汤剂具有起效快、易吸收和作用强的特点,至今仍是中药临床最常用的用药形式之一。近年来,随着中药代煎的普及和应用,中药汤剂保存的稳定性问题已成为重要的研究课题。其中水质的因素对中药汤剂临床疗效和安全性可能会产生重大影响,如《本草纲目》就曾记载过不同类型的水 (露水、雨水、井泉水等) 对疗效的影响。然而,我国2009年颁布的《医疗机构中药煎药室管理规范》却并未对汤剂煎制的水质做出明确规定。目前汤剂在药房代煎或家庭煎煮时主要还是采用自来水。由于自来水中含有多种金属离子,而金属离子极有可能与药物中具有供电子基团的成分发生直接反应或催化反应。水质尤其是水中的金属离子是否会影响中药成分的稳定性以及中药汤剂和液体制剂的用水是否要控制金属离子等问题,鲜见报道。

多酚是一大类在中草药中广泛存在的重要活性成分。多酚类物质易被氧化、稳定性较差,易受金属离子、pH值和光线等影响而发生结构改变,引起理化性质、药理活性以及毒性的改变。因此水中的金属离子很可能会对含多酚类中药煎液的稳定性产生较大影响。何首乌含有的主要水溶性成分二苯乙烯苷 (2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside,THSG) 被认为是重要的活性成分,具有抗氧化、清除自由基、抗动脉粥样硬化和降血脂等药理作用^[1]。THSG结构稳定性较差,目前已有关于pH值、光线和温度

等影响THSG稳定性的报道^[2],但尚未见有金属离子对THSG稳定性影响的文献报道。为此,本文以何首乌中THSG为例,对比研究自来水、去离子水以及不同种类、浓度金属离子水对何首乌中THSG稳定性的影响,为临床汤剂以及液体制剂的用水提供参考依据。

THSG对照品 (成都普菲德生物技术有限公司,批号141101,纯度≥98%)、自来水 (北京市自来水公司)、自制去离子水 (18.2 MΩ)、乙腈 (Sigma-Aldrich ,美国); 无水氯化钙 (批号20130510)、六水合氯化镁 (批号130211)、硫酸锌 (批号20130421)、无 水硫酸铜 (批号F20080506)、结晶氯化铝 (批号20130520)、氯化铁 (批号20130705)、氯化亚铁 (批号20130321) 均为分析纯。

1290 infinity UHPLC超高效液相色谱仪、iFunnel 6550 Q-TOF LC/MS四级杆串联飞行时间质谱、MassHunter Qualitative Analysis B.06.00定性分析软件 (Aglient Technologies,美国),Millipore Milli-Q超纯水系统 (Millipore Co.,美国),KQ-500DE型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司),AL204微量分析天平 (瑞士Mettler Toledo公司)。

精密称取适量THSG对照品,置于10 mL量瓶中,加适量乙腈超声溶解,放置至常温,乙腈定容至刻度,摇匀,配制得到400 μg·mL⁻¹ THSG对照品贮备液。

自来水取至实验室管网水,去离子水为实验前由超纯水机现制。设置高、中、低3个离子浓度分别为500、50和5 ppm,其中不同金属离子高浓度溶液配制方法 (以质量浓度计): 钙离子水样 (1.38 mg·mL⁻¹无水氯化钙溶液)、镁离子水样 (4.23 mg·mL⁻¹六水合氯化镁溶液)、锌离子水样 (1.24 mg·mL⁻¹硫酸锌溶液)、铜离子水样 (1.24 mg·mL⁻¹无水硫酸铜溶液)、铝离子水样 (2.46 mg·mL⁻¹结晶氯化铝溶液)、二价铁离子水样 (1.13 mg·mL⁻¹氯化亚铁溶液)、铁离子水样 (1.47 mg·mL⁻¹氯化铁溶液)。上述高浓度金属离子溶液分别稀释10、100倍即得所需中、低浓度金属离子溶液。

临实验前,以上述实验水样为溶剂,精密称取适量的THSG溶解,超声1 min后,得到0.25 mg·mL⁻¹的THSG溶液,备用。所有操作均在避光环境下进行。

不同浓度金属离子影响比较: 将配制好的各组样品于室温 (25 ℃) 下避光密闭保存,分别于第0天和第10天,取适量溶液过0.22 μm微孔滤膜,按照下述色谱条件进行测定,记录各组中THSG含量的变化。

不同时间影响因素比较: 将配制好的高浓度组离子各组样品于室温 (25 ℃) 下避光密闭保存,分别于第0、3、5、7和10天,取适量溶液过0.22 μm微孔滤膜,按照下述色谱条件进行测定,记录各组中THSG含量的变化。

液相条件: 色谱柱为Zorbax RRHD 300SB-C₁₈ (100 mm × 2.1 mm,1.8 μm) ; 等度洗脱流动相为水−乙腈 (7∶3); 检测波长: 320 nm; 柱温: 30 ℃; 体积流量: 0.2 mL·min⁻¹; 进样量: 3 μL; 分析时间: 15 min。

质谱条件: 电喷雾离子化负离子模式; 扫描范围m/z 100～1 700; 毛细管电压3.5 kV; 干燥器温度: 200 ℃; 干燥气流速: 14 L·min⁻¹; 雾化气压: 35 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 鞘气温度: 350 ℃; 鞘气流速: 11 L·min⁻¹; 喷嘴电压: 1 kV; 毛细管出口电压: 175 V。

标准曲线的建立     精密吸取对照品贮备溶液,采用逐级稀释的方法得到质量浓度分别为6.25、12.5、25、50、100和200 μg·mL⁻¹的对照品系列溶液。按上述色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标(Y),THSG质量浓度为横坐标 (X) 绘制标准曲线。结果显示,在6.25～400 μg·mL⁻¹的质量浓度内,线性关系良好,线性回归方程为: Y = 33.898 X + 0.799 2 (r = 0.999 9)。

精密度实验     精密吸取对照品溶液一份,连续进样5次,按上述色谱条件测定,记录THSG峰面积,结果显示THSG峰面积的RSD值为0.43%,表明仪器的精密度良好。

重复性实验     精密吸取去离子水配制的供试品一份,连续进样5次,按上述色谱条件测定,计算THSG含量,结果显示THSG含量的RSD值为0.62%,表明所建方法的重复性良好。

实验数据以x±s表示; 不同实验水样的动态变化曲线采用GraphPad Prism 6软件进行拟合; 聚类分析采用SPSS 22软件进行处理。

第10天时,去离子水中的THSG含量和初始值相比仅降低7%,自来水中THSG完全消失; 不同种类金属离子溶液均可使THSG含量下降,且下降程度与离子浓度呈浓度依赖关系。在高浓度组金属离子中,Fe³⁺影响最大,2 h (第0天) 后THSG已检测不到,而在Fe²⁺水样中也已降低98%; 中浓度组中两种铁离子影响强度均大于其他离子,铝离子影响程度最小; 低浓度不同离子溶液中THSG含量也均有不同程度降低,离子影响强弱为: Fe³⁺ > Fe²⁺ ≈ Cu²⁺ > Ca²⁺ > Mg²⁺ > Zn²⁺ > Al³⁺ (图 1)。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Residual ratio of 2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O- β-D-glucoside (THSG) in different water samples after ten days. DW: Deionized water; TW: Tap water

为了更全面地反映不同实验用水的作用特点,将高浓度组实验结果通过线性回归、二次多项式非线性回归和“S”曲线拟合方程,建立回归模型,每种实验水样分别得到3个回归方程,结果见表 1。以模型的相关系数r值判定拟合度,将拟合度最高的作为最优数学模型。将每组实验水样得到的最佳拟合方程 作图 (图 2),根据上述最佳拟合方程,分别计算拟合方程参数t₉₅、t₈₀、t₅₀、t₂₀、t₅ (THSG含量分别降低到95%、80%、50%、20%、5%所用天数),结果见表 2。

表1(Table 1)

Table 1 Fitting equations of content changes of THSG in different water samples Sample Equation r Sample Equation r DW Y = -0.007 X + 0.998 0.981 5 Zn 2+ Y = -0.0386 X + 0.649 0.984 7 Y = (8.536×10 -6) X 2 + (-0.100 X) + 0.850 0.962 5 Y = 0.002 X 2 + (-0.058 X) + 0.676 0.996 1 Y = 0.009 + 1.669/(1 + 10 (-0.007(1.358×1022-X))) 0.962 5 Y = 0.093 + 214/(1 + 10 (0.047(54.2+ X))) 0.996 9 TW Y = -0.085 X + 0.628 0.735 4 Cu 2+ Y = -0.067 X + 0.713 0.896 3 Y = 0.919 X 2 + (-0.303 X) + 0.919 0.952 2 Y = 0.009 X 2 + (-0.160 X) + 0.837 0.982 1 Y = 0.001 + 1.063/(1+10 ( -1.770(0.773- X ))) 0.999 9 Y = 0.146 + 1845/(1 + 10 (0.159(21.49+ X))) 0.997 5 Ca 2+ Y = -0.055 6 X + 0.784 0.965 3 Al 3+ Y = -0.047 X + 0.936 0.980 4 Y = 0.004 X 2 + (-0.100 X) + 0.849 0.997 0 Y = 0.003 X 2 + (-0.072 X) + 0.970 0.994 4 - - Y = 0.297 + 350/(1 + 10 (0.051(52.7+ X))) 0.995 5 Mg 2+ Y = -0.056 X + 0.888 0.948 7 Fe 2+ Y = -0.114 X + 1.140 0.884 2 Y = 0.005 X 2 + (-0.112 X) + 0.961 0.993 5 Y = -0.006 X 2 + (-0.051 X) + 1.05 0.898 3 Y = 0.063 + 1 167.681/(1 + 10 (0.096(34.03+ X))) 0.997 5 Y = 0.017 + 0.939/(1 + 10 (1.22(5.81+ X))) 0.998 4

Table 1 Fitting equations of content changes of THSG in different water samples

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Fitting curves of content changes of THSG in different water samples

表2(Table 2)

Table 2 Parameters of fitting equations Sample t 95 t 80 t 50 t 20 t 5 DW 6.91 28.2 71.1 114 135 TW 0.120 0.359 0.635 0.905 1.58 Ca 2+ 0.500 0.972 4.19 >10.0 >10.0 Mg 2+ 0.0221 1.25 5.69 >10.0 >10.0 Zn 2+ <0.083 3 <0.083 3 3.65 >10.0 >10.0 Cu 2+ <0.083 3 0.212 1.88 7.02 >10.0 Al 3+ 0.761 2.98 10.7 >10.0 >10.0 Fe 2+ 4.00 5.23 5.79 6.31 6.99 Fe 3+ <0.083 3 <0.083 3 <0.083 3 <0.083 3 <0.083 3

Table 2 Parameters of fitting equations

将实验水样和拟合方程参数组成8×5的矩阵,采用Ward’s方法,以平方欧式距离为度量值对其进行聚类分析,聚类结果见图 3。从树状图中可以发现实验水样被分成了4类,说明上述实验水样对THSG含量变化的影响可以分为4类: Ⅰ类由自来水、二价铁离子水和三价铁离子水组成; Ⅱ类由锌离子水和铜离子水组成; Ⅲ类由钙离子水、镁离子水和铝离子水组成; Ⅳ类中只有去离子水。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Dendrogram of the water samples by cluster analysis

自来水中THSG的质谱数据可见m/z 121.031 7 (图 4A,化合物1) 和315.073 4 (图 4B,化合物2) 两个化合物,通过数据库的匹配,确定化合物1为C₇H₆O₂。由参考文献^[3]推断化合物1可能为THSG的降解产物对羟基苯甲醛,化合物2可能为其对应的分解产物2,3,5-三羟基苯甲醛-2-O-葡萄糖苷 (图 5)。其余各组水样中也均发现了上述化合物,但含量均低于自来水。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Extract ion chromatograms and mass spectra of compound 1 and compound 2

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Proposed mechanism of degradation of THSG in TW

文献^[4]报道二苯乙烯苷类物质能够与三价铁离子等无机单电子氧化剂发生氧化偶联反应,生成二聚体或多聚体。而在三价铁离子溶液的质谱数据中发现m/z 827.248 7的 [M−H]⁻ 和863.226 7 [M+Cl]⁻ 的准分子离子 (图 6B),THSG相对分子质量为406.126 3,故推测此化合物 (化合物3) 可能是由一分子THSG和另一加成水分子后的THSG聚合生成的二聚体。由提取离子流色谱图可见峰形未能良好分离 (图 6A),提示该二聚物可能存在同分异构体,推测可能的聚合机制见图 7。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Extract ion chromatogram (A) and mass spectrum (B) of unknown compound in ferric ion solution

Figure 7

Figure 7

Figure 7 One of possible mechanisms of dimer generation of THSG

本实验结果提示含何首乌的汤剂或液体制剂煎制时应采用去离子水,从而避免在保存过程中出现主要成分的降解。THSG属于多酚类,且含有不饱和双键,与其类似的结构有阿魏酸、咖啡酸类和绿原酸等羟基肉桂酸类,这些化合物广泛存在于虎杖、川芎、金银花、菊花、茵陈和蒲公英等中草药及百余种中成药中。文献^[5]报道阿魏酸和咖啡酸等能在金属离子催化下发生氧化聚合反应。一些中草药中广泛存在的黄酮类成分也存在金属离子催化反应^[6]。近年来,有关何首乌引发肝损伤的不良反应已引起全社会的高度关注,本课题组前期也对此开展了系列研究^[7−9],含绿原酸类成分的中药注射剂类过敏反应多有报道^[10],金属离子是否参与了这些成分的变化值得深入研究。

比较自来水中常见金属离子对THSG稳定性影响发现,不同种类金属离子溶液均可使THSG含量下降,且下降程度与离子浓度呈浓度依赖关系。不同浓度下铁离子对THSG的影响均最为显著,尤其是在高浓度Fe³⁺的条件下,THSG在2 h内就已检测不到,Fe²⁺离子溶液中亦出现显著降低。根据不同金属离子对THSG稳定性影响的差异可以看出,Fe³⁺和Fe²⁺应是含何首乌汤剂和液体制剂煎制用水时严格控制的金属离子。本文考察不同金属离子对THSG的影响规律,为明确液体制剂用水中金属离子限度,还应考察其长期稳定性,此工作将后续开展。

实验结果也显示,在Fe³⁺ 和Fe²⁺ 条件下检测到的不稳定反应产物与自来水条件下检测到的并不完全相同。在自来水条件下检测到的主要降解产物的可能结构是对羟基苯甲醛和2,3,5-三羟基苯甲醛-2-O-葡萄糖苷; 而在Fe³⁺ 和Fe²⁺ 条件下还发现降解产物的 可能结构为THSG加水二聚物,且该化合物在Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和Al³⁺条件下均未检测到,提示Fe³⁺和Fe²⁺可能主要参与催化了THSG的氧化聚合反应,而Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和Al³⁺可能则主要参与催化了THSG的双键氧化分解反应。不同金属离子催化THSG反应的准确机制尚需深入研究阐明。

总体来看,铁离子对THSG的影响强度最大,自古以来,何首乌就有“忌铁”“忌血(富含铁)”的记载。根据本文发现的两种铁离子对THSG稳定性显著影响的结果,在一定程度上也解释了古人强调何首乌须“忌铁”的可能原因。然而,古人在本草典籍中并未说明何首乌“忌铁”是由于降低了疗效,还是增加了毒性。从本文研究结果来看,何首乌的可能降解产物之一对羟基苯甲醛有一定的黏膜刺激性,小鼠口服给药有急性毒性 (LD₅₀ = 1.23 g·kg⁻¹)^[11],另外一个降解产物2,3,5-三羟基苯甲醛-2-O-葡萄糖苷和加水二聚物尚缺少安全性的数据。何首乌中THSG不稳定产物与疗效和肝损伤的关系亟待深入研究阐明,从而为针对性地建立何首乌及其制剂的质量评控方法和指标提供参考。目前我国尚无去离子水方面的标准,缺少单一金属离子控制,不同金属离子在水中的控制限度尚需要深入系统的研究,进而可有针对性地建立保障临床疗效和安全性的规范和标准。