1 靶标及其功能

流感病毒是由核壳和被膜蛋白组成,核壳中含有单链RNA和RNA聚合酶,被膜蛋白来自宿主细 胞,含有两个糖蛋白: 神经氨酸苷酶 (NA) 和血凝素 (HA),NA和HA在病毒颗粒成熟和传染过程中起关键作用。

病毒侵染宿主后其表面的血凝素与宿主上皮细胞表面的血凝素受体结合,核壳进入细胞,其RNA利用宿主细胞的资源进行复制和表达,最终重新组装成新的流感病毒颗粒,以出芽的形式突出于宿主细胞。成熟的流感病毒与宿主细胞之间,仍然依靠血凝素分子末端的唾液酸残基与血凝素受体分子表面的糖基团以糖苷键连接。为使病毒颗粒脱离宿主细 胞,借助神经氨酸苷酶催化水解糖苷键,使病毒脱离宿主细胞,再去感染新的细胞,造成流感病毒在患者体内的扩散。抑制神经氨酸苷酶的活性可阻断病毒 的成熟和传染,因而是治疗流感的一个靶标。

2 神经氨酸苷酶的催化机制

神经氨酸苷酶与唾液酸晶体结构的X-射线分析表明,活性部位处于酶深部的结合腔内,由18个氨基酸残基构成保守的催化中心。唾液酸底物的4位羟基进入一个结合腔与Glu119形成氢键,5位侧链的乙酰氨基结合于另一个含有Trp178和Ile222的疏水腔内,疏水腔还与11位的甲基发生疏水相互作用,同时也与6位甘油侧链的疏水骨架结合,侧链的羟基与组成另一结合腔的Glu276和Glu277形成氢键。结合示意图如图 1所示。

1位羧基接近于Arg371,羧基的负电荷与精氨酸的正电荷形成离子键结合,使得唾液酸的六元环骨架由稳定的椅式变为假船式构象,使原来处于直立键的羧基变为平展键,而2位的羟基由平展键转变 为直立键,与临近的Asp151形成氢键。基于这些结合特征,推论神经氨酸苷酶的催化水解历程如图 2所示。底物进入酶的活性部位 (a),1位的羧基负离子与Arg371正离子强力结合,引起椅式构象的糖环发生变

构,成为假船式构象,羧基成为平展键,2位糖苷键呈直立键 (b),活性部位的水分子被Asp151和Arg152活化,环中氧原子孤电子对离域,氧鎓离子被Glu277稳定,糖环形成内环型阳离子过渡态 (c),进而发生苷键的断裂和2位羟基键的生成 (d),释放出的唾液酸分子的羧基处于直立键位置,为α异头物 (e),进而异构化成稳定的β异头物 (f)。

3 过渡态类似物的设计 3.1 从唾液酸结构开始

早在1974年就已报道N-乙酰神经氨酸(1,N- acetylneuraminic acid,NANA,又称唾液酸sialic acid) 对流感神经氨酸苷酶 (NA) 具有弱抑制作用,K_i = 1 mmol·L⁻¹。澳大利亚学者Colman等根据上述的晶体学信息,用理性分子设计的方法,设计了神经氨酸苷酶底物的过渡态类似物。他们从化合物1出发,经GRID程序的计算化学方法设计了2-去氧-2,3-二去 氢-N-乙酰神经氨酸 (2,DANA),为NANA的脱水物,分子中C₂-C₃形成双键,羧基处于假船式构象的平展键位置 (连接于sp²杂化碳上)。化合物2虽然失去了C₂羟基与酶形成氢键的能力,但糖环固定于过渡态的构象,无需能量支付环的椅式构象的变构,因而在与酶活性部位结合的能量上更为有利。经合成并测定2对NA的抑制活性,K_i = 4.0 μmol·L⁻¹,IC₅₀ = 5～10μmol·L⁻¹,比神经氨酸的结合能力强1 000倍。然而DANA对流感病毒神经氨酸苷酶抑制的选择性很差,例如也抑制细菌和哺乳底物的NA,对病毒感染的动物模型的防治作用也差。

3.2 基于晶体结构和计算化学的分子设计

为了进行基于活性部位的结合特征设计酶抑制剂,用GRID分子模拟软件搜寻并评价酶活性部位的结合域,为此,围绕模型分子唾液酸所处的活性部位设定一系列网格点,在每个网格点上计算不同的探针 (基团) 与酶的结合部位的相互作用能,探针包括羧基、铵离子、羟基和甲基等,图 3所示的4个区域为氨基酸残基与探针的相互作用区域 (用阿拉伯数字标出)。

结果表明,羧基探针在区域4的3个精氨酸残基Arg118、Arg292和Arg371 (尤其是Arg371) 的作用能为 −9 kcal·mol⁻¹,这个位置相当于唾液酸的羧基所处的位置。铵离子探针在1、2、3三个区域与多个氨基酸残基显示有结合作用,提示在4位羟基附近的1区结合能为 −16 kcal·mol⁻¹; 在糖环C₄下面的2区结合能为 −18 kcal·mol⁻¹,在6位的甘油侧链和5位N-乙酰基之间的3区结合能为 −18 kcal·mol⁻¹。羟基探针主要在4区相当于唾液酸的羧基所处的位置,结 合能为−8 kcal·mol⁻¹,主要与Arg371结合,因而羟 基与羧基探针的结论基本相同,所以羟基没有提供新的结合模式。甲基探针搜寻与酶的疏水作用,呈现 −4 kcal·mol⁻¹的结合能,是与Trp178结合的贡献,相当于与5位N-乙酰基的甲基结合的位置 (未在图 3中标出)。(von Itzstein M,Wu WY,Kok GB,et al. Nature,1993,363: 418−423; von Itzstein M,Dyason JC,Oliver SW,et al. J Med Chem,1996,39: 388− 391)。

这些探针虽然都是多原子的基团,但除甲基外都是以单个原子 (O或N) 计算与氨基酸残基的相互作用能。进一步用多原子探针如羧基的两个氧原子 (−1电荷,含4个氢键接受位点) 和含有两个NH₂的脒基 (+1电荷,含4个氢键给体),计算结果表明,结合位点与单原子的相同,但结合能加大。

3.3 4-氨基-DANA的设计合成

根据GRID程序计算结果,推论分子中引入氨基能够提高与酶的结合力,从而将4位的羟基用氨基 置换,合成了4-氨基-DANA (3),实验表明其抑制活性显著提高,K_i = 40 nmol·L⁻¹,比4位羟基化合物(2) 强100倍,而且对于细菌和哺乳动物的神经氨酸苷酶的抑制作用很弱,提示4位氨基的取代具有选择性抑制病毒酶的作用 (Holzer CT,von Itzstein M,Jin B,et al. Glycoconjugate J,1993,10: 40−44)。化合物3与酶的晶体结构表明,氨基质子化成正电荷,与神经氨酸苷酶Glu119和Asp151的负电荷发生静电和氢键结 合作用,在氨基的结合腔内还结合了两个水分子。证实了分子模拟所预见的正确性。

3.4 优化活性−4-胍基-DANA的设计−扎那米韦的合成

GRID计算还提示脒基探针提供更多的氢键与C₄附近的氨基酸残基结合,结合能强于氨基,而且活性部位在该处也有较大的空间,可容纳大体积的碱性基团。因而在C₄上连接胍基,生成4-胍基-DANA (4),活性K_i = 0.03 nmol·L⁻¹,比4-氨基-DANA的活性强1 000倍。X-射线衍射分析4与酶的晶体结构表明,胍基的引入除与Glu119和Asp151形成氢键外, 还同Glu227和Trp178形成氢键结合,结合的焓贡献显著增加,而且还由于胍基占据的空间较大,排挤出存在于腔内的水分子,因而熵变也是有利的。生化实验数据表明4与神经氨酸酶发生的是慢结合反应,也反映了胍基结合的特点 (Pegg MS,von Itzstein M. Biochem Mol Biol Int,1994,32,851−858)。化合物4抑制A和B型流感病毒的神经氨酸苷酶,活性强,选择性高,研发公司Biota于1990年将专利权转让给葛兰素公司,定名为扎那米韦 (zanamivir) 进行开发。扎那米韦分子极性较强,水溶解度为18 mg·mL⁻¹,口服生物利用度2%,血浆蛋白结合率10%,临床上治疗和预防流感的传染。由于吸收性能低,患者使用吸入粉雾剂,经呼吸道吸收起效。扎那米韦于1999年FDA批准上市 (Hayden FG,Osterhaus JJ,Treanor DM,et al. New Engl J Med,1997,337: 874−880)。

4 后续的米韦类药物 4.1 可口服的奥赛米韦 4.1.1 环己烯酸为母核模拟过渡态结构—双键位置很重要

Gilead公司研发流感神经氨酸酶抑制剂,也是从水解唾液酸糖苷反应的过渡态结构入手,以环己烯酸为母核模拟糖环的过渡态结构。研发的目标是口服可吸收的抗流感药,为了提高化合物的过膜吸收性,降低分子的极性,须增加亲脂性。

扎那米韦母核为二氢吡喃,双键不可能在碳氧键间形成稳定的化合物,所以母核中双键的位置不可能与糖环的过渡态相对应。然而环己烯酸为母核时,双键的位置可有两种选择,如图 4中的化合物5和6,5的双键位置相似于糖环的过渡态结构,6的双键与扎那米韦相当,因而类似于电子等排体。当5中R为H时,对NA的抑制活性IC₅₀ = 6.3 μmol·L⁻¹,而6 (R=H) 在浓度为200 μmol·L⁻¹未显示活性,说明双键的位置显著影响活性。

4.1.2 提高C₃侧链的亲脂性

C₃引出的甘油片段是手性侧链,侧链的一边是羟基,晶体结构显示羟基未与重要的氨基酸残基结合,而链上的氢原子和骨架碳则与活性中心底部的疏水腔发生疏水−疏水相互作用,有利于结合。因而去除极性的羟基、变换为烃基不仅有利于与酶结合,还提高了化合物的过膜吸收性。通过用不同的烷基 (甲基～庚基及异构体)、环烷基、含氧或双键的烷基,考察对活性影响,结果表明3-戊基的活性最强,后来的晶体学研究证明该烷基片段与Ile222、Arg224、Ala246和Glu276残基碳链发生广泛的疏水−疏水相互作用,如图 5的晶体结构的局部示意图所示 (Williams MA,Lew W,Mendel DB,et al. Bioorg Med Chem Lett,1997,7: 1837−1842)。

4.1.3 C₄相连的乙酰胺基

变换C₄相连的乙酰胺 基为三氟乙酰胺基、丙酰胺基或甲磺酰胺基等片段,活性仍以乙酰氨基对神经氨酸苷酶或感染的细胞的抑制活性最强,晶体学分析显示,甲基与Ile222和Trp178发生疏水相互作用,酰基氧原子与Asp251和Arg152形成氢键网络。

4.1.4 C₅相连的氨基变换

C₅相连的氨基变换为胍基,对酶的抑制活性比相应的氨基化合物活性高,但C₃相连的烷基不同,影响活性差异比较大,范围是2～100倍,当烷基能够形成较大范围的疏水作用时,会影响胍基形成氢键网络的能力,导致氨基与胍基的活性差别较小。

4.1.5 C₂和C₄的取代基对活性的影响

唾液酸在相应于环己烯C₂和C₆的位置分别是氧原子和无取代的CH₂,环己烯C₂和C₆若分别被甲基取代,活性显著下降,表明这两个位置不宜加入取代基 (Choung UK,Lew W,Williams MA,et al. J Med Chem,1998,41: 2451−2460)。

4.1.6 候选化合物的确定和奥司他韦上市

在环己烯酸的4位确定为乙酰氨基、5位为氨基 (包括C₄和C₅的构型与唾液酸相同)、2位和6位不宜有取代 基的前提下,对3位的氧烷基进行了系统的优化,包括不同长度的烷基、直链或支链、环烷基、环链烷基、苯烷基等,表明化合物7的抑制酶和感染细胞的活性最强,对流感神经氨酸苷酶A和B的IC₅₀分别为 1 nmol·L⁻¹和3 nmol·L⁻¹,7与神经氨酸苷酶复合物的晶体结构提示,连接于C₁的羧基与Arg371、Arg118和Arg292形成氢键网络,与双键呈共轭平面的构型使得氢键距离在2.51～3.13Å。3位的戊基与Ile222、Arg224、Ala246和Glu276的烷基侧链形成疏水性结合。4位的乙酰氨基的甲基与Trp178和Ile222也发生疏水相互作用,酰基氧原子与Arg152形成氢键。5位氨基与Asp119和Glu151形成氢键结合。如图 6所示 (Kim CU,Lew W,Williams MA,et al. J Am Chem Soc,1997,119: 681−690)。

化合物7为游离酸,在体内呈负离子而不利于 过膜吸收。制成乙酯为化合物8,与磷酸形成酸式盐,命名为奥司他韦 (oseltamivir),转由罗氏公司研发,磷酸盐的相对分子质量为410.40,lopP = 1.16,溶解度为0.86 g·mL⁻¹。游离碱的极性表面积PAS = 90.65Ų,奥司他韦口服后迅速在消化道吸收,90% 以上被肝脏酯酶代谢成酸,F = 75% (水解成酸),原药血浆蛋白结合率42%,酸的蛋白结合率为3%,酸的半衰期6～10 h,大部分从尿中排出。经临床研究,口服每日一次,一次70 mg,可治疗A型和B型 流行性感冒,FDA于1999年批准在美国上市。

4.2 帕拉米韦的研制 4.2.1 以四氢呋喃为母核的先导化合物

在与扎那米韦和奥司他韦研发的同时,澳大利亚的Babu等也进行了以神经氨酸苷酶为靶标的药物研究,他们也是以具有弱抑制作用DANA (2) 与NA的晶体结合特征为依据,目标是具有新的结构骨架的口服抗流感药物。为了有别于二氢吡喃和环己烯系列的抑制剂,根据文献报道以四氢呋喃为母核的化合物9与NANA有相近的抑制活性 (IC₅₀ = 40 μmol·L⁻¹,Yamamoto T,Kumazawa H,Inami K,et al. Tetrahedron Lett, 1992,33: 5791−5794),确定研究以环戊烷为母核的抑制剂。通过制备和解析化合物9与NA的晶体结构,并与DANA复合物的结构比较,发现二者外围基团和侧链的配置和进入4个结合腔的方式相同,二者侧链能很好地叠合,只是五元环上基团的连接方式不同。

4.2.2 晶体X-射线衍射分析辅助设计

变换四氢呋喃环为环戊烷,合成了化合物10,目的是研究与NA结合中胍基的结合方式,结果发现晶体结构中的胍基与Asp151、Glu119和Glu227形成氢键网络,与扎那米韦的结合模式相同。由于10还缺少必要的药效团,所以活性很弱,IC₅₀ = 115 μmol·L⁻¹。化合物10与NA的晶体结构显示,空缺着由Ala246、Ile222和Arg224 (碳骨架) 构成的疏水腔,进而设计含有疏水链正丁基的化合物11以增强疏水−疏水相互作用,结果表明活性显著提高,IC₅₀ = 0.1 μmol·L⁻¹。化合物11含有4个手性碳: C₁、C₃、C_1' 和C₄,由于C₁和C₃是以怎样的构型配置使活性最强还未知,因而将C₃固定为S构型、C₄为R构型 (与化合物10的S-C₄相 反),C₁和C₃是消旋碳原子,合成的11是两对差向异构体混合物。为发现活性最强的异构体,采用了浸泡技术形成复合物的晶体方法筛选强活性的异构体。为此将NA晶体浸泡在4个异构体的混合物溶液中,一天后得到了活性最强化合物形成的复合物晶体。有趣的是,与A型与B型流感病毒的NA结合最强的是同一种异构体,但丁基的结合取向不同,是由于两株病毒NA酶的Glu276残基所处的疏水环境不同的缘故 (Babu YS,Chand P,Bantia S,et al. J Med Chem,2000,43: 3482−3486)。

4.2.3 帕拉米韦的设计与构型选择

根据化合物11晶体结构的特征,将丁基改为3-戊基,设计了化合物12以占据两个疏水腔,但起始合成的样品化合物C₁和C₂不是专一手性原子,因而得到的是4个异构体的混合物。用晶体浸泡技术“提取”结合最强 (因而活性应最高) 的分子,得到1S,2S,3S,4R异构体12与NA形成的复合物晶体。化合物12对A型病毒NA酶的抑制活性IC₅₀ = 0.1～1.4 nmol·L⁻¹,对B型IC₅₀ = 0.6～11 nmol·L⁻¹。晶体结构分析显示,羧基与NA活性位点的3个精氨酸残基Arg118、Arg292和Arg371形成强结合作用,乙酰氨基的甲基与疏水腔中的Trp178和Ile222作用,羰基氧与Arg152形成氢键; 胍基与Asp 151、Glu 119、Glu 227及Trp 227产生 静电和氢键结合作用; 3-戊基与B型病毒的Ala 246、Arg 224和Ile 222构成的疏水腔发生疏水作用。而在A型病毒,异戊基作用于Glu276疏水部分。化合物12经口灌胃0.1 mg·kg⁻¹给H6N2感染的小鼠,表现出显著治疗和缓解作用。后经临床研究,命名为帕拉米韦 (peramivir),于1999年经FDA批准上市。

5 结语

扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦3个抗流感药物在同一年被批准上市,在一定意义上说都是首创独立研发的。研发的共性都是以神经氨酸苷酶与唾液酸复合物的晶体结构为出发点,结合酶水解过程底物的过渡态结构特征,量体裁衣式的设计过渡态类似物,有共同的药效团特征。三者也分别具有鲜明的研发个性,扎那米韦采取了结构改变最小原则,仅将C₄羟基改为胍基,比DANA活性提高10万倍,但也由于保留了唾液酸的甘油基和追求高活性的胍基,使得分子极性过强而吸收性能差,因而只能用粉雾吸入的给药途径。奥司他韦将基于结构和反应机制的设计与药物化学和构效关系的方法相结合,设计成可以口服的前药,体现了应用药物化学的多种策略和方法成功地优化了活性和成药性。帕拉米韦作了大胆的骨架迁越,饱和的环戊烷母核没有糖环过渡态的结构特征,在安排药效团以优化活性的过程中,在结构生物学信息的指导下,完成了由活性化合物向成功药物的过渡。