2. 总后卫生部药品仪器检验所, 北京 100166;
3. 中立安医药科技有限公司, 北京 101111
2. Institute for Drug and Instrument Control, Health Dept. GLD of PLA, Beijing 100166, China;
3. ZLA Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Beijing 101111, China
布洛芬属于有机酸类的解热镇痛抗炎药,是临床使用最普遍的非甾体抗炎药之一。目前市场上消旋布洛芬使用较多,但其中S-布洛芬是真正发挥药效作用的优对映体,而R-布洛芬几乎无药效作用[1, 2, 3]。1996年,S-布洛芬开始在奥地利广泛用于治疗类风湿性关节炎,目前临床主要应用的是口服制剂,但对口服困难的患者效果却不理想,而静脉注射剂可以很好地适用于这些患者中。2009年美国FDA批准布洛芬静脉注射液 (ibuprofen,Caldolor) 上市,是首个治疗疼痛和发热的布洛芬静脉注射新制剂[4]。
手性拆分是药物开发的一个热点,这也是定量测定手性药物的前提。已报道的文献中关于布洛芬 消旋体的测定较多,测定布洛芬对映体的方法有毛细管电泳法[5]、高效液相色谱法[1, 6]等,此外还有高灵敏度、高选择性的高效液相色谱-质谱[7, 8]、气相色谱-质谱[9]联用等方法,而高效液相色谱法最为常用。血浆样品前处理方法中,柱前衍生化法需时间较长且要严格控制处理过程以保证衍生化效率,手性柱高效液相色谱法更加快速、简便,能够满足高通量的要求。目前文献中手性色谱柱有OJ-H柱[1]、AGP柱[10, 11]、Chirobitic V柱[12]、AD-RH柱[13]等。Kromasil液相色谱手性分析柱具多个手性中心,交联键合的手性官能团使得色谱柱耐用且选择性强,通用性好,在所有有机溶剂中稳定,能够分析的手性化合物极为广泛,目前尚未有该手性柱分离测定血浆样品中布洛芬对映体的相关报道。
本文建立了反相手性HPLC法测定比格犬血浆中布洛芬对映体浓度,特异性好、灵敏度高、准确度好,可用于布洛芬对映体药代动力学研究。本研究阐述了比格犬分别静脉输注消旋布洛芬、S-布洛芬和R-布洛芬注射液(9 mg·kg-1) 后布洛芬各对映体的药代动力学行为特性,探讨了R-布洛芬在比格犬体内的转化特征,通过比较比格犬分别静脉输注不同药物后的药代参数,计算得静脉输注消旋布洛芬和R-布洛芬的手性转化率,此研究将为S-布洛芬注射液的开发以及在临床安全、合理用药提供参考。
材料与方法 仪器高效液相色谱分析仪1100 (配有G1312A二元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1322A真空脱气机) 及化学工作站 (Rev.B.04.03 [16]) (Agilent公司); 台式高速冷冻离心机TGL20M (长沙易达仪器有限公司); 多管涡旋仪VX-Ⅲ (藤锦 (北京) 科技有限公司)。
药品和试剂消旋布洛芬注射液 (成都苑东药业有限公司,规格: 4 mL∶400 mg,批号: 130706); S-布洛芬注射液 (成都苑东药业有限公司,规格: 5 mL∶300 mg,批号131139); R-布洛芬注射液 (成都苑东药业有限公司,规格: 5 mL∶300 mg,批号131202); 消旋布洛芬对照品 (中国食品药品检定研究院,批号100179-201105,纯度99.9%); S-布洛芬对照品 (成都苑东药业有限公司,批号101203-201201,纯度99.9%); 酮洛芬对照品 (中国食品药品检定研究院,批号100337-201104,纯度99.9%)。
实验动物比格犬18只,雌雄各半,体重 (12.0 ± 2.0) kg,年龄约1~2岁,实验动物合格证号: SCXK (京) 2010-0007,实验动物使用许可证号: SYXK (京) 2010-0024 (北京协尔鑫生物资源研究所)。
色谱条件色谱柱: Kromasil 100-5CHI-TBB (4.6 mm × 250 mm,5 μm); 预柱: Waters XbridgeTM C18,5 μm; 流动相: 乙腈-20 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液 (磷酸调pH 3.0,含5% 甲醇) (6∶4); 流速: 1 mL·min-1; 进样量: 20 μL; 柱温: 20 ℃; 检测波长: 220 nm。
对照品及内标溶液配制精密称取消旋布洛芬对照品适量,加入适量乙腈-水 (6∶4) 溶解,配制成1 mg·mL-1消旋布洛芬储备液。稀释后得到 S-布洛芬和R-布洛芬质量浓度均为5.0、10.0、20.0、100.0、250.0和500.0 µg·mL-1的标准曲线工作溶液,用乙腈-水 (6∶4) 稀释消旋布洛芬储备液,得到S-布洛芬和R-布洛芬15、50和400 µg·mL-1的质控工作溶液。精密称取酮洛芬适量,用甲醇配制成1 mg·mL-1储备液,再用甲醇稀释酮洛芬储备液得到5 μg·mL-1的内标工作溶液。
血浆样品预处理取比格犬血浆样品50 µL,加入5 µL乙腈-水 (6∶4),涡旋混匀,再加入150 µL内标工作溶液 (5 μg·mL-1的酮洛芬甲醇溶液),涡旋混合2 min,于10 ℃下离心10 min (12 000 r min-1),取上清液20 µL进样分析。
方法学考察 # 取空白比格犬血浆50 µL,分别依次加入各浓度标准曲线工作溶液5 µL,涡旋混匀,得到S-布洛芬和R-布洛芬浓度为0.5、1.0、2.0、10.0、25.0和50.0 µg·mL-1 的血浆样品,按照“血浆样品预处理”项下操作。以布洛芬各对映体浓度为横坐标,待测物与内标峰面积之比为纵坐标,用加权最小二乘法 (W = 1/C2) 进行回归运算,所得直线回归方程即为标准曲线。 准确度和精密度取空白比格犬血浆50 µL,加入5 µL低、中、高浓度的质控工作溶液,涡旋混匀,得到S-布洛芬和R-布洛芬浓度为1.5、5.0和40.0 µg·mL-1的质控样品,按照“血浆样品预处理”项下操作,每个浓度进行6样本分析,连续测定3批,随行标准曲线,以当日的标准曲线计算血药浓度,根据测定值采用单因素方差分析计算准确度和精密度。
提取回收率取空白比格犬血浆加入低、中、高浓度的质控工作溶液,涡旋混匀,经内标工作溶液 (5 μg·mL-1酮洛芬甲醇溶液) 沉淀蛋白后,取上清液进样分析,平行6样本分析,得到相应待测物峰面积与其内标的峰面积比值为RC。取空白比格犬血浆经内标工作溶液沉淀蛋白后,取上清液加入低、中、高浓度的质控工作溶液,涡旋混匀后进样分析,得到相应待测物峰面积与其内标的峰面积比值为RA。提取回收率的计算公式为 = RC/RA×100%。
稳定性取空白比格犬血浆50 µL,加入5 µL低、中、高浓度的质控工作溶液,涡旋混匀,得到S-布洛芬和R-布洛芬浓度为1.5、5.0和40.0 µg·mL-1的质控样品。分别考察低、中、高3个质控浓度血浆样品处理后室温放置48 h稳定性,血浆样品室温放置36 h、-20 ℃放置48天及3次冻融循环的稳定性。
比格犬药代动力学实验比格犬18只,雌雄各半,随机分为3组,分别静脉输注消旋布洛芬 (9 mg·kg-1)、S-布洛芬 (9 mg·kg-1) 和R-布洛芬 (9 mg·kg-1) 注射液。将原注射液用生理盐水稀释混匀,配置成浓度为1.5 mg·mL-1溶液,给药体积为6 mL·kg-1,静脉输注时间为20 min。于给药前和给药开始后5 min、10 min、20 min、25 min、35 min、50 min、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h于静脉采血约1 mL置于含有EDTA-K2的抗凝管中,在10 ℃离心后取血浆,置于-20 ℃中保存,待测。
数据处理根据比格犬分别静脉输注消旋布洛芬、S-布洛芬和R-布洛芬注射液(9 mg·kg-1) 后血浆中布洛芬对映体的浓度,采用WinNonlin 6.1软件,以非房室模型计算药代动力学参数,并用t-检验对参数进行比较。根据分别静脉输注等剂量R-和S-布洛芬计算比格犬体内左旋向右旋的手性转化率,转化率公式: F = AUCs:r/AUCs:s (AUCs:r表示静脉输注R-布洛芬测得比格犬体内S-布洛芬的AUC; AUCs:s表示静脉输注S-布洛芬测得比格犬体内S-布洛芬的AUC)。根据静脉输注消旋布洛芬注射液计算比格犬体内R-向S-布洛芬的手性转化率,计算公式为: F = (2AUCs:rs - AUCs:s)/AUCs:s (AUCs:rs表示静脉输注消旋布洛芬测得比格犬体内S-布洛芬的AUC; AUCs:s同上)。
结果 1 方法学考察 1.1 专属性在本实验所采用的色谱条件下,将S-布洛芬 (5 µg·mL-1) 按血浆样品处理后,进样可以确定其峰位为Ⅱ。将空白血浆、空白血浆加消旋布洛芬和内标以及比格犬给药后血浆外加内标的样品分别进行分离,内标酮洛芬、S-布洛芬和R-布洛芬的保留时间分别约为6.349、9.520和10.033 min,无内源性杂质干扰测定,具有良好的专属性。色谱图见图 1。
S-布洛芬的典型回归曲线方程为: Y = 0.054 1 C + 0.002 48 (r = 0.999 96)。R-布洛芬的典型回归曲线方程为: Y = 0.054 8 C - 0.002 18 (r = 0.999 49)。结果显示S-布洛芬及R-布洛芬在0.5~50.0 µg·mL-1内线性良好,定量下限均为0.5 µg·mL-1。
1.3 准确度、精密度及提取回收率S-布洛芬和R-布洛芬的准确度、精密度及提取回收率见表 1。布洛芬对映体的日间和日内精密度RSD (%) 均小于7%,准确度RE (%) 均在± 5%内。S-布洛芬和R-布洛芬的平均提取回收率分别为96.0% ± 3.9% 和97.8% ± 3.8% (n = 6)。
结果表明,S-布洛芬和R-布洛芬低、中、高 (1.5、5.0和40.0 µg·mL-1) 3个质控浓度血浆样品处理后室温放置48 h稳定,血浆样品室温放置36 h、-20 ℃放置48天及3次冻融稳定。
2 比格犬药代动力学 比格犬分别静脉输注消旋布洛芬
(9 mg·kg-1)、S-布洛芬 (9 mg·kg-1) 及R-布洛芬 (9 mg·kg-1) 注射液后,得到S-布洛芬和R-布洛芬的平均浓度-时间曲线,见图 2和图 3。图 2药-时曲线显示,单独S-布洛芬给药血浆中只检测到了S-布洛芬 (图 2B),而单独R-布洛芬给药血浆中同时检测到了S-布洛芬和R-布洛芬 (图 2C),说明R-布洛芬在体内单一方向转化得到S-布洛芬。图 3药-时曲线显示,相同剂量条件下,给予消旋布洛芬比单独给R-布洛芬比格犬体内的S-布洛芬暴露量大 (图 3A),说明输注的等量布洛芬药物,S-布洛芬越多,体内药效成分的暴露量越大,且图中显示给药消旋布洛芬比单独给R-布洛芬比格犬体内S-布洛芬消除半衰期短,说明输注的等量布洛芬药物,R-布洛芬越多,体内持续的单一方向转化会使S-布洛芬消除减慢,延长药物作用时间。
药代动力学参数见表 2。结果显示,比格犬静脉输注消旋布洛芬或R-布洛芬分别与静脉输注相同剂量S-布洛芬后,体内S-布洛芬的药代动力学参数作t检验显示,静脉输注S-布洛芬组的Cmax明显大于其他两组,tmax值也有显著性差异,而消除半衰期和AUC值均无显著性差异,说明体内R型向S型单一方向手性转化会延长药效成分达峰时间,输注的等量布洛芬药物中S-布洛芬越多药效成分峰浓度越大,但由于转化率较高,AUC值无显著性差异。同时对消旋布洛芬和R-布洛芬在比格犬体内R-向S-的转化率作t检验,显示两组间转化率无统计学差异 (P > 0.05),转化率一致。
本实验采用内标法测定布洛芬对映体浓度,选择结构与布洛芬相近的酮洛芬作为内标,实验证明内标与待测化合物分离较好,且回收率稳定。文献已报道的生物样品预处理方法有液液萃取[1, 7, 11, 12, 13]、固相微萃取[8]等。本实验对比了乙酸乙酯、甲基叔丁基甲醚、二氯甲烷液液萃取和甲醇沉淀蛋白的前处理方法,沉淀蛋白可以达到与液液萃取相同的灵敏度,在样品和内标出峰位置都没有干扰,可满足定量要求。
本实验初期考察了不同流动相组成对分离测定的影响。有机相选择截止波长较小的乙腈。比较了水相分别含甲酸 (0.1%、0.2%)、乙酸 (0.5%、1.0%) 或磷酸缓冲液对分离度和峰形的影响。结果显示,含甲酸、乙酸的水相在该手性柱上不能完全分离布洛芬对映体,磷酸盐缓冲液对布洛芬对映体分离明显优于前两种流动相。配制20 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液,磷酸调节pH至3.0、4.0、5.0,考察这三种情况下布洛芬对映体的分离情况。随着pH值的减小,保留时间延长,分离度增加。当pH 3时,布洛芬对映体的分离度最佳,且在色谱柱的pH耐受范围之内。最终确定了流动相条件为乙腈-20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液。
本研究建立了灵敏、准确和可靠的定量检测布洛芬对映体在比格犬血浆中手性HPLC生物分析方法,样品的处理过程仅需一步沉淀蛋白,操作简便快速,布洛芬对映体的定量下限均为0.5 µg·mL-1,可以很好的应用于布洛芬对映体血浆样品的高通量分析。
消旋布洛芬中的活性异构体为S-布洛芬,本研究中比格犬单独静脉输注S-布洛芬的血浆样本中只检测到S-布洛芬,与文献[3]报道的体内R-布洛芬单一向S-布洛芬转化相符。静脉输注消旋布洛芬后计算得左旋向右旋的转化率为 (70.1 ± 36.6) %,静脉输注R-布洛芬后计算得左旋向右旋的转化率为 (76.4 ± 36.2) %。两种算法计算得到的左旋向右旋的转化率一致。比格犬分别静脉输注消旋和右旋得到的S-布洛芬AUC值无显著性差异,但是数据也显示,个体间的转化率变化范围很大,存在较大差异。文献[2]报道因左旋向右旋转化需要体内酶 (辅酶A硫酯和/或甲基丙二酰辅酶A的消旋酶) 的参与,而这两种酶可能因种族、年龄、性别不同而有差异,故在使用消旋布洛芬时,因无法提前判断和控制个体内左旋向右旋的转化程度,会使药效因人而异,严重时可能会引发不良反应等毒副作用或在使用后不能达到预期治疗效果。另外,在肝硬化患者中的体内转化量明显低于健康人[14],使用后不足以引起S-布洛芬浓度的大幅度增加。由此可知,转化酶在生物体内存在很大个体差异。
此研究进一步证明与输注消旋布洛芬注射液相比,单独静脉输注S-布洛芬的达峰时间更快,峰浓度更高,使用相同剂量S-布洛芬和消旋布洛芬,前者的药理作用会更强,如需达到相同的药效作用,前者的使用剂量会更小,同时因前者给药剂量可以准确控制,S-布洛芬比消旋布洛芬更具切实可控的治疗效果和安全性。本项研究报道了连续静脉输注消旋布洛芬和R-布洛芬后左旋向右旋的转化,并比较了比格犬分别静脉输注消旋布洛芬和S-布洛芬药效成分S-布洛芬药代动力学参数,为S-布洛芬注射液的开发以及在临床安全、合理应用提供理论依据。
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