外泌体能激活JNK激酶、p53和AKT激酶等信号分子,导致瘤细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药[19]。
2.5 肿瘤周围微环境引起的耐药性肿瘤周围的微环境不仅与肿瘤的发生和发展相关,还与耐药性的产生密切相关。以细胞毒药物为例,也可说明引起耐药性的机制。使用吉西他滨和顺铂处理人膀胱癌细 胞,可以观察到引起肿瘤细胞凋亡的同时,分泌的前列腺素2促进干细胞增殖,而被环氧酶-2抑制剂赛来昔布 (celecoxib) 明显抑制[20]。利用鳞状细胞癌干细胞,观察血管中分泌的TGF-β对其耐药性的影响,可以观察到基质肿瘤干细胞快速生长,其机制是通过稳定P21蛋白而使转录因子NRF2活性升高,引起抗氧化物质谷胱甘肽升高而对抗肿瘤药物顺铂耐药,耐药细胞快速生长而引起肿瘤的复发[21]。
使用靶向药物维莫非尼处理黑色素瘤细胞,可以观察到细胞分泌组 (secretome) 蛋白表达明显增多引起耐药性,该作用通过抑制转录因子FRA1进行。当Raf和mTOR抑制剂合用时,明显地抑制了耐药细胞群的生长,说明组合用药可以明显地抑制耐药性的产生[22]。
2.6 其他作用机制引起的耐药性除了上述的因素外,对靶向药物的耐药还有其他机制起作用。胰腺导管腺癌是一种难以治疗的肿瘤,中位生存率为6个月。使用可诱导的K-Ras小鼠胰腺癌模型,发现撤除诱导物,肿瘤萎缩后4～5个月重新生长,表明具有明显的耐药性。基因芯片分析发现这些肿瘤细胞调节线粒体功能、自噬和溶酶体活性的基因表达明显增加。使用抑制线粒体氧化磷酸化的抑制剂寡霉素能明显增加靶向MEK1激酶药物AZD833+BEZ235 (针对PI3K/ mTOR激酶双靶向抑制剂) 的敏感性[23],表明线粒体的氧化磷酸化与胰腺癌的治疗密切相关。
使用多种激酶靶向药物维莫非尼、克唑地尼和拉帕地尼处理多种类型的肿瘤细胞,发现肝细胞生长因子能赋予肿瘤细胞对多数药物的耐药性。在小鼠体内,也证实该生长因子的含量明显影响荷瘤小鼠的存活率。该机制与激活AKT和ERK信号通路有关[24]。
3 克服靶向药物耐药性的药物研发策略肿瘤耐药性尤其是多药耐药性经过30多年来的研究,尽管发现了多种逆转药物,但没有一种药物成功上市。克服靶向药物耐药性的药物研发策略分为2个方面: 一是对相关化合物进行结构改造和优化,使肿瘤细胞不对其产生耐药性; 二是使用作用机制完全不同的药物。对于第一种策略,已经进行了大量研究。例如通过对维莫非尼的改造,得到了所谓悖论粉碎剂 (paradox breaker) 的化合物PLX7904和PLX8394,这些化合物对维罗非尼耐药的细胞仍然有很强的 活性,没有激活MAPK的作用。通过化学构象分析,B-Raf蛋白L505位在与上述化合物结合中起关键作用[25]。对于第二种策略的研究,除了选取其他靶点的抗肿瘤药物之外,启动蛋白降解通路可能是克服耐药性的重要策略。以转录活化因子BRD4为靶点的JQ1和邻苯二甲酰亚胺形成偶联物dBET1,该化合物能在1 h内快速降解BRD2、3、4,检测细胞内7 000多种蛋白含量的变化,只对这些蛋白有特异的降解作用,对其他蛋白没有影响[26]。非小细胞肺癌对靶向药物吉非替尼耐药的细胞中,AXL受体酪氨酸激酶活性明显升高,使用芫花乙酯 (yuanhuadine) 能特异地降解该蛋白,从而降低耐药性[27]。
4 研究展望靶向药物和肿瘤免疫疗法的不断发展,明显提高了肿瘤的精准治疗疗效。不过,要实现真正的精准治疗仍然需要大量的基础研究,异质性及器官和组织的差异性仍然是最大的障碍[28]。根据药物靶向的特异性生物标志物筛选阳性人群,然后对其进行随机对照评价的富集设计 (enrichment strategy) 模式,明显加快了抗肿瘤靶向药物的临床评价进度,提高了上市成功率[29]。在新型的靶向抗肿瘤药物研发模式中,加强对肿瘤耐药性和异质性的相关研究,使用更为可靠的技术检测分子标志物,无论对抗肿瘤药物的研发及临床肿瘤的分型治疗均具有重要的意义。
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