槟榔或槟榔果实,是广泛使用的嗜好品。研究表明,槟榔咀嚼物的使用与口腔癌、肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症、肝硬化和肝细胞癌等相关[1, 2]。槟榔碱 (图 1) 是槟榔所含的主要生物碱,对肝细胞有毒性[3, 4, 5],且巯基消耗及活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 攻击是槟榔碱所致肝损伤的主要原因[5, 6]。此外,CYP450酶在槟榔诱导的N-亚硝胺诱变激活中也扮演了关键角色[7]。
肝脏CYP2E1过表达或活性异常增高,是肝脏ROS增生的重要原因。由ROS引发的氧化应激是各种肝病常见的病理生理机制[8]。作者曾研究了槟榔碱灌胃给药一周对大鼠肝脏氧化应激及几种重要CYP450酶活性的影响,结果提示槟榔碱对大鼠肝脏CYP2E1活性的诱导作用,可能是槟榔碱诱导大鼠肝脏氧化应激损伤的重要机制[9]。本文进一步研究了槟榔碱体内对大鼠肝脏CYP2E1的调控机制。
材料与方法 实验动物雄性Wistar大鼠(6周龄,体重200~250 g) 购自湖北省实验动物研究中心 [许可证号: SCXK (鄂) 2008-0005]。
主要试剂及仪器氢溴酸槟榔碱 (AH,美国Sigma公司); RIPA裂解液,超敏ECL化学发光试剂盒 (中国碧云天生物技术研究所); PageRuler 预染蛋白 Ladder ( Thermo Scientific,美国 ) ; 小鼠抗β-actin 单克隆抗体 (Santa Cruz,美国); 兔抗大鼠CYP2E1抗体 (上海Abcam公司); HRP-山羊抗兔IgG、HRP-山羊抗小鼠IgG (KPL公司,美国); TRIzol Reagent (Invitrogen,美国); PCR引物 (上海桑尼生物); ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒、THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo Co.,Ltd.,日本); 氯唑沙宗,6-羟基氯唑沙宗 (TRC,加拿大)。BCA蛋白测定试剂盒 (Rockford,美国)。
组织匀浆器 (IKA,德国); 核酸蛋白测定仪 (Eppendorf公司,德国); CFX ConnectTM实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国); DYY-6C型电泳仪、DYC-40A型垂直电泳槽及DYC-40A型电转仪 (北京市六一仪器厂)。
实验动物分组与给药方法雄性Wistar大鼠饲养于SPF级动物房 (温度在20~25 ℃,相对湿度在40%~70%),自由取食、进水,昼夜交替时间为12/ 12 h。给药前禁食12 h,并随机分为低、中、高剂量 (4、20和100 mg·kg-1·d-1) AH(溶于生理盐水) 给药组和对照组 (灌胃等体积生理盐水),每组6只。每天于同一时间点灌胃给药 (灌胃体积小于2.0 mL),连续给药7天。末次给药后1 h,处死大鼠并取肝组织,迅速用4 ℃生理盐水冲洗、擦干后,保存于液氮中备用。
定量PCR检测CYP2E1 mRNA的表达每只 大鼠取肝组织约100 mg,按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。用0.7% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,用分光光度法检测260和280 nm处吸收度值检测总RNA的纯度及浓度。取总RNA 2 μg按逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA。cDNA再经实时荧光定量PCR扩增检测mRNA的表达量。定量PCR的引物序列如下: 大鼠GAPDH (GenBank No.: NC_ 005103.4): Forward Primer AGGGCTGCCTTCTCTT GTGAC,Reverse Primer TGGGTAGAATCATACTG GAACATGTAG; 大鼠CYP2E1 (GenBank No.: XM_ 006230520.1): Forward Primer CCTACATGGATGCT GTGGTG,Reverse Primer CTGGAAACTCATGGCT GTCA。定量PCR实验条件为: 94 ℃变性15 s,58.4 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。基因表达水平的比较采用2-ΔΔCt法计算[10]。
Western blotting 检测 CYP2E1 蛋白表达量取适量肝组织在RIPA裂解液中冰浴匀浆,离心取上清液,用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白含量。取蛋白样品 (60 µg) 经SDS-PAGE (5% 的浓缩胶-10% 分离胶) 分离后转移到PVDF膜上。膜用5% 脱脂奶粉封闭1.5 h后,于4 ℃与一抗 (小鼠抗β-actin单克隆抗体,1∶1 000稀释; 兔抗大鼠CYP2E1抗体,1∶1 000稀释) 温孵过夜,TBST洗涤后再于37 ℃与二抗 (HRP-山羊抗小鼠IgG ,1∶5 000稀释; HRP-山羊抗兔IgG ,1∶5 000稀释) 温孵1.5 h,TBST洗涤后用超敏ECL化学发光试剂盒分析蛋白的表达量。
HPLC 测定 CYP2E1 活性采用CaCl2沉淀低速离心法分别制备每只大鼠的肝微粒体 (RLM),并用BCA法测定RLM中蛋白含量。以氯唑沙宗的6-羟基化作用表示RLM中CYP2E1的活性 (即ng·min-1·mg-1 protein)。RLM温孵反应体系及代谢物6-羟基氯唑沙宗含量测定方法参考文献 [8] 。
统计学方法采用t检验,以P < 0.05为具有统计学意义。
结果 1 槟榔碱对大鼠肝脏 CYP2E1 mRNA 表达的影响连续给大鼠灌胃低、中、高剂量氢溴酸槟榔碱 7天后,经实时荧光定量PCR检测大鼠肝脏CYP2E1 的mRNA表达量见图 2。结果表明,给药后CYP2E1 mRNA的表达量有一定上调,但与对照组相比无显著性差异 (P > 0.05),且无剂量依赖性。
连续给大鼠灌胃低、中、高剂量氢溴酸槟榔碱7天后,Western blotting检测大鼠肝脏CYP2E1的蛋白表达量见图 3。结果表明,槟榔碱对大鼠肝脏CYP2E1的蛋白表达量有明显上调作用 (P < 0.05),且具有剂量依赖性。
给大鼠连续灌胃低、中、高剂量氢溴酸槟榔碱7天后,对照组及低、中、高剂量给药组大鼠RLM中CYP2E1活性分别为 (16 ± 1.7)、(26 ± 2.6)、(19 ± 2.4) 和 (17 ± 1.7) ng·min-1·mg-1蛋白。与对照组相比,低剂量组有极显著性差异 (P < 0.01),中剂量组有显著性差异 (P < 0.05),高剂量组无显著性差异 (P > 0.05)。结果表明,低剂量槟榔碱对大鼠肝脏CYP2E1活性具有较显著诱导作用,且随着给药剂量的增大,诱导作用反而减弱。
讨论在众多负责外源化合物代谢活化的CYP450酶中,对肝脏CYP2El的诱导 (如四氯化碳、对乙酰氨基酚等) 因其能激活一些重要的肝毒素而显得特别重要。研究表明,肝脏中CYP2E1的mRNA与其蛋白和酶活间没有明显相关性,如其蛋白表达占CYP总量的7%,但mRNA超过CYP总量的50%[11]。 CYP2E1的mRNA分布有两种形式,约30%不参与翻译蛋白,约70% 可活化翻译蛋白[12]。已知CYP2E1的诱导因素包括异烟肼、乙醇、丙酮、苯、二甲亚砜以及饥饿和糖尿病[13],它们能封闭一个对CYP2E1蛋白降解很关键的磷酸化位点,从而提高CYP2E1的蛋白含 量[14, 15]。CYP2E1的磷酸化状态也影响其活性,一方面磷酸化调节CYP2E1的蛋白酶体降解途径,进而影响其活性; 另一方面,磷酸化也可以在不影响其蛋白表达水平的同时,降低其酶活性[16, 17, 18]。与其他大多 数CYP450酶不同,底物对CYP2E1的诱导一般不涉及转录激活[19],而主要是稳定其蛋白或提高翻译效率[20, 21]。本文研究表明,槟榔碱对大鼠肝脏CYP2E1 mRNA的表达无明显影响,但对大鼠肝脏CYP2E1的蛋白含量及活性却有较显著的诱导作用,说明槟榔碱体内对大鼠肝脏CYP2E1的调控不在其mRNA的转录阶段,而主要是通过增加其基因的翻译效率或蛋白的稳定性,这与文献[20, 21]报道的结果基本一致。本研究还发现槟榔碱对CYP2E1蛋白含量及活性的诱导作用存在相反的剂量关系,即蛋白含量随槟榔碱的给药剂量增加而增加,而活性虽被诱导,但却随着给药剂量的增加而减弱,提示槟榔碱对CYP2E1的调控可能还存在翻译后修饰。
此外,研究表明外源化合物对大鼠、小鼠和人肝脏CYP2E1表达与活性的调控机制基本一致[22]。本文研究表明,低剂量 (4 mg·kg-1·d-1) 氢溴酸槟榔碱是大鼠肝脏CYP2E1活性的诱导剂,提示槟榔咀嚼嗜好者在接受CYP2E1底物药物治疗时,存在一定的代谢相互作用风险。
[1] | Guh JY, Chuang LY, Chen HC. Betel-quid use is associated with the risk of the metabolic syndrome in adults [J]. Am J Clin Nutr, 2006, 83: 1313-1320. |
[2] | Wu PF, Chiang TA, Chen MT, et al. A characterization of the antioxidant enzyme activity and reproductive toxicity in male rats following sub-chronic exposure to areca nut extracts [J]. J Hazard Mater, 2010, 178: 541-546. |
[3] | Chou WW, Guh JY, Tsai JF, et al. Arecoline-induced growth arrest and p21 (WAF1) expression are dependent on p53 in rat hepatocytes [J]. Toxicology, 2008, 243: 1-10. |
[4] | Kevekordes S, Spielberger J, Burghaus CM, et al. Micronucleus formation in human lymphocytes and in the metabolically competent human hepatoma cell line Hep-G2: results with 15 naturally occurring substances [J]. Anticancer Res, 2001, 21: 461-469. |
[5] | Dasgupta R, Saha I, Pal S, et al. Immunosuppression, hepatotoxicity and depression of antioxidant status by arecoline in albino mice [J]. Toxicology, 2006, 227: 94-104. |
[6] | Chang MC, Ho YS, Lee PH, et al. Areca nut extract and arecoline induced the cell cycle arrest but not apoptosis of cultured oral KB epithelial cells: association of glutathione, reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential [J]. Carcinogenesis, 2001, 22: 1527-1535. |
[7] | Miyazaki M, Sugawara E, Yoshimura T, et al. Mutagenic activation of betel quid-specific N-nitrosamines catalyzed by human cytochrome P450 coexpressed with NADPH-cytochrome P450 reductase in Salmonella typhimurium YG7108 [J]. Mutat Res, 2005, 581: 165-171. |
[8] | Liu LG, Yan H, Yao P, et al. CYP2E1-dependent hepatotoxicity and oxidative damage after ethanol administration in human primary hepatocytes [J]. World J Gastroenterol, 2005, 11: 4530-4535. |
[9] | Xiao RM, Wang JJ, Chen JY, et al. Effects of arecoline on hepatic cytochrome P450 activity and oxidative stress [J]. J Toxicol Sci, 2014, 39: 609-614. |
[10] | Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method [J]. Methods, 2001, 25: 402-408. |
[11] | Patrick RP, Kathleen MM, Emily ES. Structures of human cytochrome P-450 2E1: insights into the binding of inhibitors and both small molecular weight and fatty acid substrates [J]. J Biol Chem, 2008, 283: 33698-33707. |
[12] | Thomas AK, Richard CZ, Raymond FN. Post-transcriptional regulation of rat CYP2E1 expression: role of CYP2E1 mRNA untranslated regions in control of translational efficiency and message stability [J]. Arch Biochem Biophys, 2000, 376: 180-190. |
[13] | Zong HH, Armoni M, Harel C, et al. Cytochrome P-450 CYP2E1 knockout mice are protected against high-fat diet- induced obesity and insulin resistance [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012, 302: E532-E539. |
[14] | Eliasson E, Johansson I, Ingelman-Sundberg M. Substrate-, hormone and cAMP-regulated cytochrome P450 degradation [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990, 87: 3225-3229. |
[15] | Guengerich FP. Reactions and significance of cytochrome P450 enzymes [J]. J Biol Chem, 1991, 266: 10019-10022. |
[16] | Barbara OB, Palghat RP, Roger B, et al. Differential modulation of CYP2E1 activity by cAMP-dependent protein kinase upon Ser129 replacement [J]. Exp Cell Res, 1998, 242: 294-302. |
[17] | Johansson I, Eliasson E, Ingelman-Sundberg M. Hormone controlled phosphorylation and degradation of CYP2B1 and CYP2E1 in isolated rat hepatocytes [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 174: 37-42. |
[18] | Li YH, Bi HC, Huang M. Effects of posttranslational modification on the activity of cytochrome P450: current progress [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 487-492. |
[19] | Yin H, Ingelman-Sundberg M, Lindros KO. Induction mechanisms of cytochrome P450 2E1 in liver: interplay between ethanol treatment and starvation [J]. Biochem Pharmacol, 1995, 50: 155-161. |
[20] | Klaassen CD. Cassarett and Doull's Toxicology [M]. 6th ed. New York: McGraw-Hill Professional Publishing, 2006: 133- 224. |
[21] | Poloyac SM, Tortorici MA, Przychodzin DI, et al. The effect of isoniazid on CYP2E1- and CYP4A-mediated hydroxylation of arachidonic acid in the rat liver and kidney [J]. Drug Metab Dispos, 2004, 32: 727-733. |
[22] | Gonzalez FJ. Cytochrome P450 in humans [M] // Schenkman JB, Greim H. Handbook of Experimental Pharmacology: Vol 105. New York: Springer-Verlag, 1993: 239-257. |