药学学报  2015, Vol. 50 Issue (9): 1174-1179   PDF    
聚(2-乙基-2-噁唑啉)-胆固醇氯甲酸酯修饰盐酸阿霉素脂质体的制备及评价
张迪, 李健莹, 汪晓婵, 岳宏新, 胡美娜, 于秀, 徐缓     
辽宁师范大学化学化工学院, 辽宁 大连 116029
摘要: 本文评价了两亲性pH敏感聚合物聚(2-乙基-2-噁唑啉)-胆固醇氯甲酸酯[poly(2-ethyl-2-oxazoline)-cholesteryl methyl carbonate, PEOZ-CHMC]的缓冲能力。采用硫酸铵梯度法制备盐酸阿霉素脂质体(doxorubicinhydrochloride liposomes, DOX-L),后插入法制备PEOZ-CHMC和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(polyethyleneglycol-distearoyl phosphatidyl ethanolamine, PEG-DSPE)修饰的盐酸阿霉素脂质体(PEOZ-DOX-L和PEG-DOX-L),对盐酸阿霉素脂质体的理化性质、体外释放、细胞抑制作用和细胞内定位情况进行评价。结果显示, PEOZ-CHMC对微酸环境有一定的缓冲能力。利用葡聚糖凝胶微柱离心法测定脂质体的包封率为(97.3±1.4)%,动态光散射法测定脂质体的粒径在120 nm左右,经PEG-DSPE和PEOZ-CHMC修饰后脂质体的包封率和粒径均无明显改变。Zeta电位分析仪结果显示3种脂质体表面电荷均为负值。通过透析实验考察制剂的体外释药行为,结果表明,在pH 7.4的释放介质中, PEOZ-DOX-L释放较为缓慢,而在pH 5.0时, PEOZ-DOX-L快速释药,显示出良好的pH敏感性。激光共聚焦实验表明核内体的微酸环境可以促进脂质体发生核内体逃逸,直接释放盐酸阿霉素进入细胞核,而DOX-L和PEG-DOX-L均无此作用。细胞抑制作用结果显示, PEOZ-DOX-L对细胞的抑制作用随pH降低而增强,但pH的降低对PEG-DOX-L和DOX-L的细胞抑制作用没有影响。因此PEOZ-CHMC构建的pH敏感脂质体能克服PEG链抑制脂质体的细胞摄取和妨碍pH敏感脂质体的核内体逃逸问题。
关键词: 盐酸阿霉素     聚(2-乙基-2-噁唑啉)-胆固醇氯甲酸酯     pH敏感     脂质体    
Preparation and evaluation of doxorubicin hydrochloride liposomes modified by poly(2-ethyl-2-oxazoline)-cholesteryl methyl carbonate
ZHANG Di, LI Jian-ying, WANG Xiao-chan, YUE Hong-xin, HU Mei-na, YU Xiu, XU Huan     
College of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China
Abstract: In this study, the buffering capacity of amphiphilic pH-sensitivity copolymer poly(2-ethyl-2-oxazoline)-cholesteryl methyl carbonate (PEOZ-CHMC) was evaluated. The ammonium sulfate gradient method was used to prepare doxorubicin hydrochloride (DOX·HCl)-loaded liposomes (DOX-L), and then the post-insertion method was used to prepare PEOZ-CHMC and polyethylene glycol-distearoyl phosphatidyl ethanolamine (PEG-DSPE) modified DOX·HCl-loaded liposomes (PEOZ-DOX-L and PEG-DOX-L). The physico-chemical properties, in vitro drugs release behavior, cellular toxicity and intracellular delivery of liposomes were evaluated, separately. The results showed that PEOZ-CHMC has a satisfactory buffering capacity. The sephadex G-50 column centrifugation method and dynamic light scattering were used to determine the encapsulation efficiency (EE) and particle size of liposomes. The EE and particle size of DOX-L were (97.3±1.4)% and 120 nm, respectively, and the addition of PEOZ-CHMC or PEG-DSPE had no influence on EE and particle size. The zeta potentials of three kinds of liposomes were negative. The release behavior of various DOX liposomes in vitro was investigated by dialysis method. In phosphate buffer solution (PBS) at pH 7.4, DOX·HCl was released from PEOZ-DOX-L in a sustained manner. While in PBS at pH 5.0, the release rate of DOX·HCl from PEOZ-DOX-L increased significantly, which suggested DOX·HCl was released from PEOZ-DOX-L in a pH-dependent manner. The intracellular delivery of liposomes was investigated by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The CLSM images indicated that PEOZ-DOX-L showed efficient intracellular trafficking including endosomal escape and release DOX·HCl into nucleus, as well as the DOX-L and PEG-DOX-L had no this effect. The cytotoxicity of liposomes against MCF-7 cells was detected by using MTT assay. The results showed that antiproliferative effects of PEOZ-DOX-L enhanced with pH value decreased, whereas DOX-L and PEG-DOX-L did not have any significant difference in inhibitions at different pH conditions. Therefore, the problems of the inhibition of cellular uptake of liposomes and the failed endosomal escape of pH-sensitive liposomes by PEG chain can be overcome by the pH-sensitive liposomes constructed by PEOZ-CHMC.
Key words: doxorubicin hydrochloride     poly(2-ethyl-2-oxazoline)-cholesteryl methyl carbonate     pH-sensitive     liposome    

盐酸阿霉素 (doxorubicin hydrochloride,DOX·HCl) 是目前临床上常用的蒽环类抗肿瘤药物,其属于周期非特异性药物,对任意生长周期的肿瘤细胞均有抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用[1]。主要用于治疗急慢性白血病、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌等恶性肿瘤[2]。目前上市的DOX·HCl注射剂对肿瘤细胞的杀伤作用缺乏特异性,在杀死癌细胞的同时,对正常细胞也能造成损伤,从而降低药效并产生严重的毒副作用, 尤其是心脏毒性。聚乙二醇修饰的阿霉素脂质体存在细胞摄取困难等问题,因此构建一种新型药物递送系统对化疗药物进行增效减毒至关重要。

聚(2-乙基-2-噁唑啉) [poly(2-ethyl-2-oxazoline),PEOZ]是一种高分子长链聚合物,具有良好的水溶性、柔顺性和生物相容性等优点,已通过美国食品药品管理局认证[3, 4]。PEOZ具有pH敏感性,能在肿瘤组织的微酸环境下促使脂质体去稳定化、快速释药,或在脂质体被细胞摄取后与核内体膜融合,释放药物进入胞浆。

本文以实验室自制的两亲性嵌段共聚物聚 (2-乙基-2-噁唑啉)-胆固醇氯甲酸酯 [poly(2-ethyl-2- oxazoline)-cholesteryl methyl carbonate,PEOZ-CHMC,图 1] 构建盐酸阿霉素脂质体,并对其理化性质、pH敏感性等方面进行系统考察。

材料与方法 试剂与药品

DOX·HCl (北京华奉联博科技有限公司); 大豆磷脂 (S75,上海太伟药业有限公司); 胆固醇,葡聚糖凝胶 (Sephadex G-50) (Biosharp,日本); DSPE-PEG2000 (上海艾韦特医药科技有限公司); PEOZ-CHMC (PEOZ相对分子质量为2 000,实验室自制); RPMI-1640培养基 (Gibco公司,美国); 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT,Amresco,美国]; 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、抗淬灭封片液 (江苏碧云天生物技术研究所)。

仪器

PHS-25型pH计、752N紫外可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司); F-7000荧光分光光度计 (日立公司,日本); Nicomp380粒度测定仪 (Particle Sizing Systems,美国); ECLIPSE-Ti激光共聚焦显微镜 (Nikon公司,日本); Multiskan FC荧光酶标仪 (Thermo Electron Co,美国); SC-05离心机 (安徽中科中佳科学仪器有限公司); 透析袋 (截留分子质量8 000~14 000) (Spectrum,美国)。

细胞株

人乳腺癌细胞 (MCF-7),购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

DOX·HCl脂质体的制备

采用薄膜分散法制备空白脂质体 精密称取S75、胆固醇 (摩尔比为3∶2) 置于茄形瓶中,以一定量的氯仿溶解,37 ℃条件下减压旋蒸30 min后置于真空干燥器中过夜,完全除去有机溶剂。加入123 mmol·L−1 (NH4)2SO4溶液水化薄膜,得到粗分散脂质体,探头超声 (200 W × 2 min ,400 W × 2 min,600 W × 4 min) 处理后依次通过0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜整粒,即得空白脂质体。

采用硫酸铵梯度法制备 以透析法除去空白脂质体外水相中(NH4)2SO4。精确移取该脂质体1 mL,加入1 mg·mL−1 DOX·HCl储备液 (药脂比为1∶10,w/w),混匀,常温下避光搅拌孵育3 h,制得DOX·HCl脂质体 (DOX-L)。

PEOZ-CHMCPEG-DSPE胶束的制备

称 取DSPE-PEG2000 24 mg或PEOZ-CHMC 21 mg,适量氯仿溶解,37 ℃条件下减压旋蒸30 min,得到聚合物−脂质薄膜,以磷酸盐缓冲溶液 (phosphate buffer solution,PBS) 水化,通过0.22 µm微孔滤膜整粒 ,得到聚合物−脂质胶束溶液。

聚合物修饰DOX·HCl脂质体的制备

将上述PEOZ-CHMC、PEG-DSPE胶束与DOX-L混合 (脂质与聚合物−脂质的比例为20∶1,mol/mol),37 ℃搅拌 2 h,分别得到PEOZ-CHMC修饰的DOX-L (PEOZ- DOX-L) 和PEG-DSPE修饰的DOX-L (PEG-DOX-L)。脂质体的制备过程见图 1

PEOZ-CHMC缓冲能力的测定

称取PEOZ- CHMC 12 mg溶解在3 mL 0.01 mol·L−1 NaCl溶液中(4 mg·mL−1),使用1 mol·L−1 NaOH溶液调节pH值到12.0。逐滴加入0.01 mol·L−1 HCl到稀溶液中,通过PHS-25型pH计监测pH值变化情况。

脂质体的表征

以Nicomp 380激光粒度测定仪测定脂质体的zeta电位、粒径及粒度分布。取适量脂质体样品,以注射用水稀释,放入样品池内,测定Gaussian粒径分析下的动态光散射图谱。

采用葡聚糖凝胶微柱离心法测定脂质体的包封率 (encapsulation efficiency,EE)。分别移取200 μL 新制备的DOX-L、PEG-DOX-L和PEOZ-DOX-L各两份,其中一份以异丙醇 (90%,含0.75 mol·L−1 HCl) 定容至5 mL,利用紫外−可见分光光度计于480 nm处测定其吸收度,计算浓度记为Cbefore; 另一份脂质体缓慢滴入制备好的葡聚糖凝胶柱,静置吸附5 min后,2 000×g离心3 min,重复离心3次,将离心后的 液体转移到5 mL量瓶中,以上述异丙醇溶液定容,480 nm处测定吸收度并计算浓度记为Cafter,按公式(1) 计算3组脂质体的包封率。

EE%=(Cafter/Cbefore)×100% (1)
体外释放实验

分别移取1.0 mL DOX-L、PEOZ- DOX-L和PEG-DOX-L装入预处理过的透析袋中,依次置于盛有100 mLPBS缓冲溶液(pH 7.4和pH 5.0) 烧杯内,于37 ℃条件下恒速搅拌,分别于第0.017、0.167、0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h吸取5.0 mL透析液,同时补入等量PBS缓冲溶液。于荧光分光 光度计 (Ex = 480 nm,Em = 596 nm) 测定荧光强度,并计算其累计释放率,绘制释放曲线。

激光共聚焦显微镜考察DOX·HCl脂质体的细胞内行为

将MCF-7细胞接种到放有细胞爬片的 24孔板中,培养过夜。待细胞60%~80% 汇合后,更换含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基。分别加入DOX-L、PEOZ-DOX和PEG-DOX-L (DOX·HCl的质量浓度为10 µg·mL−1),37 ℃孵育1和4 h后,弃去培养基,加入DAPI核染色15 min,以PBS清洗2~3次,载玻片滴入10 µL防淬灭液,将爬片倒扣在载玻片上,利用封片胶进行封片,置于激光共聚焦显微镜下观察细胞内脂质体的分布情况,并拍摄记录。

DOX·HCl脂质体细胞抑制实验

将对数生长 期的MCF-7细胞以3×104/孔接种于96孔板中,使用培养基孵育24 h,更换培养基 (调整pH分别为7.4和5.0),加入DOX-L、PEOZ-DOX-L和PEG-DOX-L (DOX·HCl终质量浓度分别为12.5、25、50、100和150 μg·mL−1)。37 ℃、5% CO2及饱和湿度环境下孵育24 h。每个孔板中添加10 μL无菌MTT (5 mg·mL−1),孵育4 h,弃去培养基,DMSO振荡溶解。于492 nm波长下以酶标仪测定溶解物的吸光度值(OD值)。按公式 (2) 计算细胞存活率,对脂质体的细胞抑制作用进行评价。

Figure 1 A schematic diagram showing the formation of polyethylene glycol-distearoyl phosphatidyl ethanolamine (PEG-DSPE) modifieddoxorubicinhydrochloride (DOX·HCl)-loaded liposomes (PEG-DOX-L) and poly(2-ethyl-2-oxazoline)-cholesteryl methyl carbonate (PEOZ-CHMC) modified DOX·HCl-loaded liposomes (PEOZ-DOX-L)
细胞存活率 (%) = (OD制剂组/OD空白对照组)×100% (2)

统计方法 采用SPSS统计学软件 (version 13.0) 进行多组间独立样本t检验 (ANOVA),以P < 0.05为数据间具有显著性差异,计量数据用均数 ± 标准差表示。

结果

1 PEOZ-CHMC缓冲能力的测定

大多数的纳米颗粒 (包括脂质体),主要通过能量依赖的内吞作用进入细胞,然后进入核内体/溶酶体[5],由于核内体/溶酶体的酸性环境和水解酶能降解内含物,因此核内体/溶酶体的降解成为纳米药物细胞内递送的主要屏障,该困境尤其影响基因和蛋白类药物的递送。近年来,研究人员已经发现大量的促进核内体逃逸的制剂和方法[6],其中pH敏感纳米药物递送系统的构建较为广泛[7]。本文通过酸碱滴定实验评估PEOZ-CHMC的pH缓冲能力,进而预测其修饰脂质体的核内体逃逸情况。在PEOZ-CHMC的混合溶液中 (4 mg·mL−1),逐滴加入0.01 mol·L−1 HCl得到滴定曲线 (图 2)。由图可知,起始滴加稀HCl,混合溶液的pH由12.0快速下降到7.0,在pH 7.0~5.0内,随HCl体积的增加,滴定曲线以平缓坡度下降,表明在此pH范围内PEOZ-CHMC对酸具有较强的缓冲能力,而该pH范围与肿瘤组织酸性环境相近,由此可以预测PEOZ-CHMC能对肿瘤组织酸性环境有效应答,在修饰脂质体后具有促进脂质体发生核内体逃逸的能力。

Figure 2 Acid titration profile of aqueous solutions of the PEOZ-CHMC micelles
2 DOX·HCl脂质体的表征

采用硫酸铵梯度法制备盐酸阿霉素脂质体,后插入法制备PEOZ-CHMC和PEG-DSPE修饰的盐酸阿霉素脂质体。并对脂质体的粒径、粒径分布、zeta电位及包封率进行表征。由表 1可知,本研究制备的DOX-L粒径在120 nm左右,经PEOZ-CHMC和PEG- DSPE修饰后,粒径基本没有变化。利用葡聚糖凝胶微柱离心法测定DOX-L的包封率为 (97.3 ± 1.4) % (n = 3),PEOZ-CHMC和PEG-DSPE修饰后,包封率基本没有发生改变。由透射电镜图可知 (图 3),PEOZ修饰脂质体形态均为球形或类球形,粒径均在100 nm左右。

Table 1 Characteristics of different formulations of liposomes. n = 3,x± s

Figure 3 Transmission electron microscopy image of PEOZ- CHMC modified DOX·HCl-loaded liposomes (PEOZ-DOX-L)
3 不同材料修饰的DOX·HCl脂质体体外释药行为考察

各种制剂的释放曲线见图 4,在pH 7.4的释放 介质中,24 h后DOX-L的累积释放率大于60%,而PEOZ-DOX-L和PEG-DOX-L释放率均低于45%,表现出较好的缓释效果。这表明在生理环境下PEOZ赋予脂质体较好的稳定性。随着pH降低,PEOZ-DOX-L释药量显著增加,当pH为5.0时,8 h累计释放率超过90%; 而低pH对DOX-L和PEG-DOX-L的释放特性无明显影响。结果表明,在微酸环境下,PEOZ能促使脂质体去稳定化、快速释药。

Figure 4 In vitro release profiles of DOX·HCl from DOX-L,PEG-DOX-L and PEOZ-DOX-L in PBS at different pH values. n = 3,x± s
4 激光共聚焦显微镜检测DOX·HCl脂质体的细胞内定位情况

以激光共聚焦显微镜考察不同时间点3组DOX·HCl脂质体的细胞内定位情况,其中DAPI对细胞核染色呈蓝色,荧光模型药物DOX·HCl呈红色,二者共定位时呈粉色。由图 5可知,脂质体与细胞孵育1 h后PEOZ-DOX-L的红色荧光强度明显强于DOX-L和PEG-DOX-L,且在相同的时间内DOX-L和PEOZ- DOX-L入胞后红色荧光定位在细胞核,而PEG-DOX-L则部分分布在核周围 (白色箭头),表明PEOZ的存在有效提高了细胞对脂质体的摄取能力,也进一步说明了PEG链抑制脂质体的细胞摄取并在内吞入胞后减缓脂质体的释药速率,延迟了DOX递送到核的时间。当孵育时间延长至4 h时,细胞核处荧光共定位强度依次为PEOZ-DOX-L > DOX-L > PEG-DOX-L,表明PEOZ可以对核内体的低pH有效应答,使PEOZ- DOX-L成功发生核内体逃逸。

Figure 5 Intracellular delivery of the different DOX·HCl-loaded liposomes on MCF-7 cells at different times observed by CLSM. Red fluorescent: DOX·HCl; Blue fluorescent: cell nuclear. 1: DAPI; 2: DOX·HCl; 3: Merge of 1 and 2
5 DOX·HCl脂质体对癌细胞的抑制作用

细胞抑制作用结果如图 6,随着DOX·HCl剂量的增加,各制剂组对MCF-7细胞抑制作用均明显增强。当pH由7.4降低到5.0时,PEOZ-DOX-L的细胞抑制作用明显增强 (P < 0.01),表明PEOZ能应答肿瘤微酸环境,在靶部位快速释药,提高制剂的抗肿瘤活性,显示出PEOZ-DOX-L具有良好的pH敏感性。但pH降低对PEG-DOX-L和DOX-L的细胞抑制作用没有影响。在pH 7.4条件下,PEOZ-DOX-L的细胞抑制作用强于其他组别 (P < 0.01)。

Figure 6 Cytotoxicities of DOX-L,PEG-DOX-L and PEOZ- DOX-L at various concentrations of DOX·HCl against MCF-7 cells. n = 3,x± s. ##P < 0.01; **P < 0.01 vs PEOZ-DOX-L (pH 7.4)
讨论

本文将PEOZ-CHMC修饰在DOX·HCl脂质体表面,构建新型pH敏感脂质体,PEOZ可以在肿瘤组织的微酸环境下促进细胞对脂质体的摄取,内吞入胞后又能对核内体的低pH值作出应答,诱导其发生核内体逃逸,发挥药效。

近年来利用PEOZ构建的pH敏感胶束引起越来越多的关注[8, 9],本实验室曾合成系列PEOZ-脂质衍生物,包括PEOZ-胆固醇半琥珀酸酯 (PEOZ-cholesterol hemisuccinate,PEOZ-CHEMS)、PEOZ-CHMC等[10, 11],并构建PEOZ-CHEMS修 饰的DOX·HCl脂质体,取得了与本研究类似的结果[10],表明PEOZ脂质衍生物具有赋予脂质体pH敏感性的能力。在前期实验基础上,本研究进一步验证了PEOZ-CHMC在递送化疗药物的疗效和优越性,通过PEOZ-CHMC缓冲能力的考察对其酸敏机制进行了探究,为后续pH敏感性药物递送系统的研究提供一定的理论依据。PEOZ具有可离子化的碱性基团NR3+,在酸性条件下,与供氢物质形成氢键,这时PEOZ由亲水舒展的长链结构变成致密的、疏水的球状物结构,当PEOZ存在于脂质体表面时,pH的下降引起PEOZ发生上述的构象改变,紧密地吸附在脂质体表面。为容纳吸附的PEOZ链,脂质体双分子层发生重排,其最佳排列方式即为胶团,从磷脂双分子层膜到胶团囊膜破坏,或互相融合,使内容物迅速释放[11]

在模拟体内生理pH释放介质中,与DOX-L相比,PEOZ-DOX-L和PEG-DOX-L均表现出较好的缓释效果。结果说明,在生理pH条件下,PEOZ可以起到类似PEG的作用,增加脂质体稳定性。当释放介质的pH降低时,PEOZ-DOX-L的释药速率明显加快,而pH降低对普通脂质体和PEG-DOX-L均无明显影响,因此PEOZ能对酸性环境及时作出应答。细胞抑制作用结果表明,肿瘤细胞外低pH环境能有效促进PEOZ-DOX-L的细胞摄取,并使脂质体去稳定化,增强对癌细胞的杀伤作用。有趣的是,在pH 7.4条件下PEOZ-DOX-L的细胞抑制作用比普通脂质体和PEG修饰脂质体高,与文献[12]报道PEG链抑制细胞对脂质体的摄取结果恰好相反,有待进一步研究证明其机制。

激光共聚焦显微镜结果显示,在同等时间内PEOZ-DOX-L荧光强度最高且DOX·HCl皆定位在细胞核上,说明PEOZ的存在既提高了细胞摄取量又有效诱导脂质体发生核内体逃逸,增强药效。在激光共聚焦图片中显示,DOX·HCl主要定位于细胞核,这是因为DOX·HCl是DNA-靶向的蒽环类药物,必须通过进入细胞核来杀死肿瘤细胞[13]。Betancourt等[14]发现,细胞中的DOX·HCl浓度较高,DOX·HCl更易于进入细胞核,Guo等[15]通过激光共聚焦显微镜观察到DOX·HCl强烈的红色荧光定位于细胞核,本研究结果与前人文献结果较为一致。

本研究制备了具有良好pH敏感性和缓释性的PEOZ修饰的DOX脂质体,结果显示PEOZ修饰能有效提高盐酸阿霉素脂质体对肿瘤细胞的杀伤作用,克服PEG修饰脂质体存在的细胞摄取困难、不能有效将药物递送进入细胞的问题。

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