托品烷类生物碱 (tropane alkaloids,TAs) 是一类临床上应用价值非常广泛的植物次生代谢产物,主要包括莨菪碱 (hyoscyamine) 和东莨菪碱 (scopolamine)。由于具有显著的抗胆碱活性,它们被广泛应用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等,市场需求大^[1]。东莨菪碱相比莨菪碱具有更强的药效和更小的不良反应,市场需求约是莨菪碱的10倍,价格也更昂贵,仅仅在 以东莨菪碱作为主要成分的晕动病药物制剂产业,2004年的销售额就达到了15亿美元^[2]。目前,东莨菪碱的供应仍然主要是通过从茄科植物少数属的物种中提取,如颠茄属 (Atropa)、曼陀罗属 (Datura)、天仙子属 (Hyoscyamus) 和山莨菪属 (Anisodus) 等。但在大多数TAs资源植物中,东莨菪碱含量都远低于莨菪碱,不能满足市场需求。因此,利用代谢工程技术提高资源植物中东莨菪碱含量是东莨菪碱相关产业共同追求的目标。

在植物体中,东莨菪碱由双功能酶莨菪碱6β-羟化酶 (hyoscyamine 6-beta-hydroxylase,H6H,EC 1.14. 11.11) 直接催化生成。H6H属于依赖2-酮戊二酸/铁离子的双加氧酶家族,它催化莨菪碱的羟化和羟化产物山莨菪碱 (anisodamine) 的环化两步连续反应,最终生成东莨菪碱 (图 1),是公认的东莨菪碱生物合成的最后一个限速酶^[3]。在多种TAs资源植物中超表达H6H基因无一例外的都提高了东莨菪碱的产量,包括颠茄 (A. belladonna)^{[4, 5]}、毛曼陀罗 (D. innoxia)^[6]和黑莨菪 (H. muticus)^[7]等。目前,H6H基因只在茄科6个属 (Atropa、Hyoscyamus、Anisodus、Datura、Brugmansia和Scopolia) 的10个物种中得到了克隆,且只有4个H6Hs酶蛋白进行了功能验证,其中A. belladonna^[8]和B. candida^[9]的H6H酶活性偏低,不适于作为代谢工程的候选基因,这与该两个物种中东莨菪碱和莨菪碱的含量比值偏低相吻合。因此,从相对高东莨菪碱含量的TAs资源植物中克隆高活性的H6H酶蛋白编码基因是TAs代谢工程急需解决的一个关键问题。

Figure 1

Figure 1 Biosynthesis pathway of tropane alkaloids in solanaceous species. Two-step epoxidation reaction of hyoscyamine to scopolamine catalyzed by bifunctional hyoscyamine 6β-hydroxylase are located in the last two steps

木本曼陀罗Datura arborea是Datura属4个物种中唯一的木本TAs资源植物,也是目前除B. candida外研究的第2个木本TAs资源植物。早在1983彭广芳等^[10]就对D. arborea花中的TAs进行了薄层色谱分析,发现其中东莨菪碱含量高达干重的0.41%,且几乎无莨菪碱。本实验室前期也对D. arborea各组织部位的TAs进行了详尽的HPLC分析,表明D. arborea是一种东莨菪碱优势物种。本研究对木本曼陀罗的H6H基因进行了克隆、生物信息学分析和组织表达、诱导表达分析,比较了常见TAs资源植物发根和根中东莨菪碱和莨菪碱的含量和比值,为进一步研究DaH6H的酶活力及在分子水平上阐明木本曼陀罗中TAs的生物合成奠定了基础,同时也为TAs代谢工程候选基因的开发提供了新成员。

供试木本曼陀罗为西南大学校园保护植物,由西南大学生命科学学院邓洪平教授鉴定,繁育并保存于“重庆市甘薯工程技术研究中心”。采集的植物材料用清水冲洗5～8次,用吸水纸轻轻吸去水分后,立即置于液氮速冻,−80 ℃保存备用。

总RNA提取试剂盒为RNAsimple Total RNA Kit (TIANGEN); RNA反转录及3' RACE试剂盒为RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa); 5' RACE试剂盒为BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit,BD Advantage^TM 2 PCR Kit (CLONTECH); 高保真Taq DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNA Polimerse (TaKaRa); 质粒提取及胶回收试剂盒为BioSpin Gel Extraction Kit、BioSpin plasmid DNA Extraction Kit (BioFlux); T载体、连接试剂盒、荧光定量相关试剂分别为pMD19-T Vector、DNA Ligation 2.0、PrimeScipt^TM RT-PCR K it和SYBR^® Premix Ex Taq™ II (Perfect Real Time) (TaKaRa); DH5α感受态细胞为本实验室保存。本研究所用引物及测序服务由上海英骏生物技术有限公司提供。其他试剂均为分析纯国产试剂。

取适量木本曼陀罗样品在液氮中研磨,按照RNAsimple Total RNA Kit说明书提取总RNA,用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,HITACHI U-3010紫外可见分光光度计检测RNA纯度和浓度。严格按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa) 试剂盒说明书反转录获 得第一链互补链DNA (cDNA) 用于核心片段PCR 扩增和3' RACE,按照BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit和BD Advantage^TM 2 PCR Kit (CLONTECH) 试剂盒说明书反转录获得第一链互补链DNA (cDNA) 用于5' RACE。

比对NCBI中A. belladonna、H. niger、A. tanguticus、D. metel四个物种的同源H6H基因cDNA全长序列,在保守区设计兼并引物F-DaH6H和R-DaH6H (本研究所有引物序列及退火温度见表 1),用上述 cDNA为模板,高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polimerse扩增核心片段,PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后,切胶回收与pMD19-T vector连接,转化DH5α感受态细胞,菌落经PCR检测为阳性后,送上海英骏生物技术有限公司测序。根据该核心序列设计3' RACE巢式引物 (F-DaH6H3-1和F-DaH6H3-2) 和5' RACE巢式引物 (R-DaH6H5-1和R-DaH6H5-2),以相应的cDNA为模板进行巢式PCR,同上方法回收并测序。将这三段序列在Vector NTI 8.0软件中进行重叠群分析,根据拼接得到的电子全长序列设计一对全长引物F-full-DaH6H和R-full-DaH6H,以cDNA为模板进行高保真PCR验证,获得DaH6H基因全长cDNA序列。同样用这对引物,以CTAB法提取的木本曼陀罗根DNA为模板,进行长距离PCR,同上方法回收后,连接T载体测序,获得DaH6H基因全长gDNA序列。

Table 1

Table 1 Primers designed for gene cloning and real-time PCR detection Primer name Primer sequence (5'−3') Annealing temperatur/℃ F-DaH6H ATGGCTACTYTTGTSTCVA 52 R-DaH6H AAGGTTACAAATACAAGTAGAYCA F-DaH6H3-1 CTTTGCTTCAACAAGACTTG 54 F-DaH6H3-2 GGATTGCTGTTGAACCTATC R-DaH6H5-1 CAATAAGAAGGTGATCTTGTTGGAG 62 R-DaH6H5-2 TCAGCCCTTTTCTCTAATGGTG F-full-DaH6H ACACTACCAAATCTACACATC 52 R-full-DaH6H TCAACATGCCATAATAATACTC F-qDaH6H TTCCACTTGAACAGAAAGCAAAGC 56.4 R-qDaH6H CCTCATGGTCAATTTCCTCACTTCC F-qPGK TCGCTCTTGGAGAAGGTTGAC 59.5 R-qPGK CTTGTCCGCAATCACTACATCAG F-q18S CAGATACCGTCCTAGTCTCAAC 57 R-q18S CAGCCTTGCGACCATACTC F-DaH6H-pro CCGGAATTCATGGCTACTTTTGTCTCAAATTGG 55 R-DaH6H-pro CCGGTCGACTCCCTTATACAAAGCAATACC

Table 1 Primers designed for gene cloning and real-time PCR detection

全长cDNA序列在InforMax软件包的Vector NTI Suite 8.0软件中进行 分析和ORF查找,推导假定的氨基酸序列。DaH6H编码蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam进行分析。在CCD数据库和InterPro中分析保守结构域。用TMHMM 2.0

进行跨膜域分析。SignalP 4.1 Server进行信号肽分析。PSORT Prediction和SoftBerry提供的在线工具ProtComp 9.0分析蛋白的亚细胞定位。在PBIL网站进行二级结构预测。采用SWISS-MODEL进行蛋白质三维同源比对建模。蛋白质三级结构编辑及比对分析在PyMOL软件中完成。应用BLAST 程序检索相似蛋白。用Clustal W对氨基酸序列进行多重比对,并用MEGA NJ法 (Bootstrap 1000) 构建系统树。

同上方法提取木本曼陀罗的主根、须根、老茎、嫩茎、老叶和嫩叶6个部位的总RNA,使用TaKaRa公司的PrimeScript^® RT reagent Kit (Perfect Real Time) 试剂盒将各组织的RNA进行反转录,得到cDNA第一链作为qPCR模板。使用BIO-RAD IQ^TM5 Multicolor Real-Time PCR仪,参照SYBR® Premix Ex Taq™ II (Perfect Real Time) 试剂盒说明书进行qPCR反应。反应条件及程序均按照相关试剂盒说明书进行。以PGK、18S双基因作为内参,根据Pfaffl Method方法计算各基因的相对表达量。

为了检测茉莉酸甲酯 (MeJA) 对DaH6H诱导表达情况,按浸泡法将木本曼陀罗叶片浸于100 μmol·L⁻¹ MeJA水溶液中,分别在诱导0、1、3、6、9、12和24 h后取材,同时用等量溶剂EtOH溶液处理作为对照,按上述方法应用qPCR技术检测DaH6H基因的表达量,引物序列见表 1。

设计一对全长引物F-DaH6H-pro和R-DaH6H-pro (表 1),分别在两条引物5' 端引入EcoR I和Sal I的酶切位点。用该引物扩增DaH6H的编码框序列,通过引入的酶切位点亚克隆入蛋白表达载体pET28a,将该重组质粒导入大肠杆菌Rosseta (DE3) 中获得工程菌用于DaH6H重组蛋白的诱导表达。工程菌二活至OD₆₀₀ = 0.6～0.8时加入异丙基-β-D-硫代吡喃 半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度0.8 mmol·L⁻¹,25 ℃、110 r·min⁻¹诱导4 h,每1 h取1 mL菌液用于监测诱导表达的时间梯度。4 h后菌液4 ℃、5 000 r·min⁻¹离心6 min收集菌体,重悬于5 mL PBS缓冲液 (pH 7.4) 中,超声破碎后10 000 r·min⁻¹离心10 min,取沉淀和上清,连同前面时间梯度样品一起进行SDS-PAGE分析。

木本曼陀罗根组织烘干研磨成粉后参照Qiang等^[11]发表的方法提取托品烷生物碱用于HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱含量,标准品均购自Sigma公司。HPLC检测使用岛津LC-60A高效液相色谱仪 (泵: LC-6AD、柱温箱: CTO-10AS vp、控制器: SPD-20A),色谱柱为Phenomenex Gemini 5 μ C18 110A液相色谱柱 (250 mm × 4.6 mm),流动 相为甲醇−0.05 mol·L⁻¹ pH 4.6醋酸胺缓冲液 (流 动相体系包含0.002 5 mol·L⁻¹ SDS) (58∶42),流速 1 mL·min⁻¹,柱温箱40 ℃,检测波长226 nm,进样量20 μL。

以木本 曼陀罗植株的根、茎、叶混合材料总RNA逆转录获得的cDNA为模板,利用兼并引物RT-PCR扩增得到一条1 252 bp的序列,用RACE技术补齐3' 端和5' 端,分别获得长度为599 bp的3' 端片段和126 bp的5' 端片段,测序后将这3段序列在Vector NTI 8.0软件中进行重叠群分析,拼接得到1 375 bp的电子全长序列,经高保真扩增测序验证后,在Vector NTI 8.0软件中分析该序列含有一个长为1 041 bp的开放读码框,预测编码347个氨基酸,另外该序列还包含一段长为49 bp的5' UTR和282 bp的3' UTR。将该基因命名为DaH6H,GenBank登陆号为KR006981,为了更深入地分析比较DaH6H,按相同的方法克隆了该属模式种曼陀罗 (D. stramonium) 的DsH6H基因,GenBank登陆号为KR006982。

用表 1中列出的全长DaH6H引物 (F-full-DaH6H和R-full-DaH6H),以D. arborea基因组DNA为模板进行长距离PCR,获得了全长为2 102 bp的DaH6H基因gDNA序列,提交NCBI后GenBank登陆号为KR006983。为了用于比较,按同样的方法获得了D. stramonium的全长为2 369 bp的DsH6H基因gDNA序列,GenBank登陆号为KR006984。将这两条H6H gDNA序列和已报道的A. belladonna、H. niger的H6H gDNA序列进行比对 (基因登陆号分别为ABO17153和D26583),分析其外显子和内含子组织结构差异,如图 2所示。尽管在编码区域序列长度存在一定差异,但这4条H6H基因几乎具有相同的外显子−内含子组织方式,都由4个外显子和3个内含子组成,外显子大小基本一致,内含子长度差异较大。根据最后1个外显子的长度,D. arborea和D. stramonium的H6H在结构上更相似。

Figure 2

Figure 2 Comparison of the organization structure of exon and intron of DaH6H gDNA to other H6H gDNAs

DaH6H蛋白由347个氨基酸编码,预测分子质量为39.129 6 kD,理论等电点为pI: 4.83。

PBIL网站预测DaH6H编码蛋白包含32.85% 的α-螺旋(alpha helix)、8.93% 的β-折叠(beta turn)、21.04% 的延伸链 (extended strand) 和37.18% 的无规则卷曲 (random coil)。

结构域预测发现DaH6H编码蛋白含有两个保守结构域,分别是35～149位氨基酸残基的非血红素双加氧酶N端结构域 (non-haem dioxygenase N-terminal domain,IPR026992) 和193～293位氨基酸残基的依赖酮戊二酸/铁离子的双加氧酶特异识别区域 (oxoglutarate/iron-dependent dioxygenase,IPR005123)。

析 BLASTp分析DaH6H编码蛋白与D. stramonium的H6H序列一致性最高,达到90.5%,与D. metel、A. belladonna和A. baetica的H6H (AAQ04302、AEM91979和ABR15749) 序列一致性为90%,其次为A. acutangulus (89%,ABM74185)、A. tanguticus (88%,AAQ75700)、H. niger (87%,ABG89397)、H. senecionis (85%,AFP99876)。DaH6H与其他物种的H6Hs一样,都具备1个2-α-酮戊二酸结合基序和两个铁离子结合基序 (图 3),同时,结合铁离子的保守基序“His1-X-Asp/Glu-Xn-His2”所对应的3个氨基酸残基(His217、Asp219、His274) 和稳定2-oxoglutarate的两个氨基酸残基 (Arg284、Ser286) 均非常保守。

Figure 3

Figure 3 Multi-alignment of amino acid sequences of H6Hs from other plants. The iron-binding motifs and 2-oxoglutarate co-substrate binding motif are indicated by black boxes. Five strictly conserved amino acid residues involving metal and 2-oxoglutarate binding are shown in yellow. The different numbers in red represent various combinations of amino acid residues as follows,1: Asp or Asn; 2: Ile or Met; 3: Ser or Thr

、跨膜区和亚细胞定位预测分析 SignalP 4.1 Server预测DaH6H不具有信号肽,TMHMM 2.0预测DaH6H没有跨膜区,ProtComp 9.0预测该蛋白在胞质中的综合定位系数最高 (9.93),表明DaH6H可能是胞质蛋白。

2.5 DaH6H编码蛋白三维建模

在SWISS-MODEL Workspace在线分析软件中对DaH6H编码蛋白进行三维结构同源建模,结果见图 4。经同源结构搜索比对,DaH6H编码蛋白与拟南芥花色素合成酶 (A. thaliana anthocyanidin synthase) (PDB number: 2brt) 能够自动匹配建模,而拟南芥花色素合成酶也属于依赖酮戊二酸/铁离子的双加氧酶,DaH6H与模板具备相似的保守铁离子和2-酮戊二酸结合结构域。

Figure 4

Figure 4 Three-dimensional structure of deduced DaH6H (A) and template (B,PDB number: 2brt),Fe iron and 2-oxoglutarate are also shown out

从NCBI的非冗余蛋白数据库中选取了7条TAs资源植物的H6Hs序 列和5条非TAs资源物种的dioxygenase序列,7条 H6Hs序列包括H. senecionis H6H、H. niger H6H、A. tanguticus H6H、A. acutangulus H6H、A. baetica H6H、A. belladonna H6H和D. metel H6H (基因登陆号见2.3),5条dioxygenase序列包括A. thaliana putative flavanone 3-beta-hydoxylase (Q9ZSA7)、R. communis putative gibberllin 20 oxodase (XP_002519155)、P. trichocarpa 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase(XP_002313083)、A. thaliana anthocyanidin synthase (AEI99590) 和C. taiwanensis LMG 19424 flavanone 3-dioxygenase (YP_002007601)。将这些序列连同DaH6H和DsH6H序列在Clustal W软件中比对后利用MEGA5.0软件中的neighbor-joining方法构建系统进化树 (图 5)。这些序列聚类为两个群: 能够合成东莨菪碱的Group Ⅰ和不能合成东莨菪碱的Group Ⅱ,同属物种的H6H都因为较近的亲缘关系聚在一个小分支,奇怪的是DaH6H并未完全和DsH6H、DmH6H聚在一起,表明木本和草本物种的H6H仍存在一定的远源关系。

Figure 5

Figure 5 Phylogenetic tree analysis of D. arborea H6H and its counterparts from TAs-producing species and other dioxygenases from non-TAs-producing species

利用实时荧光定量PCR技术 (qPCR),采用双基因作为内参,对DaH6H基因进行组织表达谱分析: 在转录水平上,DaH6H在老叶中大量表达,其次在须根和嫩叶中有少量表达,嫩茎和老茎中表达量微弱,而在主根中几乎检测不到表达 (图 6)。

Figure 6

Figure 6 Tissue-expression analysis of DaH6H using real-time PCR

用100 μmol·L⁻¹ MeJA处理木本曼陀罗叶片,qPCR检测DaH6H基因的诱导表达,如图 7,在转录水平上,DaH6H受MeJA的诱导表达量逐渐降低,在9 h达到最低,然后开始恢复上升。所有时间点DaH6H的表达量不仅低于初始0 h的表达水平,并且显著低于溶剂对照乙醇处理的水平。

Figure 7

Figure 7 Expression analysis of DaH6H. MeJA: Methyl jasmonate

以pET28a为表达载体,在大肠杆菌Rosseta (DE3) 中进行DaH6H重组蛋白的异源诱导表达,结果见图 8。经0.8 mmol·L⁻¹ IPTG的低温 (25 ℃) 低转速 (110 r·min⁻¹) 诱导,大小约为39 kD的DaH6H重组蛋白随着时间的延长表达量逐渐提高。在诱导4 h后蛋白表达量最高,能见显著增粗的条带,且重组蛋白主要存在于沉淀中,表明以包涵体的形式存在。

Figure 8

Figure 8 SDS-PAGE of expression of recombinant DaH6H induced by isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)

Table 2

Table 2 Comparison of the ratio between scopolamine and hyoscyamine distributed in roots and hairy roots of different TAs-producing species. If not especially marked out,the unit is mg·g−1 dry weight. Root denotes the whole root including main root and fibrous root Species Tissue Hyoscymine (H) Scopolamine (S) S/H Reference B. candida Hairy root 6.00 ± 2.00 0.50 ± 0.30 0.083 [12] H. senecionis Root 1.72 ± 0.89 0.13 ± 0.09 0.076 [13] H. muticus Root 3.11 ± 1.40 0.04 ± 0.01 0.013 [13] Hairy root 143 mg·L−1 0.21 mg·L−1 0.001 [14] H. niger Root 0.77 ± 0.10 μg·mL−1 1.69 ± 0.34 μg·mL−1 2.195 [15] Hairy root 2.24 ± 0.69 μg·mL−1 3.03 ± 1.12 μg·mL−1 1.353 [15] A. tanguticus Hairy root “Concentration of scopolamine was much higher than that of hyoscyamine in hairy roots after 4 weeks cultivation.” − [16] A. belladonna Root 1.60 ± 0.49 0.198 ± 0.008 0.124 [11] Hairy root ～2.89 ～0.3 0.104 [17] A. baetica Main root 10.0 0.6 0.060 [18] Hairy root 4.934 ± 0.786 2.197 ± 0.553 0.445 [19] D. metel Root 0.28 ± 0.001 0.51 ± 0.08 1.821 [20] Hairy root 1.39 ± 0.004 0.069 ± 0.001 0.050 [21] D. stramonium Root 0.121 ± 0.015 0.014 ± 0.004 0.116 [22] Hairy root 1.146 ± 0.001 0.368 ± 0.001 0.321 [23] D. arborea Root 0.60 ± 0.019 0.76 ± 0.004 1.267 This study Regenerated plants from hairy root 0.085 0.22 2.588 [24]

Table 2 Comparison of the ratio between scopolamine and hyoscyamine distributed in roots and hairy roots of different TAs-producing species. If not especially marked out,the unit is mg·g−1 dry weight. Root denotes the whole root including main root and fibrous root

H6H基因是催化东莨菪碱生物合成的限速酶 (rate-limiting enzyme) 基因^[3],其表达量和东莨菪碱含量表现正相关性^[25]。因此,H6H基因一直作为TAs代谢工程的首要候选基因和目标改造基因,在TAs资源植物中超表达H6H基因无一例外的都提高了 东莨菪碱的含量。在转莨菪H6H基因的毛曼陀罗 (Datura innoxia)^[6]和澳洲毒茄 (Duboisia hybrid)^[26] 中,东莨菪碱含量比对照提高超过3倍,在印度颠茄 (A. baetica) 和埃及莨菪 (H. muticus) 发根中超量表达莨菪H6H,最优的发根克隆中东莨菪碱分别是对照发根的9倍和100倍,分别达到5.6 mg·g⁻¹ DW和17 mg·L⁻¹,其含量提高倍数都与HnH6H基因表达量成正比^[19],而在转莨菪H6H基因的颠茄植株的叶和茎中,莨菪碱几乎全部都转化成了东莨菪碱^[4]。从上可以看出,尽管目前已有10个物种的H6H基因得到了克隆,但是除了莨菪 (H. niger) 是研究较透彻的东莨菪碱占优势的物种,HnH6H被大量用于代谢工程研究外,大多数物种均是莨菪碱占优势的资源植物,它们的H6H基因很少被用于开发。因此,从高东莨菪碱含量的资源植物中克隆高活性的H6H基因显的尤为重要。

木本曼陀罗是少有的几种木本TAs资源物种,其在分类学上的地位,国际上还存在着是归属于Datura属还是Brugmansia属的争议。本实验室前期研究发现该物种在所测的各个部位中,东莨菪碱均是优势生物碱,在老茎、嫩叶和须根中莨菪碱只是痕量存在或几乎没有,这在TAs资源植物中是相当罕见的,具有很强的开发价值。本文据此克隆了木本曼陀罗中 合成东莨菪碱的关键酶基因DaH6H的cDNA全长和基因组全长,同时也克隆了同属另一物种曼陀罗的DsH6H基因cDNA全长和基因组全长用于对比分析。氨基酸序列水平上DaH6H和同属植物D. stramonium 的H6H序列一致性最高,达到90.5%,其次是同属另一植物洋金花D. metel和同科的A. belladonna和A. baetica的H6Hs,为90%。进化关系上,DaH6H和DsH6H明显区别于其他双加氧酶家族成员,和同科的TAs资源植物H6Hs共同归于H6H亚类,尽管进化树上DaH6H和DsH6H、DmH6H的亲缘关系最近,但却并没有完全和DsH6H、DmH6H归为一支,表明木本曼陀罗和草本的曼陀罗及洋金花间还是存在相对的远源关系。基因组结构上,DaH6H和DsH6H、AbH6H、HnH6H具有相同的内含子−外显子组织结构,除了内含子长度存在差异外,4个外显子大小很相似,DaH6H尤其和DsH6H更相似,表明茄科TAs资源植物中H6H基因无论在序列还是组织结构上均十分保守,同时也更加印证了木本曼陀罗应该和Datura属的关系更近。

托品烷类生物碱一般认为在植物根中合成,然后转运到地上部分储存。在几种经常研究的草本资 源植物中,相关的合成途径基因的表达如PMT、TRI、CYP80F1和H6H均只能在根中检测到,在H. niger^[27]、A. Belladonna^[28]和D. metal^[20]中,H6H蛋白已经明确定位在根中柱鞘细胞中表达,根部是东莨菪碱的合成产所。近年来,在两种多年生的高海拔草本TAs资源植物A. Acutangulus^[29]和H. Senecionis^[13]中发现了例外,H6H不仅主要在根中表达,在茎叶中也有少量表达,颠覆了根部是东莨菪碱唯一合成场所的认识。本文中DaH6H除了主根外,在所有检测的部位中都有表达,且老叶中表达量是须根的5倍,暗示在这一物种中,叶才是东莨菪碱的主要合成部位,当然,这还要依赖于对其他合成途径基因的组织表达分析才能定论。MeJA是常用的植物激素,能够促进多种药用植物包括H. niger^[30]、D. Stramonium^[31]和A. Baetica^[32]发根中TAs的合成,相应的合成途径基因如PMT、TRI和H6H表达量都能得到提高。奇怪的是,本文DaH6H基因的表达量却受到MeJA的抑制。类似MeJA下调代谢途径基因的情况仅有少量的报道,苜蓿cycloartenol synthase基因受MeJA处理表达量下降,但是不影响甾醇的含量^[33]。MeJA处理颠茄发根,莨菪碱含量有稍微的降低,其PMT基因表达也不受MeJA诱导^[28]。DaH6H基因不同的诱导表达模式表明木本曼陀罗中TAs合成的调控机制和其他草本植物存在较大差异。

DaH6H基因来源于高东莨菪碱的木本资源植物,相对于其他高莨菪碱的草本植物中的同源基因,可能具有不同的调控方式和酶活力表现。为了对该酶进行酶活力研究,本研究对DaH6H基因进行了大肠杆菌异源重组表达。初步实验表明,加入诱导剂后,低温低转速能够诱导39 kD的目的重组蛋白表达,尽管表达量比较低,但是可以最大限度避免蛋白聚集,为获得可溶的蛋白创造条件。DaH6H重组蛋白的成功表达将为后续研究其酶活力的强弱奠定基础,这也是作者正在进行的研究。

东莨菪碱和莨菪碱分别是H6H的最终产物和直接底物,所以植物体中东莨菪碱和莨菪碱含量的绝对比值大致可以反映该物种H6H将莨菪碱转化为东莨菪碱的能力 (H6H的酶活力)。由于托品烷生物碱在植物体各组织器官中存在转运和分配,而通常文献报道的只是药用植物各组织的TAs含量,所以无法真实反映H6H的酶活力,而发根是离体培养的植物器官,既是TAs合成的场所也是存储部位,不存在转运和分配,所以发根中的东莨菪碱和莨菪碱的含量比值 (S/H) 较好反映了H6H的酶活力。在目前报道的已克隆H6H基因的TAs资源植物中,只有H. niger和A. tanguticus的S/H值大于1,表明是东莨菪碱优势 植物,而A. belladonna和B. candida发根中S/H值 远小于1,表明它们属于常见的莨菪碱优势植物,这与报道的H6H酶活力参数相吻合: A. belladonna^[8]和B. candida^[9]的H6H对莨菪碱的最大反应速度分别为1.17和2.60 nKat·mg⁻¹,而H. niger^[8]和A. tanguticus^[16]的H6H对莨菪碱的最大反应速度分别为3.28和11.1 nKat·mg⁻¹; A. belladonna^[8]和B. candida^[9]的H6H对 山莨菪碱的最大反应速度分别为3.36×10⁻³和0.24 nKat·mg⁻¹; 而A. tanguticus^[16]的H6H对山莨菪碱的最大反应速度为4.2 nKat·mg⁻¹。木本曼陀罗无论在 根还是发根再生植株中S/H值均大于1,高的东莨菪碱含量表明DaH6H有可能是一个高活性功能蛋白,DaH6H基因的克隆和功能分析将为深入研究不同植物中TAs生物合成的分子调控机制和开展东莨菪碱代谢工程奠定基础和提供新的候选基因,具有重要的意义。