药学学报  2015, Vol. 50 Issue (12): 1603-1606   PDF    
地高辛在卵巢摘除大鼠体内药动学变化研究
靳永文1,2, 秦红岩1, 饶志1, 张国强1, 马彦荣1,2, 魏玉辉1, 武新安1     
1. 兰州大学第一医院, 甘肃兰州 730000;
2. 兰州大学药学院, 甘肃兰州 730000
* 通讯作者:Tel/Fax: 86-931-8616392, E-mail: xinanwu6511@163.com
摘要: 考察地高辛(digoxin, DIG)在大鼠卵巢摘除(ovariectomy, OVX)后体内药动学变化情况,并探讨其机制。将12只SD雌性大鼠随机分为两组,即OVX组和假手术组(n=6), OVX组打开腹腔摘除双侧卵巢缝合,假手术组打开腹腔后缝合,手术后正常饲养1个月,灌胃给予地高辛(2 mg·kg-1)。运用液质联用(LC-MS/MS)法测定地高辛的血药浓度,并采用Western blot法测定肠道P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达。口服给予地高辛后,与假手术组相比, OVX组AUC0-t无显著变化,但其Cmax较假手术组显著降低(P<0.01), OVX组的肠道P-糖蛋白的表达较假手术组具有升高趋势但无显著性差异(P>0.05)。结果表明,卵巢摘除之后大鼠地高辛的Cmax明显降低,可能与雌激素水平降低增加P-gp表达量有关。
关键词: 卵巢摘除     地高辛     P-糖蛋白    
Study of pharmacokinetics of digoxin in ovariectomized rats model
JIN Yong-wen1,2, QIN Hong-yan1, RAO Zhi1, ZHANG Guo-qiang1, MA Yan-rong1,2, WEI Yu-hui1, WU Xin-an1     
1. The First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract: This study aims to investigate the change of plasma concentration of digoxin(DIG) in rats with ovariectomy. Twelve female SD rats were randomly assigned into ovariectomized group and sham group(n=6). All rats plasma was collected after a single dose of 2 mg·kg-1 DIG administrated orally, serum DIG concentration was determined by LC-MS/MS. The level of P-gp in the intestinal was analyzed by Western blotting. Pharmacokinetic calculations were performed on each individual using DAS 2.0 practical pharmacokinetic software. Compared with the sham group, Cmax of ovariectomized group decreased significantly(P<0.01). There was no significant difference of AUC0-t and the level of P-gp was elevated in ovariectomized group. It was found that Cmax of DIG was significantly reduced after ovariectomy, and the change was associated with the decreased level of estrogen, which contributes to the increased level of P-gp.
Key words: ovariectomy     digoxin     P-glycoprotein    

更年期是女性生命中重要的一个阶段,大部分的女性发生在50多岁,更年期最显著的特点是由于卵巢功能退化而引起雌激素水平显著降低。女性更年期后雌激素水平明显降低,进一步引起血中低密度脂蛋白和甘油三酯迅速增加,高密度脂蛋白降低,随之更年期妇女的心血管病发病率明显升高[1, 2, 3, 4, 5]。地高辛 (digoxin,DIG) 是临床治疗心脏疾病的一线用药,属强心苷类药物,临床主要用于治疗充血性心力衰竭、心房纤颤和房扑等,可有效加强心肌收缩力、减慢心率、抑制心脏传导。地高辛可用于更年期妇女的心脏疾病的治疗。有研究表明地高辛的治疗窗窄,治疗量已接近60% 的中毒剂量[6],其体内浓度的细微变化可能会导致严重的毒副作用的发生,当体内环境发生变化,即更年期时是否对地高辛的药动学产生影响目前尚未见报道。本实验以大鼠卵巢摘除 (ovariectomy,OVX) 模型模拟雌激素水平下降后的更年期妇女体内环境[7, 8],考察OVX后地高辛的药动学变化情况,并初步探讨药动学发生变化的机制,为临床更年期妇女地高辛的合理应用提供参考。

材料与方法 试药

地高辛 (中国食品药品检定研究院,纯度: 99%,批号100015200308),去乙酰毛花苷 (deslanosidum,成都恒瑞制药有限公司,纯度: 98%),Rabbit polyclonal to ABCB11 (货号: ab112494)、Goat polyclonal secondary antibody to Rabbit IgG-H & l (HRP) (货号: ab6721) 以上抗体均由Abcam公司生产,RIPA裂解液 (碧云天公司,产品编号: P0013B),Marker (MBI Ferments公司,批号: SM1851),E CL发光液 (北京天能公司,批号: 1862418),去离子水 (兰州大学第一医院自制),其他试剂均为国产分析纯。

仪器

美国Agilent 1260型高效液相色谱仪,Agilent 6460型三重四级杆质谱仪 (配有电喷雾离子源,Masshunter分析操作软件),离心机 (Allegra 64R Centrifuge Beckmancoulter公司); DYCZ-24DN型电泳仪、DYCZ-40D转膜仪 (北京六一仪器厂); 低温高速离心机 (Sigma 3K15美国Thermo 公司); PVDF转移膜 (GE Healthcare,0.45 μm); X线胶片 (型号: XBT-1,日本Kodak公司); 电泳凝胶成像分析系统ImageQuant350 (GE Healthcare公司); LT-224S电子天平 (Sartorios 公司,BS 400S); 微量进样器 (宁波市正海三爱仪器厂); 水平摇床 (型号: WD-9405B,北京六一实验仪器厂)。

动物

雌性SD大鼠,6~8周龄,体重180~200 g,购于甘肃中医学院实验动物中心,合格证号 SCX K (甘) 2014-007。饲养于兰州大学第一医院药剂科动物房,温度20~24 ℃,湿度45%~75%,自由摄食进水。

色谱、质谱条件

色谱柱: Agilent HC-C18 (4.6 mm × 250 mm,3.5 μm); 保护柱: Agilent Zorbax耐高压保护柱 (4.6 mm × 12.5 mm,5 μm)。流动相: 甲醇,等度洗脱; 流速: 1 mL·min-1 (柱后分流比例为1∶4); 柱温: 30 ℃; 进样量: 20 μL; 内标: 去乙酰毛花苷。离子源为ESI源; 毛细管电压: 4 kV; 干燥气流速: 9 L·min-1; 干燥气温: 350 ℃; 雾化气压: 40 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 检测方式为多反应监测模式 (MRM),用于定量分析检测离子对: m/z 780.0 → 649.4/475.1 (地高辛),碰撞能量32 V/40 V,碎裂电压为160 V,m/z 941.0 → 779.4 (内标去乙酰毛花苷),碰撞能量32 V,碎裂电压为160 V。

大鼠卵巢摘除模型的建立

12只SD雌性大 鼠随机分为OVX真手术组和假手术组,每组6只。OVX组大鼠腹腔注射水合氯醛300 mg·kg-1进行麻 醉,打开腹腔,用4号线结扎两侧卵巢系膜血管后进行摘除,子宫复位后关腹。假手术组打开腹腔后摘取卵巢旁少许脂肪组织后关腹。

DIG给药及血样采集

模型制备成功后自由摄食、饮水饲养一个月,实验前禁食12 h并自由饮水。实验当日两组大鼠均灌胃给予2 mg·kg-1含10%乙醇的地高辛水溶液,并于给药前及给药10、20、40、60、120、180、240、360、480和720 min自股动脉采血0.3 mL于含肝素的离心管中,12 000 r·min-1离心 15 min,吸取上清液制得血浆,& #8722;20 ℃保存。

对照品溶液的制备

精密称取去乙酰毛花苷5.0 mg,置于5 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得1 mg·mL-1的内标储备液。精密称取地高辛5.0 mg,置于5 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得1 mg·mL-1的地高辛溶液。吸取内标储备液及地高辛溶液适量至100 mL量瓶中,甲醇定容,分别制得含内标400 ng·mL-1、地高辛400 ng·mL-1的对照品溶液以及仅含400 ng·mL-1的内标溶液,4 ℃储藏备用。

血浆样品预处理

取待测血浆样品40 μL,加入内标工作液40和80 μL的无水甲醇,涡旋振荡40 s,于14 500 r·min-1离心6 min,应用LC-MS/MS进样 20 μL测定分析。

免疫印迹

将采得的新鲜肠组织立即冻存于液氮中,后转存于 -80 ℃用于Western blot实验。具体操作步骤如下: 称取各组大鼠新鲜的肠组织0.04 g,RIPA裂解液 (强) (碧云天,P0013B) 400 µL提取总蛋白,BCA法测定蛋白含量,蛋白变性上样 (每孔含蛋白40 g),电泳,湿法转膜 (北京六一迷你型电泳仪),5% 脱脂奶粉封闭,加入P-gp一抗孵育 (5% 脱脂奶粉稀释比例为1∶1 000),山羊抗兔二抗孵育 (1∶3 000),曝光。采用ImageJ软件对结果进行灰度分析。

数据分析

药动学数据用Drug And Statistics of Windows 2.0 (DAS 2.0) 统计软件处理。运用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。检验水平 (α) 为0.05,采用t检验。

结果 1 质谱分析和方法学考察

在上述的质谱条件下,地高辛和内标去乙酰毛花苷主要生成 [M-H]- 准分子离子峰,分别为m/z 780.0和m/z 941.0。选择性对 [M-H]- 进行MS2产物离子全扫描质谱分析 (图 1)。配制地高辛质量浓度为0.78~400 ng·mL-1的标准血浆样品,按“血浆样品预处理”项下进行操作。地高辛和内标峰形良好,其色谱图见图 2。以样品与内标峰面积比值对样品浓度进行回归计算,求得地高辛的回归方程,r2 > 0.998 9。选地高辛质量浓度为1.56、12.5和200 ng·mL-1的质控样品进行精密度、回收率、基质效应和稳定性考察。结果表明,地高辛的回收率大于80%,精密度、回收率、基质效应和稳定性符合要求。

Figure 1 MS/MS product ion mass spectra of digoxin (DIG,A),and deslanosidum (B,internal standard)

Figure 2 MRM chromatograms of DIG and deslanosidum. A: Blank plasma; B: Blank plasma + reference substance; C: Plasma samples. I: DIG; II: Deslanosidum
2 大鼠卵巢摘除后DIG的药动学

大鼠灌胃2 mg·kg-1地高辛后,OVX组和假手术组药-时曲线见图 3,药动学参数见表 1。由实验结果可知,与假手术组相比,OVX组Cmax显著降低 (P < 0.01),t1/2有降低趋势,但无统计学意义 (P > 0.05),AUC0-ttmax、CL、MRT等未发生显著变化。

Figure 3 Mean plasma concentration-time curves of DIG (2 mg·kg-1) after single administration in rats. n = 6,x± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs the sham group

Table 1 Pharmacokinetic parameters of DIG in rats. n = 6,x± s. **P < 0.01 vs the sham group
3 大鼠肠道P-gp的表达量

OVX组的大鼠肠道P-gp的表达量较假手术组有升高趋势,但无统计学差异 (P > 0.05),结果见图 4

Figure 4 Western blotting analysis of P-gp in rat intestinal. n = 3,x± s
讨论

由于地高辛在更年期妇女中的应用较为常见,但在更年期引起女性体内环境变化后,其药动学是否受到影响尚未见相关报道。研究发现,卵巢摘除大鼠雌激素缺乏导致体重和内脏脂肪显著增加,伴随血清脂蛋白、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平增加[9]。卵巢摘除大鼠体内环境的变化与妇女更年期后体内内环境的变化相近,因此,常用做研究更年期后妇女体内环境变化的动物模型。地高辛在临床应用中多以口服的方式服用,大量研究表明,肠道P-gp对地高辛的吸收起着决定性的调控作用[10, 11, 12]。此外,有报道表明雌激素对P-gp的表达及功能具有一定调控作用[13]。本实验针对大鼠卵巢摘除后P-gp表达量的变化对地高辛药动学的影响进行研究,而较高水平的血药浓度可更明确地反映P-gp介导其药动学变化情况[14, 15, 16],本文给予高剂量地高辛后考察了OVX模型下其药动学变化及小肠P-gp表达的变化情况。

实验结果显示,OVX后大鼠体内地高辛血药浓度降低,肠道P-gp表达量有升高趋势,表明OVX抑制地高辛的小肠吸收可能是由OVX后 P-gp水平升高引起。由于更年期妇女因患病风险的增加而很可能服用大量经P-gp介导的治疗药物。因此,本实验结果提示: 更年期妇女服用经P-gp介导的治疗药物,或体内过程与年龄有关 (包括更年期后妇女) 的药物时应密切关注其可能发生的药动学变化情况。

综上所述,本实验利用体内药动学模型,观察到给予OVX大鼠地高辛后,体内地高辛的血药浓度发生显著变化。在临床应用地高辛治疗更年期妇女心脏疾病过程中引起的药物药动学变化需要进一步研究。

参考文献
[1] Verit FF, Keskin S, Omer B, et al. Is there any relationship between cardiovascular risk markers and young women with diminished ovarian reserve[J]. Gynecol Endocrinol, 2014, 30:697-700.
[2] Pfeifer EC, Crowson CS, Amin S, et al. The influence of early menopause on cardiovascular risk in women with rheumatoid arthritis[J]. J Rheumatol, 2014, 41:1270-1275.
[3] Chen H, Perez JN, Constantopouls E, et al. A method to study the impact of chemically-induced ovarian failure on exercise capacity and cardiac adaptation in mice[J]. J Vis Exp, 2014, 86:3791-3795.
[4] Maric-Bilkan C, Gilbert EL, Ryan MJ, et al. Impact ofovarian function on cardiovascular health in women:focus on hypertension[J]. Int J Womens Health, 2014, 6:131-139.
[5] Ebong IA, Watson KE, Coff DC Jr, et al. Age at meno-pause and incident heart failure:the multi-ethnic study of athero-sclerosis[J]. Menopause, 2014, 6:585-591.
[6] Kurzwski M, Bartnicka L, Florczak M, et al. Impact of ABCB1(MDR1) gene polymorphism and P-glycoprotein inhibitors on digoxin serum concentration in congestive heart failure patients[J]. Pharmacol Rep, 2007, 59:107-111.
[7] Jung SR, Kim SH, Ahn NY, et al. Changes of bone metabo-lism based on the different interventions with exercise type or additional intake material in ovariectomiaed rats[J]. J Exerc Nutr Biochem, 2014, 1:111-117.
[8] Xu XC, Chen H, Zhang X, et al. Simvastatin prevents alveolar bone loss in an experimental rat model of periodontitis after ovariectomy[J]. J Transl Med, 2014, 1:284. doi:10.1186/s12967-014-0284-0.
[9] Camara C, Zhou LY, Ma Y, et al. Effect of ovariectomy on serum adiponectin levels and visceral fat in rats[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2014 014 1360-1367.
[10] Peng SX, Ritchie DM, Cousineau M, et al. Altered oral bioavailability and pharmacokinetics of P-glycoprotein substrates by coadministration of biochanin A[J]. J Pharm Sci, 2006, 95:1984-1993.
[11] Yoshida N, Takagi A, Kitazawa H, et al. Effects of citron-ellal, a monoterpenoid in Zanthoxyli Fructus, on the intestinal absorption of digoxin in vitro and in vivo[J]. J Pharm Sci, 2006, 95:552-560.
[12] Hori R, Okamura N, Aiba T, et al. Role of P-glycoprotein in renal tubular secretion of digoxin in the isolated perfused rat kidney[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1993, 266:1620-1625.
[13] Fajac A, Gligorov J, Rezai K, et al. Effect of ABCB1 C3435T polymorphism on docetaxel pharmacokinetics according to menopausal status in breast cancer patients[J]. Br J Cancer. 2010, 103:560-566.
[14] Han YL, Li D, Yang QJ, et al. In vitro inhibitory effects of scutellarin on six human/rat cytochrome P450 enzymes and P-glycoprotein[J]. Molecules, 2014, 15:5748-5760.
[15] Feng X, Liu Y, Wang X, et al. Effects of piperine on the intestinal permeability and pharmacokinetics of linarin in rats[J]. Molecules, 2014, 15:5624-5633.
[16] Zhu Y, Meng Q, Wang C, et al. Methotrexate-bestatin interaction:involvement of P-glycoprotein and organic anion transporters in rats[J]. Int J Pharm, 2014, 465:238-277.