卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。由于其发病的早期没有相应的临床症状,同时位于盆腔深部,诊断困难,死亡率高,因此迫切需要一种能早期、特异性诊断治疗卵巢癌的新方法。利用磁共振成像 (magnetic resonance imaging,MRI) 能够早期、无创、可视化监测肿瘤的分子变异,可将诊断模式转变为基因水平的特异性诊断,为肿瘤的早期诊断开辟了新的途径^[1]。

RNA干扰解决了在哺乳细胞内导入双链RNA 时引发的干扰素效应,是基因水平治疗肿瘤的新方法^{[2, 3, 4]}。本课题组结合分子影像学与RNA干扰技术 的各自优势,合成了针对卵巢癌中高表达的表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR) 的分子探针 (以下简称SPIO-shRNA探针,SPIO即superparamagnetic iron oxide,超顺磁性氧化铁),并在体外获得了该探针MR分子成像与RNA干扰治疗卵巢癌SKOV3细胞株的满意效果^{[5, 6]}。考虑到其在体外与活体之间存在着一些差异,为进一步观察探针活体MR成像与RNA干扰效果,明确探针在活体内药代动力学与主要脏器的分布,显得十分必要。

材料及仪器 SPIO-shRNA分子探针由本课题组合成^[5] (国家发明专利申请号: 201410064217.9)。新西兰大白兔18只 [体重 (2.5 ± 0.4) kg,雌雄各半],昆明 (KM) 小鼠24只 [体重 (25 ± 1.6) g,雌雄兼用],重庆医科大学实验动物中心; 戊巴比妥钠 (德国Merck公司); 亚铁氰化钾 (上海生物工程有限公司),核固红 (武汉博士德公司); Z-5000型原子吸收光谱仪 (日本HITACHI公司),3.0 T超导型MR成像仪及腕关节线圈 (美国GE公司)。

SPIO-shRNA探针的剂量选择 参考文献^{[2, 7]}报道及经过反复的预实验,本实验设置3组探针,含铁浓度由低到高分别为2.4、4.8和9.6 mg·kg^-1。

探针药代动力学实验 18只新西兰大白兔随机分为3 组,每组6只。分别在兔耳缘注射上述不同剂量的分子探针,于注射前30 min (空白对照) 及注射后1 min、3 min、5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h和12 h从对侧耳缘静脉采血0. 5 mL,置于肝素抗凝离心管,3 000 r·min^-1离心10 min,吸取上层血浆0.2 mL,原子吸收光谱法测定Fe含量,计算血浆探针Fe含量 = 注射后各时间点Fe含量 - 空白对照Fe含量。

探针在小鼠体内主要脏器分布实验 24只KM小鼠随机分为1个对照组与3个实验组,各6只。对照组每只小鼠尾静脉注射生理盐水200 μL; 实验组各组每只小鼠分别在尾静脉注射剂量为2.4、4.8和9.6 mg·kg^-1的分子探针。于注射后24 h行MR扫描(由于探针要发挥肿瘤干扰治疗作用需要一定时间,具体扫描时间的确定另文报道),具体扫描方法为: 小鼠腹腔注射1% 戊巴比妥钠 (剂量为60 mg·kg^-1体重) 麻醉后,将其仰卧位固定于自制泡沫板,置于腕关节表面线圈,使用3.0 T超导型MR扫描仪行冠状位扫描。参考相关文献^[8]及预实验,扫描参数: T2*WI梯度回波序列: TR/TE: 300 ms/MinFull,FOV 12 cm,激励次数3,层厚2 mm,矩阵320×224,翻转角为20°。将获得的MRI图像传至GE ADW 4.6工作站,选择感兴趣区 (region of interest,ROI) 大小为30 mm²,分别测量肝、脾、肾、脑及肌肉 (左大腿) 信号强度,重复测量3次并取平均值。

病理学检查 MRI扫描结束后,腹腔注射过量1% 戊巴比妥钠 (160 mg·kg^-1体重),处死小鼠,取上述监测脏器固定于10% 中性缓冲福尔马林液。48 h后制作石蜡切片行HE与普鲁士蓝染色 (普鲁士蓝染色步骤为: 常规脱蜡,2% 亚铁氰化钾与2% 稀盐酸等体积混合,染色30 min后,核固红复染10 min,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片),光学显微镜下观察。

统计学处理 用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析,计量资料用均数 ± 标准差 (x± s) 表示; 药-时变化值使用DAS 2.0软件分析; 完全随机设计多组间均数比较采用单因素方差分析,组间均数两两比较采用多重比较方法LSD-t检验,确定P < 0.05有统计学差异 。

1 探针在兔体内的药代动力学

探针Fe质量浓度在0～10.00 mg·L^-1内具有良好的线性关系 (y = 0.030 3ρ - 0.001 5,r = 0.999 5)。Fe质量浓度分别为1.00、5.00和10.00 mg·L^-1的血浆样品经处理后,测得的回收率分别为98.79%、96.27% 和99.53%; 日内精密度和日间精密度的RSD值分别为3.12%、4.32%、1.89% 和5.56%、2.39%、4.20%。3种剂量的SPIO-shRNA探针在大白兔体内的平均血药浓度-时间曲线见图 1。

Figure 1

Figure 1 Mean plasma concentration-time curves of SPIO- shRNA dual functional molecular probe after intravenous administration of SPIO-shRNA to rabbits. n = 6,x± s

经DAS软件分析,3种剂量分子探针在大白兔体内的药代学符合二室模型,结果见表 1。

(Table 1)

Table 1 The pharmacokinetic parameters of SPIO-shRNA dual functional molecular probes after intravenous administration of SPIO-shRNA to rabbits. n = 6,x± s Parameter Fe / mg·kg-1 2.4 4.8 9.6 t1/2α /h 0.039 ± 0.005 0.043 ± 0.01 0.043 ± 0.018 t1/2β /h 3.076 ± 0.085 3.824 ± 0.12 3.566 ± 0.287 V1 /L·kg-1 0.062 ± 0.001 0.062 ± 0.001 0.056 ± 0.004 CL /L·h-1·kg-1 0.016 ± 0.001 0.014 ± 0 0.015 ± 0.001 AUC0-t /mg·h·L-1 138.321 ± 3.392 306.322 ± 4.791 578.194 ± 22.402 AUC0-∞ /mg·h·L-1 148.648 ± 4.941 343.973 ± 6.289 641.133 ± 36.25 K10 /h-1 0.261 ± 0.008 0.226 ± 0.005 0.272 ± 0.033 K12 /h-1 5.725 ± 5.664 6.792 ± 6.299 9.27 ± 8.937 K21 /h-1 14.84 ± 1.795 13.341 ± 3.53 12.619 ± 4.359

Table 1 The pharmacokinetic parameters of SPIO-shRNA dual functional molecular probes after intravenous administration of SPIO-shRNA to rabbits. n = 6,x± s

与生理盐水对照组比较,通过尾静脉注射不同剂量探针后24 h行MRI扫描,结果显示探针主要分布于肝脏与脾脏,并且随着探针剂量的增加,肝脾信号强度梯度降低,差异均有统计学意义 (P < 0.001)。而各剂量探针组与对照组的脑、肾及肌肉组织的MRI信号无明显变化,其差异均无统计学意义 (P > 0.05)。见图 2及表 2。

图 2

Figure 2

Figure 2 MRI results at 24 h after intravenous administration of different doses of SPIO-shRNA dual functional molecular probe to mice. A: Control group; B: 2.4 mg·kg-1; C: 4.8 mg·kg-1; D: 9.6 mg·kg-1

HE检查结果显示各剂量探针组,肝、脾、肾、脑、肌肉组织细胞未见明显变性、坏死。普鲁士蓝染色结果显示探针主要位于肝、脾,且随探针剂量的增加,蓝染颗粒沉淀 (探针Fe阳性区域) 越多 (图 3)。而肾、脑、肌肉未见明显蓝染颗粒沉淀。

EGFR在卵巢癌中存在过度表达,其表达增加与生存率降低密切相关,已经成为卵巢癌一个重要的基因治疗靶点^{[9, 10]}。RNA干扰可特异地将细胞内同 源mRNA降解,沉默靶基因的表达,是研究基因治疗的重要技术手段^[11]。但基因治疗的成功很大程度上依 赖基因载体。病毒载体转染效率高,但安全性较低,应用受限^[12]; 左旋多聚赖氨酸 (poly-L-lysine,PLL) 是一个新兴的非病毒基因载体,具有较高的细胞转染率和较低的细胞毒性^[13]。SPIO被广泛应用于生物医学研究,其在活体中的应用聚焦在磁共振成像、靶向药物输送、基因治疗和传递基因到靶细胞和组织

表 2 (Table 2)

Table 2 The MRI signal intensity of main organ at 24 h after intravenous administration of SPIO-shRNA dual functional molecular probe to mice. n = 6,x± s. ***P < 0.001 vs control group; ###P < 0.001 vs other group Main organ Control group Fe/mg·kg-1 2.4 4.8 9.6 Liver 579.50 ± 24.81### 364.50 ± 13.78***### 218.17 ± 15.22***### 55.17 ± 11.51***### Spleen 565.83 ± 21.55### 412.17 ± 16.22***### 303.83 ± 17.38***### 125.67 ± 19.28***### Kidney 697.83 ± 30.92 683.33 ± 32.72 694.17 ± 27.39 673.67 ± 34.96 Brain 419.00 ± 39.42 401.17 ± 42.71 398.50 ± 41.28 384.67 ± 47.85 Muscle 723.50 ± 36.24 704.50 ± 37.00 732.33 ± 28.04 699.00 ± 23.84

Table 2 The MRI signal intensity of main organ at 24 h after intravenous administration of SPIO-shRNA dual functional molecular probe to mice. n = 6,x± s. ***P < 0.001 vs control group; ###P < 0.001 vs other group

图 3

Figure 3

Figure 3 The stained images of liver (A,B,C and D) and spleen (E,F,G and H) by Prussian blue staining at 24 h after intravenous administration of different doses of SPIO-shRNA dual functional molecular probe to mice. A,E: Control group; B,F: 2.4 mg·kg-1; C,G: 4.8 mg·kg-1; D,H: 9.6 mg·kg-1

等^[14],SPIO同时可以作为MRI阴性对比剂用于分子影像学研究。因此本课题组结合分子成像与基因治疗两种技术,以SPIO为MRI阴性对比剂,PLL作为基因载体,卵巢癌EGFR为基因靶点设计shRNA (short hairpin RNA),构建集诊断与治疗于一体的特异性SPIO-shRNA双功能分子探针,期望提高卵巢癌的诊治水平。

本实验血药浓度的检查方法回收率高,日内精密度及日间精密度的RSD低,方法可靠。低、中、高3种剂量分子探针的半衰期t_1/2β均超过3 h,半衰期长短适中,既有利于探针在体内发挥治疗与MR成像作用,又不至于在体内潴留过久产生不良反应。同 时,3种剂量分子探针兔体内的药代学符合二室模型,t_1/2β变化不大,曲线下面积AUC_0-t与AUC_0-∞随探针剂量的增加而增加,基本成正比关系,说明本探针的代谢符合一级消除动力学。

通过对小鼠尾静脉注射不同剂量SPIO-shRNA探针24 h后行MR扫描,获得T2*WI梯度回波序列图像,显示探针主要分布于正常小鼠的肝脏与脾脏,这与相关文献^{[15, 16]}研究一致。本研究发现在所设置的探针剂量范围内,随着剂量的增加,肝脾MRI信号强度逐渐降低,差异有统计学意义,说明探针剂量越大,肝脾聚集的SPIO-shRNA探针越多; 肝脾组织切片普鲁士蓝染色结果也显示随探针剂量的增加,蓝色颗粒 (探针Fe阳性区) 越多,说明探针量越多; MRI与普鲁士蓝染色结果相互印证。本实验中各剂量组与生理盐水对照组的MRI结果比较,小鼠肾、脑、肌肉信号强度无明显变化,相应脏器普鲁士蓝染色也未见明显的蓝染颗粒,提示探针在这些脏器组织基本没有分布。由于卵巢癌早期诊断困难,本研究中设置了2.4 mg·kg^-1剂量探针组 (约10 μg shRNA/小鼠),虽然未达到RNA干扰剂量 (约20 μg shRNA/小鼠)^{[3, 17]},

但MR扫描发现该剂量也可获得良好的探针活体成 像,有望用于卵巢癌的早期筛查诊断,同时可尽量减少探针用量,降低不良反应。而4.8与9.6 mg·kg^-1剂量探针组分别作为RNA干扰治疗的常用剂量与高剂量,活体成像效果更佳。组织切片普鲁士蓝染色结果发现: 2.4 mg·kg^-1探针剂量组的肝脾脏器中难以发现蓝染颗粒,4.8与9.6 mg·kg^-1探针剂量组也仅有少许蓝染颗粒。结合药代动力学结果: 3种剂量探针的表观分布容积V₁均 < 0.1,提示静脉注射后,探针主要位于血液循环系统,大部分逃避了单核吞噬细胞系统的吞噬。原因可能是由于体内单核吞噬细胞系统对探针的吞噬主要取决于探针中SPIO颗粒大小,颗粒越小越不易被吞噬^[18],而本探针中SPIO-PLL颗粒为纳米级,平均粒径为7.37 nm^[19],因此本探针绝大部分能逃避单核吞噬细胞系统的吞噬,对进一步的肿瘤靶向治疗十分有利。

通过本研究,了解到SPIO-shRNA探针在活体的药代学与主要脏器分布,证实了MR成像可用于检测探针在活体内的分布。这为进一步的肿瘤靶向治疗研究、探针用量的有效性与安全性提供了依据。