超微粉碎技术是近20年发展起来的一项新技术,通过机械或流体动力的方法可将中药材细胞打碎,提高细胞内外有效成分的溶出率^{[1, 2]}。与传统粉碎技术比较,超微粉碎技术可使中药材细胞破壁率达95% 以上,超微饮片粒径可达到5～10 µm^{[2, 3, 4]}。中药超微饮片指采用超微粉碎技术将中药原药材粉碎成75 µm以下的超微粉,再采用现代制粒技术制成的颗粒型饮片^[2]。中药破壁饮片是指将植物类中药原药材破壁粉碎至D90 < 45 µm (300目以上) 的粉体,加水或不同浓度的乙醇黏合成型,制成30～100目的原饮片全成分的均匀干燥颗粒状饮片^[1]。中药破壁饮片属于中药超微饮片中的一类细胞破壁率较高的饮片,强调原药材细胞的破壁率。而75 µm以下的超微粉制成的饮片即可叫中药超微饮片,这些超微粉体不一定被破壁,即中药破壁饮片包含于中药超微饮片中,但是中药超微饮片不一定是破壁饮片。中药超微

饮片和破壁饮片因没有经过高温溶剂提取的工艺,能全成分保留,又因经过破壁处理,增加了细胞壁内包裹成分的溶出率,使其成分利用率大幅度增加。如三七、白芷、西洋参、川贝母、天麻等超微粉碎后,有效成分溶出率显著提高^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}。同一药材的不同组织、部位因细胞破碎后能高度混合均匀,实现了中药同批内产品物质基础的均一,解决了中药长期以来质量不均匀的问题,能大大缓解当前中药资源极度匮乏的现状。因为超微饮片和破壁饮片已完全失去了传统中药饮片的鉴别特征,形态、显微、理化等传统鉴别手段难以鉴别出破壁饮片及超微饮片的真伪,其鉴别与监管已成为制约超微饮片与破壁饮片产业的瓶颈问题之一。

近年来,中药鉴定技术发展迅速,为药材的基原物种鉴定奠定了良好的基础^[10]。DNA条形码 (DNA barcoding) 技术具有较强的通用性,作为物种鉴定的新手段,备受国内外研究者关注,迅速成为物种分类和鉴定的研究热点。该技术在传统形态分类学对物 种准确鉴定的基础上,通过对样品标准序列进行测序,建立DNA条形码数据库,可以实现物种鉴定的标准化^{[11, 12, 13, 14]}。中国学者首次提出将ITS2序列作为 药用植物标准DNA条形码,并建立了以ITS2为主,psbA-trnH为辅的药用植物类药材DNA条形码鉴定体系^[15]。该体系已在多种药用植物及其混伪品的鉴定中得到了广泛应用,表现出较强的鉴定能力^{[16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]}。《中国药典中药材DNA条形码标准序列》^[28]的出版,为中国药典收载的中药材品种提供了标准DNA条形码序列。本研究运用DNA条形码技术对全草类、根茎类、叶类、花类、果实类、种子类等不同部位入药的代表性药材,包括三七、人参、西洋参等31种药材的原药材、超微饮片、破壁饮片进行鉴定,研究DNA条形码技术对中药超微饮片和破壁饮片及其原药材的基原物种鉴定的适用性,以期为中药破壁饮片和超微饮片物种真实性进行快速准确的鉴定,为其生产过程、市场监管和临床用药安全提供科学依据和保障。

材料 本研究对29种药典收录的和2种非药典收录的 (红参和盐补骨脂) 药材及其破壁饮片和超微饮片共93份样品进行了实验 (样品详细信息见图 1、表 1)。实验样品包括全草类、根茎类、叶类、花类、果实类及种子类具有代表性的种类,样品由中山市中智药业集团有限公司等单位提供,现保存于中国中医科学院中药研究所。每个物种的原药材、超微饮片及破壁饮片均来自于同一批混合药材。另外,从《中国药典中药材DNA条形码标准序列》和中药材DNA条形码鉴定系统数据库中获得31种药材样品相似度最高的标准序列 (表 1)。

图 1

Figure 1

Figure 1 Thirty-one herbal medicine samples of ultrafine powder

表 1 (Table 1)

Table 1 Sample informations of the experimental materials Herb Latin name Medicinal part Sample number Genbank accession number Standard sequence Collecting locality Angelicae sinensis radix Angelica sinensis Radix PB002MT1−3 KT285068−70 KF725039 Gansu Astragali radix Astragalus membranaceus var. mongholicus Radix PB004MT1−3 KT285083−85 GU217643 Gansu Codonopsis radix Codonopsis pilosula Radix PB008MT1−3 KT285128−30 KF040346 Gansu Glehniae radix Glehnia littoralis Radix PB012MT1−3 KT285143−45 FJ593179 Liaoning Paeoniae radix alba Paeonia lactiflora Radix PB019MT1−3 KT285101−03 JN572150 Anhui Ginseng radix et rhizoma rubra Panax ginseng Radix PB020MT4−6 KT285104−06 KF727965 Jilin Ginseng radix et rhizoma Panax ginseng Radix PB020MT1−3 KT285155−57 JF421520 Jilin Notoginseng radix et rhizoma Panax notoginseng Radix PB021MT1−3 KT285074−06 PB021MT1 Yunnan Notoginseng radix et rhizoma praeparata Panax notoginseng Radix PB021MT4−6 KT285110−12 JQ764992 Yunnan Panacis quinquefolii radix Panax quinquefolius Radix PB022MT1−3 KT285077−79 JX996142 Jilin Platycodonis radix Platycodon grandiflorus Radix PB023MT1−3 KT285092−94 KC282682 Neimenggu Pseudostellariae radix Pseudostellaria heterophylla Radix PB024MT1−3 KT285131−33 EF197885 Guizhou Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma Salvia miltiorrhiza Radix and Rhizome PB030MT1−3 KT285065−67 JQ934137 Sichuan Rhodiolae crenulatae radix et rhizoma Rhodiola crenulata Radix and Rhizome PB028MT1−3 KT285134−36 EU239666 Xizang Citri sarcodactylis fructus Citrus medica var. sarcodactylis Fruit PB007MT1−3 KT285089−91 JN681157 Guangdong Salt-processed psoralea corylifolia Psoralea corylifolia Fruit PB025MT1−3 KT285149−51 GU217600 Shanxi Schisandrae chinensis fructus Schisandra chinensis Fruit PB031MT1−3 KT285119−21 AB558158 Heilongjiang Mori fructus Morus alba Fructus PB017MT1−3 KT285113−15 KF986154 Jiangsu Gossampini flos Gossampinus malabarica Flower PB013MT1−3 KT285158−60 DQ826447 Guangdong Sophorae flos Sophora japonica Flower and bud PB032MT1−3 KT285086−88 HQ229005 Beijing Lonicerae flos Lonicera macranthoides Bud PB016MT1−3 KT285161−63 KF160915 Hunan Cynomorii herba Cynomorium songaricum Stem PB010MT1−3 KT285116−18 KC463824 Neimenggu Houttuyniae herba Houttuynia cordata Whole plant PB014MT1−3 KT285167−69 EU329296 Hunan Abri herba Abrus cantoniensis Whole plant PB001MT1−3 KT285146−48 JF421457 Guangdong Lilii bulbus Lilium brownii Scale leaf PB015MT1−3 KT285098−100 KC020203 Hubei Epimedii folium Epimedium pubescens Leaf PB011MT1−3 KT285164−66 JN010299 Anhui Apocyni veneti folium Apocynum venetum Leaf PB003MT1−3 KT285140−42 DQ449485 Tianjin Nelumbinis folium Nelumbo nucifera Leaf PB018MT4−6 KT285152−54 AY858640 Hunan Coicis semen Coix lacryma-jobi var. mayuen Semen PB009MT1−3 KT285122−24 GQ434412 Hunan Cassiae semen Cassia obtusifolia Semen PB005MT1−3 KT285071−73 GU175319 Jilin Nelumbinis semen Nelumbo nucifera Semen PB018MT1−3 KT285107−09 DQ105982 Hebei

Table 1 Sample informations of the experimental materials

植物基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技 (北京) 有限公司。2×Taq PCR Master Mix试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。本研究所用引物合成及产物测序均由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

用75% 乙醇擦拭药材表面,药材、破壁饮片和超微饮片的取样量均为20～30 mg。药材用高通量组织研磨仪 (Sceitz,宁波新芝),在50 Hz频率下研磨120 s后,加入800 μL核分离液 (所含成分包括: 2% PVP、 20 mmol·L⁻¹ EDTA、100 mmol·L⁻¹ pH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol·L⁻¹ NaCl) 清洗一至多次至溶液无色,除去上清液,留沉淀,再采用植物基因组DNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech CO. China) 提取总DNA。详细操作步骤参见中药材DNA条形码分子鉴定指导原则及试剂盒说明书。

采用ITS2序列进行鉴定。ITS2片段扩增正向引物ITS2F: 5'-ATGCGATACTTG GTGTGAAT-3'; 反向引物ITS3R: 5'-GACGCTTCTC CAGACTACAAT-3'。PCR反应体系以25 μL为参照,反应体系为: PCR Buffer (10×) 2.5 μL、MgCl₂ 2 μL (25 mmol·L⁻¹)、dNTPs混合物2 μL (2.5 mmol·L⁻¹)、正向和反向引物各1.0 μL (2.5 μmol·L⁻¹)、模板DNA 1.0～3.0 μL、Taq DNA聚合酶1.0 U,最后加dd H₂O至25 μL。PCR扩增程序: 94 ℃变性5 min,再进行40个循环 (每个循环均为: 94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s),72 ℃延伸10 min^[12]。取PCR产物4 μL,以TBE (0.5×) 为电泳缓冲液进行凝胶电泳,PCR扩增成功后的产物经纯化后,使用 ABI 3730XL测序仪 (Applied Biosystems Co.,USA) 进行双向测序。

应用CodonCode Aligner V3.7.1 (CodonCode Co.,USA) 对获得的序列峰图进行质量分析,去除测序结果两端的低质量部分,并对剩余部分进行质量评估,满足质量要求方可用于序列拼接。获得高质量序列后,根据Hidden Markov Model (HMM) 模型,去除序列两端5.8S和28S基因区,获得完整的ITS2基因间隔区序列。在中药材DNA条形码鉴定系统 (http://www.tcmbarcode.cn) 和GenBank数据库中进 行BLAST比对。将获得的序列导入MEGA 6.0软件,基于K2P (Kimura 2-parameter) 模型对种内和种间遗传距离进行分析,并用邻接 (Neighbor Joining,NJ) 法构建系统聚类树,各分支的支持率使用bootstrap重复1 000次进行检验。

DNA提取是开展中药材DNA条形码研究的首要环节。药材中普遍含有大量的次生代谢产物,会影响DNA的提取,采用核分离液洗涤后,可去除细胞核中大部分的多糖、多酚,提高DNA纯度。本文中将93份样品用裂解液裂解后,均采用核分离液进行洗涤。全草类、叶类、花类DNA提取较容易,通常用核分离液清洗1～2次即可。根茎类、果实类、种子类根据药材不同,通常需要洗涤2～3次,甚至多次,至上清液无色后为止。再根据DNA提取试剂盒的操作步骤进行,均能成功提取DNA,提取成功率100%。其PCR产物经电泳后均能显示单一目的条带,扩增效率为100%,测序后能得到高质量的ITS2序列。

对31种中药的原药材、超微饮片及破壁饮片共93份样品的ITS2序列以及从《中国药典中药材DNA条形码标准序列》和中药材DNA条形码鉴定系统数据库中获得的此31种药材的ITS2标准序列进行变异位点分析。在这31种药材中,26种药材及其超微饮片和破壁饮片与基原植物的ITS2序列完全相同,5种药材 (鸡骨草、黄芪、熟三七、丹参、槐花) 的ITS2序列存在变异。鸡骨草药材、超微饮片、破壁饮片的ITS2序列完全相同,与标准序列JF421457在12位点有一个C/T变异,相似度99.5%; 黄芪药材的ITS2序列与标准序列GU217643相似度100%,与其超微饮片和破壁饮片在85位点有一个C/T变异,其超微饮片和破壁饮片的ITS2序列与标准序列KJ999353相似度100%; 熟三七超微饮片、破壁饮片及三七各样品的ITS2序列与标准序列JQ764992相似度100%,与熟

三七药材在160位点有一个C/T变异,其药材的ITS2序列与标准序列KP218725相似度100%; 丹参药材的ITS2序列与标准序列JQ934137相似度100%,与超微饮片和破壁饮片的ITS2序列在179位点有一个C/T变异,其超微饮片和破壁饮片的ITS2序列与标准序列JQ934136相似度100%; 槐花药材、超微饮片、破壁饮片的ITS2序列完全相同,与标准序列HQ229005相似度99.5%,在213位点缺失了一个C碱基。

在这31种药材 (28个物种) 中,当归、党参、白芍、三七、百合等26种药材的种内遗传距离为0,序列完全一致,无变异; 黄芪、熟三七、丹参、槐花、鸡骨草这5种药材的种内遗传距离不为0,但是各物种的种内最大遗传距离均小于其与其他物种的种间最小遗传距离 (表 2)。因此,采用遗传距离法能将本实验的28个物种区分开。

表 2 (Table 2)

Table 2 The ITS2 sequence characters and the K2P distances Species Sequence length/bp Mean GC content/% Intraspecific K2P distance (mean) Interspecific K2P distance (mean) Abrus cantoniensis 212 46.7 0−0.005 (0.002) 0.499−1.569 (0.967) Angelica sinensis 229 55.2 0 0.209−0.939 (0.666) Apocynum venetum 236 63.8 0 0.430−1.148 (0.689) Astragalus membranaceus var. mongholicus 216 50.6 0−0.005 (0.003) 0.423−1.357 (0.848) Cassia obtusifolia 233 60.9 0 0.667−1.051 (0.815) Citrus medica var. sarcodactylis 231 68.0 0 0.450−0.985 (0.677) Codonopsis pilosula 239 60.8 0 0.148−0.970 (0.646) Coix lacryma-jobi var. mayuen 221 71.0 0 0.667−1.485 (0.903) Cynomorium songaricum 229 48.0 0 0.779−1.400 (0.963) Epimedium pubescens 247 54.5 0 0.552−1.321 (0.768) Glehnia littoralis 227 57.7 0 0.209−0.981 (0.657) Gossampinus malabarica 237 70.2 0 0.427−1.001 (0.652) Houttuynia cordata 253 58.8 0 0.641−1.066 (0.826) Lilium brownii 237 65.1 0 0.596−1.569 (0.810) Lonicera macranthoides 228 69.6 0 0.292−1.029 (0.561) Morus alba 236 62.6 0 0.577−1.119 (0.791) Nelumbo nucifera 239 55.5 0 0.653−1.477 (0.842) Paeonia lactiflora 227 56.1 0 0.462−1.051 (0.687) Panax ginseng 230 62.8 0 0.009−0.931 (0.536) Panax notoginseng 230 62.5 0−0.004 (0.001) 0.027−0.887 (0.547) Panax quinquefolius 230 63.5 0 0.009−0.931 (0.516) Platycodon grandiflorus 261 64.2 0 0.256−1.032 (0.790) Pseudostellaria heterophylla 228 55.5 0 0.549−1.400 (0.838) Psoralea corylifolia 233 67.6 0 0.621−1.117 (0.834) Rhodiola crenulata 217 55.6 0 0.532−1.061 (0.764) Salvia miltiorrhiza 228 66.0 0−0.004 (0.003) 0.383−1.110 (0.613) Schisandra chinensis 231 59.1 0 0.680−1.373 (0.839) Sophora japonica 222 54.0 0−0.009 (0.005) 0.423−1.439 (0.808)

Table 2 The ITS2 sequence characters and the K2P distances

将获得的93条ITS2序列在中药材DNA条形 码鉴定系统和GenBank数据库中进行BLAST鉴定,28种样品均有与之比对率100% 的标准序列。鸡骨 草各样品的ITS2序列在中药材DNA条形码鉴定系统数据库中与标准序列JF421457相似度99.5%,在GenBank数据库中与标准序列JF421457相似度99%; 槐花各样品的ITS2序列在中药材DNA条形码鉴定系统数据库中与标准序列HQ229005相似度99.5%,在GenBank数据库中与标准序列HQ229005相似度99%。31种药材各样品的ITS2序列的BLAST比对结果中,所查的相似性最高的序列对应的物种均与实验样品为同一物种。

采用MEGA 6.0软件对实验获得的93条和从《中国药典中药材DNA条形码标准序列》以及中药材DNA条形码鉴定系统网站下载的31条相似度最高的标准序列共124条ITS2序列进行分析,基于K2P模型,以邻接(NJ) 法构建系统聚类树。由此聚类树可看出,两种药材对应同一基原的人参和红参、三七和熟三七、荷叶和莲子这3对药材各样品与各自标准序列聚为1支,另外的25种药材各样品的ITS2序列均与各自标准序列聚为1支,如图 2所示。

图 2

Figure 2

Figure 2 Phylogenetic tree constructed with ITS2 sequences using NJ tree method. Note: Bootstrap repeated 1 000 times,the numerical displayed only on bootstrapping support 50% or higher

中药超微饮片与破壁饮片因其特殊的加工制作方法,已完全失去了原药材的外观性状及显微鉴别特征,难以用传统鉴定方法对其真伪进行有效鉴定。本研究运用DNA条形码技术,对31种中药 (28个物种) 的超微饮片和破壁饮片及其原药材进行研究。31种代表性中药的入药部位包括全草、根茎、花、果实、种子等。经过优化DNA提取方法后,93份样品均能成功提取到DNA,而且采用遗传距离、BLAST及NJ树法均能成功鉴定。因炮制方法不同,药材炮制后DNA通常存在不同程度的降解,对降解严重的药材,难以采用物种分子鉴定; 而降解不严重的样品则可以采用DNA条形码鉴定。本实验中的红参、熟三七、盐补骨脂等炮制药材能成功提取DNA,实现样品的准确鉴定。

在这31种药材中,各样品与标准序列的ITS2序列完全相同的药材有26个,它们的种内遗传距离均为0。存在种内变异的药材有5种,占全部实验药材的16.1%。这5种存在种内变异的药材通过K2P遗传距离、BLAST及NJ树方法,均能准确鉴定。在这5种存在种内变异的药材中,黄芪、熟三七和丹参的各样品均有与之比对率 为100% 的标准序列,鸡骨草和槐花各样品的ITS2序列虽然与标准序列存在变异,但与标准序列的相似度均不小于99.5%,在物种变异范围内。各物种的种内最大遗传距离均小于该物种与其他物种的种间最小遗传距离,在遗传距离上可将各物种区分开。在进行BLAST比对中,所查的相似性最高的序列对应的物种均与实验样品为同一物种。在进行NJ树分析中,各序列都与各自标准序列聚为一支,各物种能很好地分开。

药材被制成超微饮片与破壁饮片的过程中,不同个体间相互混合,可能会影响测序质量。本文中31种药材均得到高质量的PCR产物,其中29种药材的各样品序列与各自的标准序列完全相同,26种药材各样品的序列完全相同,黄芪、熟三七和丹参这三种药材的各样品的ITS2序列不完全相同,但均有与之比对率为100% 的标准序列,各物种均实现了准确鉴定。鸡骨草各样品的ITS2序列完全相同,与标准序列JF421457相似度最高,为99.5%,在12位点有一个C/T变异; 槐花各样品的ITS2序列完全相同,与标准序列HQ229005相似度最高,为99%,与之不同为在213位点缺失了一个C碱基。

中药破壁饮片及超微饮片因细胞壁破碎后导致其形态、显微特征等缺失,但因其并没有经过高温溶剂提取的工艺,其DNA破坏程度较小。本文运用DNA条形码技术对全草类、根茎类、花类、果实类、种子类等不同部位入药的药材均能进行准确鉴定。因此,DNA条形码技术能够解决中药超微饮片、破壁饮片及其生产过程中的原料物种鉴定困难的瓶颈问题。因此,DNA条形码技术在中药超微饮片与破壁饮片产业的原料收购、加工及市场流通等方面能起到质量控制和监督的作用,保证中药超微饮片与破壁饮片的用药安全,使其发挥更大的经济效益和社会效益。