近年来,我国癌症发病形势严峻,发病率与死亡率呈逐年上升的趋势。据全国肿瘤登记中心发布的《2015年中国肿瘤登记年报》显示,2011年我国新增癌症病例约337万例,比2010年增加28万,这相当于每分钟就有6个人得癌症。从全国看,居于恶性肿瘤发病第一位的是肺癌,其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌; 死亡率排第一位的仍是肺癌,其次为肝癌、胃癌、食管癌和结肠癌。在世界范围内,预计新发癌症人数将由2008年的1 270万,跃升到2030年的2 000万以上^[1]。

目前,临床上治疗肿瘤主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗以及最新的生物免疫治疗等。早期肿瘤患者通常采取手术切除肿瘤组织,并辅以放化疗治疗,中晚期病患尤其晚期患者往往只能采取放化疗等治疗手段; 然而许多患者在常规化疗过程中出现多药耐药性,导致病情进一步恶化,或者部分患者经过治疗,暂时缩小甚至消除肿瘤块,但肿瘤复发时常发生 (图 1)。为此,许多研究者在体内外模拟临床治疗过程,研究结果证实药物处理的肿瘤细胞表现出许多异于亲本肿瘤细胞的生物学特性,包括肿瘤干细胞相关特性^{[2, 3, 4, 5]}、代谢水平以及信号通路发生改变等。由此可知,药物诱导型肿瘤细胞生物学特性的改变可能是肿瘤耐药和复发的重要原因之一。本文综述药物诱导型肿瘤细胞的特性及治疗措施,为药物研发和临床治疗癌症提供理论依据和新的治疗策略。

图 1

图 1 药物诱导型肿瘤细胞是肿瘤复发、转移及耐药的根源

国内外许多文献报道药物诱导肿瘤细胞表现出多种肿瘤干细胞相关的生物学表型特征,包括侧群细胞 (side population,SP) 增多、体外形成克隆及肿瘤球、在体致瘤能力增强等。Rizzo等^[3]检测经顺铂、紫杉醇等抗癌药物短期处理的卵巢癌细胞,药物处理组SP细胞比例较亲本细胞明显增加,表明药物诱导型卵巢癌细胞具有SP细胞的外排能力,这可能与药物诱导型肿瘤细胞耐药有关。药物诱导型肿瘤细胞具有很强的自我更新能力,在体外可以形成细胞克隆及肿瘤球。顺铂诱导的卵巢癌、肺癌等肿瘤细胞体外克隆及肿瘤球形成率明显增多^[3]; 非小细胞肺癌PC9耐吉非替尼细胞体外克隆 形成能力相比吉非替尼敏感型细胞显著增强,耐吉非替尼细胞在体成瘤率增加^[6]。药物诱导型肿瘤细胞在体致瘤率也显著提高,研究人员利用裸鼠建立结肠癌移植瘤模型给予环磷酰胺及伊立替康等抗肿瘤药物,给药组相对于空白组肿瘤干细胞比例增加,二次成瘤率提高。这可能是顺铂抑制或杀伤肿瘤细胞,肿瘤干细胞因具有低的增殖活性及耐药性,避免了药物杀伤,增加了药物诱导型肿瘤细胞中肿瘤干细胞的比例,进而增强体外克隆形成能力、肿瘤球形成能力以及在体致瘤能力^[4]。有研究^[7]表明高表达组蛋白甲基转移酶EZH2 (enhancer of zeste homolog 2) 与肿瘤进展呈正相关,并且高表达EZH2是生存期长短的一个重要预测指标。RNA干扰敲除EZH2,细胞周期阻滞于G₁期,抑制了细胞增殖、侵袭及转移能力; 进一步研究发现,转化生长因子β1 (tumor growth factor-β1,TGF-β1) 在mRNA和蛋白水平均表达下调,E-cadherin表达上调。因此,研究者认为EZH2可能是通过调节TGF-β1调控细胞侵袭及转移。有学者^[8]证实接受索拉菲尼等分子靶向药物短期治疗的患者,肿瘤组织检测显示索拉菲尼处理增强了肿瘤细胞的侵袭能力,部分病患还出现淋巴结及远端转移现象。Ebos等^[9]报道在重症联合免疫缺陷 (severely combined immune deficiency,SCID) 小鼠接种231/LM2-4^LUC+细胞之前或之后给予抗血管新生药物舒尼替尼7天,相对于空白组均可加速转移性肿瘤生长,显著降低SCID小鼠生存期,肿瘤细胞接种27天后,小鼠活体荧光检测显示舒尼替尼处理组转移现象明显。

药物诱导型肿瘤细胞表达多种维持胚胎干细胞的功能基因或蛋白,其中包括性别决定区Y框蛋白2 [(sex determining region Y)-box 2,SOX2]、八聚体结合转录因子4 (octamer- binding transcription factor 4,OCT4) 以及Nanog等。转录因子SOX2是SOX基因家族的一员,在早期胚胎发生、神经分化和晶状体发育等重要发育事件中起着关键的作用; OCT4是POU转录因子家族中的一员,主要在胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中表达,对于维持胚胎干细胞的多能性和自我更新有极其重要的作用; 而Nanog则是近年来在胚胎干细胞中发现的又一重要的转录因子,对维持胚胎干细胞自我更新及全能性起着关键性作用。Barr等^[2]发现,顺铂耐药株中SOX2、OCT4和Nanog等转录因子表达异常增加,这可能与顺铂诱导肿瘤干细胞蓄积相关。白细胞分化抗原133 (cluster of differentiation 133,CD133) 最早是造血干细胞一种表面标记物,近些年研究发现,CD133也在正常干细胞和多种实体瘤干细胞中表达,并且有研究指出CD133蛋白与肿瘤的自 我更新、分化潜能、信号转导、药物耐受及预后有 密切关系; Liu等^[5]研究确证了药物诱导型肿瘤细胞中CD133⁺肿瘤干细胞比例显著增加。乙醛脱氢酶 (aldehyde dehydrogenases,ALDH) 是人体内重要的氧化酶之一,主要参与细胞内醛类物质的氧化过程。大量研究发现,ALDH在肿瘤干细胞的调控机制中起着重要的作用,如细胞增殖、分化、细胞周期阻滞及细胞凋亡等。在吉非替尼耐药型PC9细胞中,干扰 素8 (interleukin 8,IL-8) 表达上调,并且促进耐吉非替尼PC9表达肿瘤干细胞相关特性,包括ALDH活性、干细胞相关基因及蛋白等。敲除IL-8可逆转吉非替尼耐药株干细胞相关特性的表达,因此研究者认为IL-8可能是逆转表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药的重要靶点^[6]。三磷酸腺苷结合盒 (adenosine triphosphate binding cassette,ABC) 转运蛋白主要包括P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白和乳腺癌耐药蛋白,ABC转运蛋白过表达与肿瘤细胞多药耐药密切相关,是导致化疗失败的主要原因^[10]。药物诱导型细胞较亲本细胞增强了细胞耐药性。低浓度顺铂 (IC₂₀) 处理非小细胞肺癌细胞 (NCI-H460/H661),三磷酸腺苷结合转运蛋白G2/B1 (ATP-binding cassette trans­porter G2/B1,ABCG2/ABCB1) mRNA表达上调,顺铂处理组耐阿霉素能力远大于溶剂处理组,这与药物诱导肿瘤干细胞蓄积或与药物诱导肿瘤细胞高表达ABC转运蛋白密切相关^[5]。

药物诱导肿瘤细胞在细胞代谢水平发生改变,以此来满足肿瘤细胞的生长及发展。阿霉素诱导型乳腺癌细胞显著降低了蛋白、核酸、谷胱甘肽的生物合成及糖酵解水平,提高了甘油代谢水平。甘油代谢水平上调和谷胱甘肽合 成下调促进活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 产生及P糖蛋白的上调,进而导致肿瘤细胞耐药^[11]。研究人员提出通过检测细胞代谢标志物或许可用来评估抗肿瘤药物的疗效及筛选新的候选抗肿瘤药物。Cavill等^[12]发现顺铂诱导肿瘤细胞在三羧酸循环、丙酮酸代谢、脂蛋白摄取和核苷酸合成等代谢通路发生改变。肿瘤细胞增殖过程中对能量、胆碱及核酸等需求旺盛,因此糖酵解等糖代谢途径、核苷酸从头合成途径和补救途径以及胆碱合成途径增强,以满足细胞旺盛的生长需要。Roodhart等^[13]发现顺铂可以诱导内源性间充质干细胞活化,同时释放多不饱和脂肪酸等因子诱导肿瘤细胞产生多药耐药性。研究人员表示间充质干细胞可能是逆转化疗耐药及提高化疗效果的重要靶标。von Stechow等^[14]研究顺铂诱导处理的胚胎干细胞代谢谱图,发现核苷酸代谢、尿素循环、精氨酸和脯氨酸代谢等发生了改变,同时增加了代谢产物前体及相关代谢酶,提高了细胞抗氧化能力。

信号通路是细胞外分子信号经细胞膜传入细胞内发挥作用的一系列酶促反应的过程。药物作用于肿瘤细胞,经过信号调节通路传递,进而在基因、蛋白及生物学表型方面发生变化。受药物刺激,药物诱导型肿瘤细胞的多条信号通路发生改变,如Wnt和Notch等。Wnt信号通路对于维持细胞自我更新、增值、分化及凋亡有重要的作用,Wnt通路调控失常是许多细胞癌变的主要原因,顺铂处理非小细胞肺癌A549细胞,Wnt/β-catenin通路异常活化^[15],刺激肿瘤干细胞相关基因蛋白活化,从而使药物诱导型肿瘤细胞表现肿瘤干细胞相关生物学特性 (图 2A)。Notch信号通路在维持干细胞正常生长方面起着重要作用,有学者^[16]报道,ABCG2转运蛋白阳性表达的神经胶质瘤干细胞Notch基因高表达,同时神经胶质瘤干细胞中Notch1过表达可以促进肿瘤细胞的生长。Liu等^[5]发现顺铂诱导非小细胞肺癌干细胞蓄积,同时诱导型肿瘤细胞Notch信号通路异常活化,经深入研究证实顺铂通过活化Notch信号通路诱导非小细胞肺癌干细胞蓄积 (图 2B)。抗血管新生抑制剂,如贝伐单抗和舒尼替尼等通过缺氧诱导乳腺癌干细胞数量增多,进一步研究发现抗血管新生药物在缺氧条件下,通过激活AKT/β-catenin信号通路诱导肿瘤干细胞的比例增加。Chinchar等^[17]研究表明基底样三阴性乳腺癌在体动物模型给予舒尼替尼,提高了乳腺癌干细胞CD44⁺/CD24^-的比例 (3.6% ± 0.3% vs 6.4% ± 0.5%; P < 0.01)。1 μmol∙L^-1舒尼替尼分别处理人乳腺癌MDA-MB-468细胞24、48和72 h,Notch1表达量相对于空白组分别增加了2、2.5和5.7倍(P < 0.01); 同时,研究者发现舒尼替尼可显著抑制基底样三阴性乳腺癌血管新生,舒尼替尼处理组相对于空白组,明显降低了血管平均密度。通过以上结果,研究者猜测舒尼替尼可能通过Notch信号通路活化及诱导产生缺氧环境增加了肿瘤干细胞的数量。药物诱导型肿瘤细胞常出现间质表皮转化因子 (也称为肝生长因子受体,cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-Met) 信号通路激活现象,通常c-Met的激活是通过肝生长因子 (hepatocyte growth factor,HGF) 与c-Met结合,导致受体自身磷酸化,增强了c-Met酪氨酸激酶的活性,使磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K) 等磷酸化,进而促进肿瘤的生长及侵袭。Jun等^[18]发现多形性胶质瘤细胞经过酪氨酸激酶抑制剂治疗后,c-Met信号通路活化,同时c-Met阳性表达的细胞在细胞增殖、耐药及在体致瘤能力方面均显著增强 (图 2C)。

图 2

图 2 药物诱导型肿瘤细胞的以下信号通路发生改变. A: Wnt信号通路; B: Notch信号通路; C: c-Met信号通路. APC: 大肠腺 瘤息肉蛋白; CK1: 酪蛋白激酶1; GSK-3β: 糖原合成酶激酶3β; HGF: 肝生长因子; LRP-5/6: 低密度脂蛋白受体相关蛋白; NCID: Notch胞内段; PI3K: 磷脂酰肌醇3激酶; TCF/LEF: T细胞因子/淋巴增强因子; TKI: 酪氨酸激酶抑制剂

药物诱导型肿瘤细胞表现为侵袭转移能力增强、克隆形成和成球能力增 强以及在体致瘤能力提高。根据上述肿瘤细胞的生 物学特性,可以从以下方面进行防治: ① 药物诱导肿瘤干细胞蓄积,并且肿瘤干细胞往往分化异常或分化受阻,因此可通过抑制肿瘤干细胞增殖、诱导肿瘤干细胞分化或凋亡来改变药物诱导型细胞生物学表型。诱导分化剂可以诱导肿瘤干细胞分化为不同类型的肿瘤细胞^[19],再联合化疗药物治愈癌症; 使用诱导分化剂全反式维甲酸可抑制由顺铂诱导产生的CD133⁺肿瘤起始细胞,临床上联合使用全反式维甲酸和顺铂,降低肿瘤起始细胞数量,抑制肿瘤细胞增殖,减少肿瘤扩散和转移。最近Di Pompo^[20]的研究显示新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (histone deacetylase inhibitor,HDACI) 抑制骨肉瘤、尤文氏肉瘤干细胞生长,诱导干细胞分化及凋亡; HDACI如辛二酰苯胺异羟肟酸等抑制组蛋白去乙酰化,高度乙酰化的组蛋白激活转录因子,促进基因表达,从而使细胞生长停滞,诱导肿瘤干细胞分化和凋亡,进而抑制肿瘤生长。此外,本课题组研究发现的新型HDACI SNOH-3可以逆转非小细胞肺癌紫杉醇耐药,诱导细胞凋亡,抑制细胞侵袭转移及血管新生^[21]。② 可通过抑制药物诱导型肿瘤细胞侵袭及转移逆转药物诱导作用。有研究表明在晚期高转移性卵巢癌组织中EZH2和TGF-β1均高表达,并呈现明显正相关,EZH2可能通过调节TGF-β1的表达来调控细胞侵袭及转移。该研究提示靶向TGF-β1信号通路,可以抑制药物诱导型肿瘤细胞侵袭及转移,阻止病情进一步恶化^[7]。③ 破坏肿瘤干细胞微环境。肿瘤干细胞微环境维持肿瘤干细胞自我更新,调控肿瘤细胞分化进程,破坏肿瘤干细胞依赖的微环境,从而严重影响肿瘤干细胞的自我更新及分化能力。Calabrese等^[22]证实脑癌干细胞位于内皮细胞附近,脱离该区域会影响肿瘤干细胞的增殖能力; 此外,与内皮细胞共注射的脑癌干细胞增殖能力明显高于单独注射的脑癌干细胞,在体动物及体外细胞实验均证实了上述实验现象。

药物诱导型肿瘤细胞在基因蛋白水平发生诸多改变。多项研究^{[3, 10]}证实药物诱导型肿瘤细胞ABCG2转运蛋白表达明显增加,因此抑制ABCG2转运蛋白可以很大程度逆转肿瘤细胞耐药。酪氨酸激酶抑制剂可通过PI3K/AKT途径抑制ABCG2的表达,逆转耐药; 另外ABCG2接触抑制剂也可作为逆转耐药的策略之一^[10]。药物诱导型肿瘤细胞中ALDH表达异常增加,并且ALDH高表达的前列腺肿瘤细胞致瘤率远高于ALDH低表达细胞。有学者^[23]证实雷帕霉素降低了骨肉瘤细胞中ALDH的表达及其活性; 同时,也降低了肿瘤细胞侵袭及转移能力,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。药物诱导型肿瘤细胞高表达CD133、CD44、SOX2和OCT4等肿瘤干细胞相关的蛋白,这些蛋白在肿瘤干细胞生长发育过程中起着重要作用,靶向这些异常表达的蛋白可抑制药物诱导型肿瘤细胞中肿瘤干细胞的比例,从而逆转药物诱导型肿瘤细胞生物学特性^{[7, 24]}。药物诱导肿瘤细胞还可以抑制细胞凋亡,所以抑制抗凋亡基因及蛋白,亦或激活促凋亡基因和蛋白,可诱导肿瘤细胞发生凋亡^[25]。有文献^[26]报道受体酪氨酸激酶AXL活化导致肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性,同时表现出上皮间质转化 (epithelial- mesenchymal transition,EMT) 现象,进一步研究发现,AXL或其配体生长停滞特异性蛋白6 (growth arrest specific gene 6,GAS6) 表达增加均可对酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性,这些证据显示AXL是逆转肿瘤细胞耐药及EMT现象的关键蛋白。有学者^[27]研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA) 可以抑制肝肿瘤干细胞自我更新及诱导干细胞分化,TSA浓度依赖性抑制Nanog^pos肝癌Huh7 细胞自我更新能力,200 nmol∙L^-1 TSA几乎完全抑制 了肿瘤球及平皿克隆的形成,同时TSA可显著降低SOX2、Nanog和Bmi-1等肿瘤干细胞相关因子的表达水平,具有统计学意义; 进一步研究发现HDAC3调节肿瘤干细胞自我更新,使用HDAC3 siRNA处 理由Huh7筛选的Nanog^pos肿瘤干细胞,显著降低 肿瘤干细胞相关因子Nanog和SOX2等的表达水平及肿瘤球和平皿克隆形成能力,抑制在体成瘤效率; HDACI可以逆转肿瘤干细胞对索拉菲尼产生的耐药性,2.5 μmol∙L^-1索拉菲尼和50 nmol∙L^-1 TSA分别单独作用或联合作用Nanog^pos Huh7细胞48 h,细胞生存率分别为50%、70% 和30%。HDAC3是逆转肿瘤干细胞的一个重要靶点,HDACI通过抑制HDAC3,进而阻止HDAC3对组蛋白的修饰,影响肿瘤干细胞自我更新及分化。

药物诱导型肿瘤细胞在糖类、脂类、蛋白及核酸等细胞代谢通路发生多种变化,因此开发针对细胞代谢通路关键酶的药物,可以逆转诱导型细胞的代谢变化。von Stechow等^[14]发现,在顺铂诱导处理的肿瘤细胞中,有144个与代谢相关的酶发生改变,包括脂代谢和磷酸甘油代谢等,其中调节脂代谢的p53靶基因表达下调,而调节氨基酸及核酸代谢的p53靶基因上调。p53可能通过调节相关代谢的酶影响细胞代谢水平来应对顺铂诱导的基因损伤,因此靶向p53或其下游代谢调节相关酶或许可以改变肿瘤细胞代谢水平。低水平的 代谢及增强的氧化应激反应是阿霉素诱导型肿瘤细胞产生耐药性的主要原因。阿霉素处理MCF-7阿霉素敏感性细胞,降低了蛋白合成、核酸合成及糖酵解水平,提高了甘油代谢水平; 同时,研究者进一步发现阿霉素可以浓度依赖性诱导细胞上调P糖蛋白和ROS的产生,利用10 mmol∙L^-1 N-乙酰半胱氨酸和 1 μmol∙L^-1阿霉素同时处理MCF-7敏感性细胞可以降低阿霉素诱导的P糖蛋白和ROS增加^[11]。药物诱导型肿瘤细胞需要糖酵解产生的能量维持细胞快速生长,所以应用糖酵解的抑制剂2-脱氧葡萄糖可以降低糖酵解水平,抑制肿瘤快速生长,进而杀死肿瘤细胞^[12]。

药物诱导型肿瘤细胞Wnt等信号通路异常活化,抑制这些信号调节通路可逆转药物诱导型肿瘤细胞的产生。氯化锂诱导处理A549细胞,促进β-catenin和Wnt经典的靶标周期蛋白D1累积,显著提高增殖、克隆形成、迁移及耐药能力。研究者通过RNA干扰技术干扰β-catenin的表达,抑制Wnt信号通路,降低了周期蛋白D1的表达,同时减弱细胞增殖能力,降低克隆形成、侵袭转移能力^[15]。γ分泌酶是膜内蛋白水解酶,主要参与β-淀粉样蛋白前体和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解过程; γ分泌酶水解Notch跨膜结构域,水解后释放到胞内的Notch片段用于调节基因转录。Liu等^[5]证实通过抑制γ分泌酶或利用shRNA干扰Notch1的表达,显著降低CD133⁺肿瘤干细胞的比例,逆转肿瘤细胞耐药,提高肿瘤细胞对阿霉素和紫杉醇等药物的敏感性,在体水平也确证了上述现象。酪氨酸激酶抑制剂通常使肿瘤细胞处于缺氧状态,缺氧环境进一步激活缺氧诱导因子α(hypoxia inducible factor 1α,HIF1α),通过PI3K/AKT或细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinase,ERK) 信号通路,促进肿瘤细胞增殖; 抑制PI3K/AKT或ERK信号通路显著降低了HIF1α介导的肿瘤细胞的生长^[28]。因此,联合酪氨酸激酶抑制剂和PI3K/AKT或ERK信号通路抑制剂可能会取得更好的治疗效果。克唑替尼、伊马替尼和维罗菲尼等分子靶向抗肿瘤药物长期使用往往产生耐药现象,研究者通过大规模RNA干扰技术筛选,发现肿瘤细胞中一个中介体转录复合物亚基MED12敲除后,激活TGF-β信号通路,导致肿瘤细胞产生耐药现象。体外细胞实验使用干扰RNA敲除MED12,上调了TGF-β靶蛋白血管生成素相关蛋白、转胶蛋白和富半胱氨酸蛋白的表达,进一步研究发现MED12可通过负调节转化生长因子β受体2 (transforming growth factor β receptor type 2,TGF-βR2) 抑制TGF-β信号通路; 因此,抑制MED12缺失型肿瘤细胞的TGF-βR2,进而抑制TGF-β信号通路,可 逆转细胞对分子靶向药物产生的耐药。TGF-βR抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂联合使用可协同抑制MED12缺失型肿瘤细胞增殖,1 μmol∙L^-1 TGF-βR抑制剂LY2157299与300 nmol∙L^{-1克唑替尼或}100 nmol∙L^-1吉非替尼联合作用PC9细胞,相比空白及单独给药组显著抑制了MED12缺失型PC9细胞的增殖。上 述结果提示TGF-β信号通路是MED12缺失型肿瘤 细胞逆转耐药的重要靶标^[29]。

近些年,随着我国经济的飞速发展,每年新增癌症患病人数也急剧增加。临床上采用放化疗治疗手 段,然而治疗疗效不佳; 长期应用细胞毒类和分子靶向抗肿瘤药物,可诱导肿瘤细胞发生多种生物学特性的改变,进而导致化疗效果不佳。本文简要介绍了几种临床上较常用化疗药物诱导产生的细胞生物学特性的变化,包括生物学表型、基因和蛋白水平变化、代谢水平变化以及信号通路改变等特性。同时,本文针对以上药物诱导型肿瘤细胞生物学特性,提出对应的药物防治策略,为临床治疗及药物研发提供理论基础。

由于目前临床上应用的化疗药物多种多样,并且不同药物诱导的肿瘤细胞生物学特性各异,本文未能一一详细阐释; 同时,药物诱导型细胞生物学特征及其形成机制错综复杂,需要研究人员给予更多的关注。随着基因组、代谢组和蛋白质组等组学的研究深入,研究人员利用这些高通量筛选手段研究不同化疗药物对肿瘤细胞生物学特性的影响及其作用机制,为临床用药提供理论依据,为新的药物研发指引方向。