鹿茸 (Cervi cornu pantotrichum) 是我国传统名贵中药,《神农本草经》列为中品,在临床配伍和中成药生产中使用广泛。现代药理研究表明,鹿茸在生殖系统、免疫系统、心血管系统、神经系统、血液系统等方面均有较好疗效,对于提高性功能有明显药理作用^{[1, 2]}。近年来,随着鹿茸在药品、保健品和食品应用范围的逐步拓宽,市场上出现了多种不同包装的鹿茸粉,产品质量参差不齐,大量伪品和混淆品充斥市场,致使市场流通和临床应用较为混乱^{[3, 4, 5]}。2010版《中国药典》收载鹿茸来源于鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角^[6]。由于市售鹿茸产品种类繁多,且以加工包装形式出售为主,药材性状发生一定改变,利用传统鉴定方法鉴别鹿茸产品具有一定局限性。

DNA条形码技术通过建立一套标准化的中药DNA条形码鉴定流程,构建中药DNA条形码序列数据库,从而实现中药鉴定的标准化和自动化。中药材DNA条形码鉴定系统 (http://www.tcmbarcode.cn) 是DNA条形码技术与生物信息学技术相结合而建立的网络信息化操作平台,该系统涵盖2010版《中国药典》收录的几乎所有动植物药材及其常见混伪品,同时包含韩国、日本、美国、印度和欧洲药典95% 以上的药材,适用于中药监管部门、中药生产企业、中药研究单位和个人快速、准确鉴定中药材^[7]。建立中药材DNA条形码鉴定系统,对中药生产企业的原料管控、中药材流通领域、医院饮片的真伪鉴定、出入境检验检疫等方面具有重要意义^{[8, 9, 10, 11, 12]}。本研究利用DNA条形码技术,基于中药材DNA条形码鉴定系统,建立鹿茸粉的准确鉴别方法,对医院、药店、保健品和食品市场流通的鹿茸粉进行基原鉴别,为市场监督及临床用药安全提供技术手段和科学依据。

材料

本研究共71份鹿茸粉作为待检对象,分别购自国内各大药店、公司及医院,包括吉林、黑龙江、辽宁等主要鹿类养殖地。实验材料详见表 1。

取鹿茸粉25～35 mg,利用血 液/细胞、组织基因组提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China) 提取总DNA,PCR扩增参照2010版《中国药典》第三增补本中动物药材DNA条形码分子 鉴定标准流程操作 (SOP),扩增产物经纯化后使用ABI3730XL (Applied Biosystems Co.,USA) 测序仪进行双向测序。根据测序峰图判断可能为混合物的样品,每个样品采用分子克隆法筛选至少10个阳性克隆测序^[13]。

将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统 (http://www.tcmbarcode.cn) 应用BLAST(basic local alignment search tool) 方法进行结果判定,相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种。中药材DNA条形码鉴定系统操作流程如下: 登录中药材DNA条形码鉴定系统网站,在主页点击“物种鉴定”,将测序获得的DNA条形码序列粘贴到“动物类药材鉴定 (COI)”的序列输入栏,点击“提交”按钮。在比对结果中“序列比对信息”栏查看相关比对信息,“物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。

市售鹿茸粉种类繁多,但大多外观形态相似 (图 1),难以准确辨认。71份市售待检样品中,有3份待检样品序列测序峰图杂合度较高,初步推测样品来源为混合物,采用分子克隆方法进一步鉴定研究,另有3份待检样品未获得COI序列。本研究采用PCR产物直接测序成功获得65份鹿茸粉样品的COI序列,基于中药材 DNA 条形码鉴定系统进行鉴定。结果显示 (表 1),65份鹿茸粉样品中,基原物种梅花鹿占24%,马鹿占14%,其中马鹿又分为两个类群,62%的市售鹿茸粉均非2010版《中国药典》规定基原,以驯鹿为主。以图 1中3种不同来源鹿茸粉为例,详细说明鉴定流程和实验结果。

Figure 1

Figure 1 Antler powder from drugstores or companies. A: TCM042; B: TCM016; C: TCM008

(Table 1)

Table 1 Sample information of antler powder. Mixture: Mixed powder samples; NS: No sequence Voucher No. No. of samples Market label Locality Barcode ID TCM001-003 3 Antler powder Beijing Cervus elaphus TCM004-006 3 Sika deer antler powder Beijing C. nippon TCM007-012 6 Antler powder Beijing Rangifer tarandus TCM013-015 3 Antler powder Baishan,Jilin C. nippon TCM016 1 Sika deer antler powder Baishan,Jilin R. tarandus TCM017 1 Antler powder Changchun,Jilin C. elaphus TCM018-021 4 Antler powder Changchun,Jilin R. tarandus TCM022 1 Sika deer antler powder Tonghua,Jilin Mixture TCM023 1 Antler powder Tonghua,Jilin R. tarandus TCM024-025 2 Antler powder Yinchuan,Ningxia R. tarandus TCM026 1 Antler powder Yinchuan,Ningxia Mixture TCM027-028 2 Antler powder Lanzhou,Gansu R. tarandus TCM029-030 2 Antler powder Guiyang,Guizhou R. tarandus TCM031-032 2 Antler powder Tianjin R. tarandus TCM033-034 2 Antler powder Chengdu,Sichuan R. tarandus TCM035 1 Antler powder Chengdu,Sichuan NS TCM036-037 2 Antler powder Chongqing R. tarandus TCM038-039 2 Antler powder Nanning,Guangxi R. tarandus TCM040-042 3 Antler powder Changsha,Hunan C. elaphus TCM043-045 3 Sika deer antler powder Changsha,Hunan C. nippon TCM046-049 4 Antler powder Zhengzhou,Henan R. tarandus TCM050 1 Antler powder Zhengzhou,Henan C. nippon TCM051-052 2 Antler powder Fuzhou,Fujian R. tarandus TCM053-054 2 Antler powder Hangzhou,Zhejiang C. elaphus TCM055 1 Antler powder Wuhan,Hubei R. tarandus TCM056 1 Antler powder Wuhan,Hubei Mixture TCM057 1 Antler powder Xi’an,Shaanxi R. tarandus TCM058-059 2 Antler powder Taiyuan,Shanxi R. tarandus TCM060-062 3 Antler powder Harbin,Heilongjiang C. nippon TCM063-064 2 Antler powder Harbin,Heilongjiang R. tarandus TCM065-066 2 Antler powder Shenyang,Liaoning R. tarandus TCM067-068 2 Antler powder Jinan,Shandong R. tarandus TCM069 1 Antler powder Jinan,Shandong NS TCM070 1 Antler powder Kunming,Yunnan NS TCM071 1 Antler powder Hefei,Anhui R. tarandus

Table 1 Sample information of antler powder. Mixture: Mixed powder samples; NS: No sequence

TCM042样品外包装标示为鹿茸粉,获得其COI序列粘贴到“动物类药材鉴定 (COI)”的序列输入栏,点击“提交”按钮,鉴定结果显示该样品基原物种为马鹿C. elaphus,是2010版《中国药典》规定基原物种。TCM016样品外包装标示为梅花鹿鹿茸粉,经中药材 DNA 条形码鉴定系统鉴定为驯鹿R. tarandus,不符合2010版《中国药典》规定; TCM008样品外包装标示为鹿茸粉,鉴定结果显示为驯鹿R. tarandus,不符合2010版《中国药典》规定。

基于抽检的市售鹿茸粉检测结果,从不同公司、不同价格、不同地域3个方面对成功获得COI序列的65份鹿茸粉样品进行市场调查分析 (图 2)。结果表明,市售价格在每克22元 (含) 以上的鹿茸粉样品基原为梅花鹿或马鹿,浙江、湖南来源的样品基原为梅花鹿或马鹿,抽检公司的样品基原有梅花鹿、马鹿及驯鹿,以驯鹿为主。

从地域分析来看,65份市售鹿茸粉来源于全国20个地区,分析显示各地区样品的基原物种情况不一,总体以驯鹿为主。研究表明,浙江、湖南收集8份样品基原为梅花鹿或马鹿; 黑龙江、北京、河南各收集的5份、12份、5份鹿茸粉样品中分别有2份、6份、4份为非药典规定基原; 吉林收集10份样品中6份为非药典规定基原,包括1份外包装标明梅花鹿鹿茸粉,而实际检测结果为驯鹿; 宁夏、甘肃、贵州、天津、四川、重庆、广西、福建、湖北、陕西、山西、辽宁、山东、安徽等地收集25份样品的基原均为驯鹿。

从价格方面分析,市售65份鹿茸粉价格区间较大,最高售价与最低售价相差13倍,从每克3元到40元不等,其中市售产品以每克5至10元区间内居多。结果显示,以每克22元、24元、40元价格市售14份鹿茸粉样品的基原为梅花鹿或马鹿; 以每克5元、8元、10元、15元价格市售的12份、2份、7份、7份鹿茸粉样品中分别有9份、1份、5份、4份为非药典规定基原。市售价格分别为每克3元、4元、7元、12元、13元、20元的23份样品的基原均为驯鹿。

65份市售鹿茸粉中,有35份样品购自国内各大药店及医院,另外30份样品分别购自10家公司,涵盖制药公司、保健品和食品公司,以每家公司购买3个批次样品为原则,保证实验结果稳定性与准确性。对产品外包装调查结果显示,10家公司中有8家公司外包装以鹿茸粉名称出售,说明书中未详细列出组成成分,另外2家公司以梅花鹿鹿茸粉名称出售,其成分描述为梅花鹿鹿茸粉。鉴定结果显示有5家公司市售产品的基原既有梅花鹿和马鹿,也有驯鹿,且驯鹿所占比例均在50%以上,另外5家公司产品的基原全部为非药典规定基原。可见,在对各公司抽检样品中,外包装说明与实际检测结果不符、基原物种不符合国家药典规定等现象较为常见。

Fig. 2

Fig. 2 Authenticity of antler powder collected from different regions, prices and companies. a: Company code: A; Price: 22, 24, 40 yuan·g−1; Region: Zhejiang, Hunan; b: Company code: B; Price: 8 yuan·g−1; Region: Heilongjiang; c: Company code: C; Price: 15 yuan·g−1; Region: Beijing; d: Company code: D; Price: 10 yuan·g−1; Region: Jilin; e: Company code: E; Price: 5 yuan ·g−1; Region: Henan; f: Company code: F, G, H, I, J; Price: 3, 4, 7, 12, 13, 20 yuan·g−1; Region: Ningxia, Gansu, Guizhou, Tianjin, Sichuan, Chongqing, Gaungxi, Fujian, Hubei, Shaanxi, Shanxi, Liaoning, Shandong, Anhui

根据测序峰图初步判断,来源于宁夏银川市 (TCM026)、湖北武汉市 (TCM056)、吉林通化市 (TCM022) 的3个样品为混合物,售价分别为每克20元、13元、8元。采用分子克隆方法进行鉴定研究,对每一个样品选取至少10个克隆,即测序获得10条COI序列进行分析。以待检样品TCM026为例在中药材DNA条形码鉴定系统中进行鉴定,结果显示TCM026的10条COI序列中,6条为马鹿序列,2条为梅花鹿序列,其余2条序列在鉴定系统提交后显示未查询到最接近物种,显示这两条序列与梅花鹿和马鹿的COI序列差异很大,该结果证实样品来源确为混合物; 样品TCM056的16条COI序列中,11条为马鹿序列,3条为梅花鹿序列,2条序列未查询到最接近物种,鉴定该样品为混合物; 样品TCM022的10条COI序列的来源均为马鹿,但分析显示来自两个不同类群,且两个类群的序列存在较大差异^[14],证实该样品的马鹿品种不纯,尽管为正品来源,但与产品标示“梅花鹿鹿茸粉”不符。

本研究对全国购买的71份鹿茸粉进行DNA提取,成功获得65条COI序列,并应用中药材DNA条形码鉴定系统进行分子鉴定。研究表明,市售鹿茸粉的基原物种有梅花鹿、马鹿和驯鹿,且驯鹿占主要来源。此外,分别从不同地区、不同价格、不同公司3个层面对抽检65份样品的基原进行分析发现,市售鹿茸粉基原物种以驯鹿为主。本研究结果仅依据所收集71份待检样品,不代表所有市场流通鹿茸粉产品的质量。但是,利用DNA条形码技术对市售鹿茸粉进行基原鉴别,分析结果更加客观准确,为粉末类药材产品的评价和质量控制提供科学依据。

研究发现3份鹿茸粉可能是混合物,采用分子克隆技术成功获得36条COI序列。结果证实这3份样品均为混合粉,以马鹿和梅花鹿为主要成分。因此,DNA条形码技术可有效检测药材存在混合物或掺伪的现象,为粉末类药材及饮片的准确鉴定提供保障。此外,有3份样品经过反复实验,未成功获得COI序列,原因分析如下: ① 药材前期处理、加工工艺的差异,导致DNA降解严重,提取相对困难。② 药材粉末通过性状、显微等方式难以鉴别,很有可能样品本身为非动物药材,不含DNA成分。总之,这3份样品在药材质量上存在疑问。

研究表明市售鹿茸粉来源复杂多样,以驯鹿粉为主,且存在马鹿粉品种不纯、马鹿和梅花鹿混合粉、含有杂质掺伪等问题,这一结论与已报道对鹿茸原料药材市场调查一致^[14]。Cheng等^[15]利用高通量 测序技术和宏基因组数据分析等方法,对不同厂商生产的中成药六味地黄丸物种组成进行分析,结果显示厂商不同,其物种组成上差异较大,影响其临床用药疗效。Newmaster等^[16]利用DNA条形码序列 (rbcL+ITS2) 对北美12家公司44种草药产品进行检测,结果显示59% 样品中含有未在标签上列出的物种,33% 物种认证准确的产品中仍然含有未在标签列出的污染物和杂质,且草药产品多数含有大量替代品、杂质或填料,仅有2家公司的产品未检出任何替代品。这些问题对于中药生产企业如何有效鉴别原料药的真伪,提出了巨大挑战。另一方面,随着中药材需求的不断扩大,市场竞争愈演愈烈,中药材的供需矛盾加剧,且同种药材由于品种、产地、加工、运输、贮藏等的不同,导致其质量差异很大,这种差异导致了市场的不平衡以及不正当竞争,使中药生产流通领域出现一些 制假售假现象,中药生产企业对原料药材的管控迫切需要新的技术手段,原料药材的真伪鉴别直接关系到中药生产企业制药安全以及产品的临床疗效。DNA条形码技术通过为中药材制作一张特殊的“基因身份证”,对物种进行快速、准确的识别与鉴定,实现中药生产和流通环节的有效管控。目前,多家中药企业定制了中药材DNA条形码鉴定系统,为生产过程中原料药的准确鉴定及产品检测提供科学依据,有利于保障中药材安全应用。

由于市售中药材种类繁多,药材饮片和中成药品种冗杂,消费者购买时仅仅依靠外观、色泽、气味等性状鉴别手段难以判断真伪,缺少对药材真伪及成药质量判别的科学手段,不能保证消费者对产品的知情权,消费者容易购买到以次充好的产品,甚至伪品,从而损害消费者利益。中药材DNA条形码鉴定系统以DNA条形码技术为核心,对消费者购买质量优、疗效好的产品提供科学指导,能够切实保障消费者权益。市场应用层面,消费者可通过以下两种方式保证自身的知情权: 一是个人对样品进行检测,在中药材DNA条形码鉴定系统 (http://www.tcmbarcode.cn) 注册激活登录后,将获得的结果进行比对,确定所购买产品的真实成分; 二是委托有关执法机构或研究院所利用该鉴定系统对产品进行真伪检测。为了进一步方便消费者识别产品真实成分,课题组开发了中药材二维DNA条形码^[17],合法中药企业只需将产品的二维DNA条形码标注于包装上,消费者利用手机二维码扫描软件“扫一扫”即可获知DNA序列,并通过手机网页浏览器提交到鉴定系统确定产品真伪。相关执法机构通过抽检方式可有效核实中药企业的诚信度,为公众提供实时咨讯。

粉末类药材的鉴定主要通过光谱和色谱手段对其化学成分进行测定,利用DNA条形码进行鉴定,提供了一种新的方法,同时该方法可应用于中成药的原料药材鉴定^{[18, 19]},是传统鉴定方法的有效补充。Kool等^[20]对摩洛哥南部111份根类药材进行检测,利用rpoC1、psbA-trnH、ITS三种序列标签成功鉴定到属的水平,结果显示18% 的药材不属于摩洛哥药典规定品种,且市售大部分药材存在掺伪情况。Coghlan等^[21]基于第二代高通量测序技术 (high-throughput sequencing,HTS) 检测包括散剂 (powders)、片剂 (tablets)、胶囊剂 (capsules) 和药茶 (herbal teas) 等在内的15种不同剂型的中成药,共获得超过49 000条16S rRNA和trnL序列,表明该技术可以作为中药产品的真伪和海关检验的有效工具。Tian等^[22]应用宏条形码方法对中药大黄蛰虫丸进行基原鉴定,解析到蛴螬、虻虫、甘草及桃仁或苦杏仁等中药成分。由此可见,在基因层面,分子鉴定为解决药材饮片及中成药的鉴别问题提供了客观而有效的手段。DNA条形码技术作为新兴的分子鉴定方法,可服务于市场监督及政府监管部门,高效实现对中药材市场、医院饮片、海关中药材进出口、出入境检验检疫等流通过程中的药材鉴定与监管。通过该技术的有效实施,完善中药材监督管理相关法律法规,推进中药材鉴定体系迈入通用化和标准化时代。

中药材传统鉴定方法 (基原、显微、性状、理化鉴定) 有其自身特点和应用范围,在实际应用层面,对专业知识背景和鉴定经验有较高要求。与传统的 鉴定方法相比,DNA条形码技术不受个体形态、大小等特征的影响,具有通用性强、实用性强、重复性高、样品处理简单、样品用量少及可数字化等优势,能够直接从基因水平为药材及中成药鉴定提供科学依据,但在中成药质量控制研究方面,应用尚不广泛,建议加强该技术的推广使用。中药DNA条形码技术为解决中草药混用和掺假等行业问题提供了强有力工具,对保障传统草药临床用药安全具有重要现实意义。