1 靶标和目标化合物的设定

凝血过程是个复杂的级联反应,在这个过程中,因子Xa (FXa) 的活化至关重要。FXa属于丝氨酸蛋白酶,其功能是被内源或外源性因素刺激后而致活,将凝血酶原转变成凝血酶,后者具有多种凝血功能: 将纤维蛋白元转变为纤维蛋白,使血小板活化,以及反馈性的激活其他凝血因子,从而又放大FXa的自身生成。所以FXa抑制剂可降低凝血酶的放大性的生成,阻止凝血和血小板的活化,成为抗凝血药物的理想靶标。

研发FXa酶抑制剂的目标是非肽类的小分子药物,可口服吸收,最好每日一次,防止手术后深度静脉栓塞以及其他重要脏器的栓塞,同时应有较低的出血风险。

2 苗头化合物及其向先导物的过渡

拜耳公司通过高通量筛选方法获得了苗头化合物1,对FXa酶的抑制活性IC₅₀ = 120 nmol·L^-1。在由苗头过渡到先导物 (hit-to-lead) 的操作中,研究者对1进行了三方面的变换: ① 用不同的连接基替换四氢苯二甲酰亚胺片段,其中之一是用二氢异吲哚酮替换 (骨架迁越: 保留了必要的功能基和连接基,易于合成); ② 降低脒基的碱性和离解性,变换成弱碱性或中性基团,以利于过膜吸收; ③ 变换氯代噻吩甲酰胺片段。在全结构的修饰中,发现化合物2的活性提高了15倍,IC₅₀ = 8 nmol·L^-1。说明碱性的脒基和连接基可以修饰改造,而氯代噻吩甲酰胺基是必要的药效团。然而2的生物利用度低,不能达到先导物的要求。

进一步进行高通量筛选,目标集中在含有噻吩甲酰胺基类型的化合物,只发现化合物3具有非常 弱的抑制活性,IC₅₀ = 20 μmol·L^-1,但结构中含有噁唑烷酮片段有可取之处,因为对溶解性有利。在噻吩环的5位加入氯原子,化合物4的活性为IC₅₀ = 90 nmol·L^-1,比化合物3强200倍,表明噻吩环的氯代很重要。化合物4不含有脒基或形成正离子的基团,纠正了以前认为正离子与S1腔结合是活性必需的观点。化合物4含有噁唑烷酮有助于溶解与吸收。由于这些有利的条件,将4定为先导物进入结构优化。4的手性中心为S构型,合成的R-对映体的抑制FXa的活性为IC₅₀ = 2 300 nmol·L^-1,显著低于S异构体。优化合成的化合物均为S构型。

3 结构优化

在苗头过渡到先导物 (hit-to-lead) 的操作中已经确定了占优的结构因素: 简约的连接基噁唑烷酮有利于物化性质; 氯代噻吩甲酰胺是必需的药效团的特征之一 (但未探索环上的双取代); 手性中心为S构型。因而在优化活性和成药性的结构时,目标集中在先导物4的硫代吗啉和氟代苯的变换。

3.1 硫代吗啉的变换

用吗啉置换硫代吗啉环,化合物5活性提高近2倍,IC₅₀ = 32 nmol·L^-1; 哌嗪环置换的活性显著降低,IC₅₀ = 140 nmol·L^-1; 用四氢吡咯替换,化合物6的IC₅₀ = 40 nmol·L^-1; 二甲胺基化合物活性降低到IC₅₀ = 74 nmol·L^-1; 吡咯烷酮化合物7的活性提高10倍,IC₅₀ = 4 nmol·L^-1。引入羰基有利于提高活性,羰基加到吗啉环上得到的化合物8活性显著提高,IC₅₀ = 0.7 nmol·L^-1。

3.2 苯环的取代基变换

苯环上3位氟原子的有无对不同的化合物活性的影响没有规律性变化。例如化合物6若无F原子取代活性略高; 而化合物8的3-F取代化合物9活性略弱 (IC₅₀ = 1.4 nmol·L^-1),而且3位用氨基和三氟甲基取代活性亦略下降。然而苯环若有2位取代基则显著降低活性。化合物8的R对映体的IC₅₀ = 2 300 nmol·L^-1,再次证明S构型是优映体 (eutomer)。至此,化合物8是先导物优化中活性最强的化合物。

3.3 噻吩环的变换: 调整药代动力学性质

化合物8的溶解性较低,结晶态的水溶解度为8 mg·L^-1,脂水分配系数logP = 1.5,与血浆蛋白结合率为99.5% (Mueck W,Stampfuss J,Kubitza D,et al. Clin Pharmacokin Clin Pharmacodyn,2014,53: 1-16)。

从结构上分析影响脂溶性的主要片段是5-氯代噻吩,为了改善药代动力学性质,对该片段进行了广泛的改造,结果是除了5-Br代的活性基本不变外 (脂溶性强于5-Cl化合物),用甲基噻吩、氨基噻吩、氯代噻唑、氯代呋喃、氯代苯、氯代吡啶等置换的化合物活性都下降,表明变换5-氯代噻吩对活性影响较大,因此在化合物7、8和9中选择活性和药代性质综合效应最佳者作为候选药物 (Roehrig S,Straub A,Pohlmann J,et al. J Med Chem,2005,48: 5900-5908)。

4 化合物8的研发: 利伐沙班上市

通过体外测定延长凝血酶原二倍时间所需化合物的浓度 (越低越好) 和麻醉大鼠体内动静脉分流模型测定半数有效剂量 (越小越好),比较了化合物7、8和9的药效学性质,表明化合物8优于7和9。大鼠和比格犬的药代性质,如口服生物利用度、血浆半衰期和清除率等8也优于7和9。化合物8对FXa有很高的选择性抑制作用,在20 μmol·L^-1的高浓度下对其他丝氨酸蛋白酶,如凝血酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、尿激酶以 及FVIIa、FIXa、FXIa等未显示抑制作用。综合上述优势,确定化合物8为候选药 物,定名为利伐沙班 (rivaroxaban),进入临床研究。经三期临床试验表明,口服利伐沙班在肠道吸收,一次给药后4 h后抑制FXa达到最大值,并持续8～ 12 h,24 h后FXa的活性复原,因而每日口服一次,用于预防髋关节和膝关节置换术后患者深静脉血栓 (DVT) 和肺栓塞 (PE) 的形成。于2011年经FDA批准在美国上市。

5 与利奈唑胺的结构相似性

利伐沙班 (8) 的化学结构与抗菌药利奈唑胺 (10,linezolid) 有很大的相似性,例如都含有噁唑烷酮片段,而且两端相连的吗啉苯基与酰胺片段也很相似,甚至手性中心的构型都是相同的。但二者的作用机制和适应证完全不同。利奈唑胺抑制细菌蛋白质合成,通过选择性结合细菌50s亚单位的23s核糖体核糖核酸上的位点,抑制细菌核糖体的翻译过程,是抗革兰阳性菌药物。

研究表明,利伐沙班及其代谢产物没有抗菌作用,而且对线粒体的作用很弱,这与长期应用利奈唑胺可引起线粒体毒性是不同的。在药物化学中,相似的化学结构具有相似或相关的药理活性,这个一般原则在这里不存在。

6 利伐沙班与FXa的结合模式

利伐沙班是基于药物化学的理念和方法设计合成的,而并未借助酶的三维结构作理性设计。通过回顾性分析利伐沙班与FXa复合物的晶体结构,揭示了结构成功设计的合理性。在晶体结构中,S构型的噁唑烷酮采取了L-形状的构象,使得利伐沙班分子与Gly219形成两个重要的氢键: 噁唑烷酮的羰基与HN形成强氢键结合 (2.0Å),酰胺的NH与Gly219的羰基形成弱氢键结合 (3.3Å)。酶的S4疏水腔由Tyr99、Phe174和Trp215构成,吗啉酮环被夹在Tyr99和Phe174中间,酮基在S4腔中没有形成极性键结合,而是由于邻位效应使吗啉环垂直于苯环,从而提高了结合性能,因为没有酮基的化合物5吗啉与苯环的共面性,使得活性弱减60倍。氯代噻吩环结合于S1腔,氯原子与Tyr228的苯环发生卤素-π电子的相互作用,代替了其他抑制剂的脒基 (带正电荷) 与Asp189在S1腔中形成的静电相互作用。在药代行为上,卤素-π电子的相互作用显然优于正负电荷的结合作用。图 1是利伐沙班与FXa复合物结合的示意图。