石斛属 (Dendrobium) 为兰科 (Orchidaceae) 第二大属。在我国, 石斛属植物共有74种和2个变种, 主要分布在华南及西南地区^[1]。石斛是一种珍稀名贵中草药, 有生津、止咳、润喉等功效。丁小余等^[2]通过对浙江枫斗加工地的实地考察和查证, 发现几乎所有具有柔软茎的石斛均可加工为枫斗。药材的判 断仅凭传统经验, 往往让不法商贩有机可乘。因此, 寻找一种快速、有效的鉴别枫斗类石斛的方法十分必要, 并可作为规范枫斗市场的有力科学依据。

以往对于枫斗类石斛的鉴定主要集中在对其显微结构、生药成分的理化鉴别方面。白音等^[3]通过对枫斗类石斛茎材料的角质层厚度、表皮细胞切向直 径和径向直径等17个具有鉴别意义的显微特征研究, 建立了枫斗类石斛的综合鉴定方法, 但其不能快速进行鉴别, 同时枫斗类石斛作药用时通常会加工成石斛粉, 使显微鉴定无法进行。随着现代分子生物学DNA测序技术的迅速发展, 利用DNA barcoding技术对中药材植物的鉴定研究越来越多,DNA barcoding候选基因nrDNA ITS、matK、rbcL以及psbA-trnH等已在人参 (Panax ginseng C. A. Mey)、秦艽 (Gentiana macrophylla Pall)、金银花 (Lonicera japonica Thunb) 等中药材基原植物的鉴定中得到广泛应用^{[4, 5, 6, 7]}。在对石斛属植物的研究方面: 丁小余等^[2]建立了21种枫斗类石斛的nrDNA ITS区全序列数据库; 刘静等^[8]对12种药用石斛的叶绿体matK基因序列特征及物种 鉴别进行了研究; Yao等^[9]发现可以利用psbA-trnH序列对17种石斛及1种混伪品进行鉴定。然而Xiang等^[10]在对石斛属植物的DNA条形码序列研究中发现, 单一序列并不能完全鉴定出不同种类的石斛属植物, 同时, 也有研究表明单一片段无法鉴别霍山石斛及细茎石斛^[11]。目前, 在利用多片段联合的方法对不同植物进行鉴定的研究过程中发现, 结合叶绿体和核DNA序列可有效提高物种间的分子鉴别率^{[12, 13, 14]}。因此, 可对石斛属植物进行多片段联合鉴定研究, 以达到更好的鉴定目的。

有研究发现, 线粒体基因序列更适于区分亲缘关系较近的物种^{[15, 16]}, 而Xiang等^[10]利用nrDNA ITS序列及叶绿体基因片段进行研究发现, 在石斛属内存在多个复合种, 如: 细茎石斛 (D. moniliforme (Linn.) Sw) 与霍山石斛 (D. huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng), 而且nrDNA ITS序列及叶绿体基因片段并不能很好地区分这些物种。目前关于石斛属植物线粒体基因片段的研究还较少, 仅有Zhang等^[17]将NADH脱氢酶亚基1编码基因 (nad 1) 内含子2 (intron 2) 序列应用于石斛属植物的鉴定, 其研究结果表明该单一序列并不能直接对枫斗类石斛进行有效鉴别。线粒体nad 5序列多应用于蕨类、藻类植物的物种鉴定, 而在石斛属植物中罕见报道^{[18, 19]}。因此, 本文从线粒体基因片段入手, 利用PCR技术扩增出17种枫斗类石斛39个个体的线粒体基因co I、nad 5部分序列 及NADH脱氢酶亚基1编码基因 (nad 1) 内含子2 (intron 2) 序列、nrDNA ITS序列及叶绿体基因序列rbcL、matK、psbA-trnH, 同时筛选出适合的基因片段来研究多片段联合在枫斗类石斛植物鉴定方面的应用。

本实验所用材料主要采自云南、广西、贵州及安徽等地 (表 1), 待检种1、2、3采自安徽霍山。上述实验材料由丁小余教授鉴定, 鲜植株保存于南京师范大学生命科学学院植物资源与环境研究所。

表1(Table 1)

Table 1 Seventeen species from Dendrobium species of Fengdous used in this study Name of original plant Name of Fengdou Locality Simple Dendrobium officinale Tiepi Fengdou Xingyi,Guizhou 3 D. moniliforme Tongpi Fengdou Xingyi,Guizhou 3 D. huoshanense Jinhuodou Huoshan,Anhui 3 D. devonianum Zipi Fengdou Longguang,Guizhou 3 D. loddigesii Xiaohuangcao Fengdou Simao,Yunnan 3 D. aphyllum Shuicao Fengdou Xingyi,Guizhou 2 D. chrysanthum Shuicao Fengdou Longguang,Guizhou 2 D. primulinum Shuidabang Fengdou Yulin,Guangxi 2 D. crystallinum Shuicao Fengdou Xingyi,Guizhou 2 D. hercoglossum Jizhualan Fengdou Simao,Yunnan 2 D. strongylanthum Chongcao Fengdou Yulin,Guangxi 2 D. falconeri Zhumilan Fengdou Yulin,Guangxi 2 D. crepidatum Zipilan Fengdou Longguang,Guizhou 2 D. wardianum Tipibianlan Fengdou Simao,Yunnan 2 D. lituiflorum Shuicao Fengdou Xingyi,Guizhou 2 D. aduncum Zipilan Fengdou Yulin,Guangxi 2 D. gratiotissinum Tipibianlan Fengdou Longguang,Guizhou 2

Table 1 Seventeen species from Dendrobium species of Fengdous used in this study

取硅胶干燥的材料叶片, 用75% 乙醇擦拭叶片表面后, 用CTAB法^[20]提取叶片总DNA。利用紫外吸光法测定所提取的DNA模板质量, 紫外吸光值260/280在1.8～2.0之间,260/230大于1.7, 将模板浓度稀释至30 ng·μL^-1, -20 ℃保存。

根据GenBank公共数据库中可用线粒体基因数据, 对被子植物nad 1外显子部分、nad 5及co I基因序列进行比对, 确定保守区, 利用Primer Premier 5.0软件设计引物, 并用Oligo 6.0软件进行评估。nrDNA ITS序列及叶绿体基因片段psbA-trnH、matK和rbcL则采用通用引物扩增。具体引物见表 2。

表2(Table 2)

Table 2 Fragment sequence used in our research to get target gene Sequence name Fragment sequence (5'-3') nrDNA ITS F: CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC R: TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG rcbL F: TGTGAAGTAAGTCTCCGTATCT R: GCTTGTATGAATCGCTATTGGT psbA-trnH F: TTCCACCCGGTTTAGAAGCGGGCC R: ACGCCGTAATCAACCTATGGTTT matK F: CCTATATCCGCTACTCCTTC R: CTCAGTGAATTTCACCACG nad 1-intron 2 F: TTCGCCGCCATTTGATGCGGG R: TCGTGCTAATCTTGGTATGGAA nad 5 F: CACACGACTTCAGGCAGATAAAGC R: CATGACATCGTAATCTGTCTCGCC co I F: CGATGGCTGTTCTCCACTAACCA R: CTTAGTAGCAGTCGGCGACCTTT

Table 2 Fragment sequence used in our research to get target gene

PCR反应条件: 10 × PCR Buffer 3 μL、dNTP (10 mmol·L^-1) 2.1 μL、Mg²⁺ (25 mmol·L^-1) 2.1 μL、引物 (2 μmol·L^-1) 各3 μL、模板DNA (25 ng·μL^-1) 11 μL、TaqDNA聚合酶 (5 U·μL^-1,TaKaRa) 0.5 μL、加灭菌双蒸水至反应体系为30 μL。全部序列的PCR反应程序: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min,50～60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min, 共30个循环后72 ℃延伸10 min, 最后 4 ℃保存。目的片段切胶回收, 经纯化后送华大基因公司进行序列测定。

序列分析 将测序结果用Vector NTI Advance 10.0进行拼接, 提交至NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/), 获得序列号, 见表 3。将整理后的序列利 用MEGA 5.0软件分析^[21], 计算各样品DNA序列 之间的差异百分比、简约信息位点及单一多态位点。根据K-2-P (kimura-2-parameter) 模型, 生成距离矩阵, 分析各枫斗类石斛基原植物的种间变异, 同时 利用p-distance对DNA序列进行筛选。使用邻接法 (neighbor-joining) 在MEGA 5.0软件中构建分子系统树, 系统树各分支的置信度用自举检验法 (bootstrap test) 检验, 共进行1 000次循环, 以评价各分支的系统学意义与可靠性。

表3(Table 3)

Table 3 Plant materials used in this study. The samples of each species have the same GenBank No. Species name GenBank No. nrDNA ITS nad 1-intron 2 nad 5 co I psbA-trnH rcbL matK Dendrobium officinale KP264989 KP704516 KP704535 KP704497 KP704440 KP704478 KP704459 D. moniliforme KP264991 KP704518 KP704537 KP704499 KP704442 KP704480 KP704461 D. huoshanense KP264993 KP704520 KP704539 KP704501 KP704444 KP704482 KP704463 D. devonianum KP264996 KP704523 KP704542 KP704504 KP704447 KP704485 KP704466 D. loddigesii KP264997 KP704524 KP704543 KP704505 KP704448 KP704486 KP704467 D. aphyllum KP264999 KP704526 KP704545 KP704507 KP704450 KP704488 KP704469 D. chrysanthum KP265000 KP704527 KP704546 KP704508 KP704451 KP704489 KP704470 D. primulinum KP265001 KP704528 KP704547 KP704509 KP704452 KP704490 KP704471 D. crystallinum KP265002 KP704529 KP704548 KP704510 KP704453 KP704491 KP704472 D. hercoglossum KP265004 KP704531 KP704550 KP704512 KP704455 KP704493 KP704474 D. strongylanthum KP265006 KP704533 KP704552 KP704514 KP704457 KP704495 KP704476 D. falconeri KR075038 KR139917 KR075066 KR075059 KR075052 KR075073 KR089053 D. crepidatum KR075039 KR139918 KR075067 KR075060 KR075053 KR075074 KR089054 D. wardianum KR075040 KR139919 KR075068 KR075061 KR075054 KR075075 KR089055 D. lituiflorum KR075041 KR139920 KR075069 KR075062 KR075055 KR075076 KR089056 D. aduncum KR075042 KR139921 KR075070 KR075063 KR075056 KR075077 KR089057 D. gratiotissinum KR075043 KR139922 KR075071 KR075064 KR075057 KR075078 KR089058 Bulbophyllum odoratissimum KP265007 KP704534 KP704553 KP704515 KP704458 KP704496 KP704477

Table 3 Plant materials used in this study. The samples of each species have the same GenBank No.

对17种枫斗类石斛39个个体的7个序列特征 分析结果如表 4所示。由表 4可知,nrDNA ITS变异位点所占百分率最高, 为59.6%, 其次为线粒体基因nad 1-intron 2和叶绿体基因psbA-trnH, 为10.5% 和8.0%。非编码区序列的变异位点远高于基因编码区。

表4(Table 4)

Table 4 The feature of seven sequences from Dendrobium species of Fengdous used in this study Sequence name Length/bp Variable site Variable rate/% Parsim-informative site Parsim-info rate/% Singleton site Singleton rate/% nrDNA ITS 606 361 59.6 213 35.1 148 24.4 rcbL 647 12 2.5 5 1.0 7 1.4 psbA-trnH 961 52 8.0 24 3.7 28 4.3 matK 487 64 6.7 14 1.5 50 5.2 nad 1-intron 2 627 66 10.5 38 6.1 28 4.5 nad 5 838 4 0.5 3 0.3 1 0.1 co I 1 116 7 0.6 2 0.1 5 0.4

Table 4 The feature of seven sequences from Dendrobium species of Fengdous used in this study

2 基于K-2-P模型对枫斗类石斛基原植物的种间变异分析

利用K-2-P模型对17种枫斗类石斛的39个个体的7个片段进行种间变异程度分析。由于种内材料较少, 因此本研究主要针对枫斗类石斛基原植物的种间变异程度进行分析。基于K-2-P模型计算的种间变异值如表 5所示,17种枫斗类石斛基原植物nrDNA ITS序列的平均种间距离最高, 为0.382, 其次为线粒体片段nad 1-intron 2和叶绿体片段psbA-trnH, 分别为0.228和0.046; 非编码区序列的种间变异远高于基因编码区。

表5(Table 5)

Table 5 Results of interspecific genetic distance analysis for seven candidate DNA barcoding regions Sequence name Range of genetic distances (mean) nrDNA ITS 0.340-0.427 (0.382) nad 1-intron 2 0.223-0.235 (0.228) psbA-trnH 0.034-0.055 (0.046) matK 0.023-0.028 (0.026) rbcL 0.010-0.014 (0.013) nad 5 0.002-0.014 (0.008) co I 0.003-0.004 (0.003)

Table 5 Results of interspecific genetic distance analysis for seven candidate DNA barcoding regions

通过计算17种枫斗类石斛的39个个体的7个片段的p-distance来筛选合适的DNA序列。如表 6所示, 本实验所获得的7个DNA条形码候选序列的长度差异较大, 其中来自于核基因组的nrDNA ITS序列的p-distance最高, 为0.248, 位于线粒体基因组的nad 1-intron 2为0.173, 高于叶绿体片段psbA-trnH,0.043。从表中可以发现,nrDNA ITS和nad 1-intron 2这2个片段的组合比nrDNA ITS和psbA-trnH片段的组合更适合用作枫斗类石斛的DNA条形码, 对其进行分子鉴定。

表6(Table 6)

Table 6 p-Distance and sequence length of seven candidate DNA barcoding regions Gene sources Sequence name p-distance Nuclear nrDNA ITS 0.248 Choloroplast gene psbA-trnH 0.043 matK 0.025 rbcL 0.013 Mitochondria gene nad 1-intron 2 0.173 nad 5 0.008 co I 0.003

Table 6 p-Distance and sequence length of seven candidate DNA barcoding regions

对本实验室测序获得及NCBI下载的10条细茎石斛、17条霍山石斛的nrDNA ITS序列进行比对后, 共有572个碱基位点, 其中变异位点28个 (表 7)。根据变异位点分析, 霍山石斛共发现2种单倍型: 其中有16条序列为H1型,1条序列为H2型。细茎石斛共发现7种单倍型: 其中4条序列为M1型; M2～M7型各有1条序列。比对发现大多数霍山石斛与细茎石斛共享同一种单倍型: H1、M1, 同时除M3、M6这两种单倍型外, 其他单倍型也不能完全将霍山石斛与细茎石斛区分, 因此有必要采用其他有效方法对细茎石斛与霍山石斛进行区分。

表7(Table 7)

Table 7 nrDNA ITS sequences variable sites of D. huoshanense and D. moniliforme. Haplotype Nucleotide position 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 3 5 7 8 9 4 6 6 7 8 8 0 0 1 1 5 6 0 3 5 9 0 1 1 3 3 0 6 4 8 9 2 9 6 0 6 5 5 8 2 9 0 1 2 8 4 2 5 9 7 2 6 0 1 8 5 H1 T A C C G T C G C T C C A C G C G G C C C C C C C T C C H2 * * * * * * * * * * * * * * A * * * T * * * * * * * * * M1 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * M2 * * * T * * * * * * * * T * * * * * * * * * * * * * * * M3 G * * * A A A A T C T T * * * T A A * T T G A * * C * T M4 * * * * * * * * * * * * * T * * * * * * * * * * T * * * M5 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * T * * * * M6 * T T * * * * A T * T T * * * * * * * * * G * * * C * T M7 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * T *

Table 7 nrDNA ITS sequences variable sites of D. huoshanense and D. moniliforme.*: The same nucleotide in the same position; H: D. huoshanense; M: D. moniliforme. H1: (JN388567.1; KC205197.1; KF143476.1; KC331003.1-KC331012.1; KP264993-KP264995); H2: (EU840696.1); M1: (GU339111.1; HQ114246.1; KP264991-KP264992); M2: (EU003114.1); M3: (AF401489.1); M4 (KC205189.1); M5 (KC346891.1); M6: (AF359254.1); M7: ( AF311777.1)

利用MEGA 5.0软件分别对nrDNA ITS、psbA- trnH及nrDNA ITS+psbA-trnH联合片段构建UPGMA树进行分析 (图 1)。UPGMA树分析发现在石斛属植物中, 相同的物种聚为一支, 如霍山石斛和铁皮石斛。然而, 单一片段psbA-trnH不能对枫斗类石斛进行 很好的鉴别, 同时, 单一的nrDNA ITS序列或nrDNA ITS+psbA-trnH联合片段构建的UPGMA树中, 霍山石斛与细茎石斛聚为一支, 不能区分, 但利用nrDNA ITS+nad 1-intron 2序列构建的UPGMA树, 可以很 好地区分霍山石斛与细茎石斛, 并能有效地对其进行鉴定。结果表明: 利用nrDNA ITS片段与线粒体 片段nad 1-intron 2的组合优于nrDNA ITS和叶绿体片段psbA-trnH的组合,nrDNA ITS+nad 1-intron 2联合构建UPGMA树可以有效对枫斗类石斛进行分子鉴定。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Phylogenetic tree of Dendroubium species using UPGMA method

本研究利用建树法, 基于nrDNA ITS+nad 1-intron 2联合片段对采自霍山的3种野生石斛成功地进行了鉴别。结果如图 2所示, 其中待检种1与霍山石斛聚为一支, 待检种2与细茎石斛聚为一支, 待检种3与铁皮石斛聚为一支, 支持率均为100%。这些材料在原植物开花后得到了验证, 即分别为霍山石斛、细茎石斛和铁皮石斛。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Phylogenetic tree of Dendroubium species using UPGMA method

DNA barcoding由Paul Hebert于2003年提出, 即利用一段短的、标准的DNA片段 (400～800 bp) 对物种进行快速、准确的鉴定^[22]。自从DNA barcoding提出后便成为了近年来国际生物多样性研究的一个热点, 它对新物种的发现和珍稀濒危物种的保护具有重要的意义。位于核基因组的rDNA ITS区进化速率快, 因而成为植物条形码鉴别的重要候选基因片段, 近年来的研究表明,nrDNA ITS序列在石斛属物种间具有较大的种间变异和较小的种内变异, 因而成为石斛属物种鉴定的有效DNA分子标记^{[2, 23]}。

诸多研究结果表明, 单一个片段不可能对所有的植物物种进行准确鉴定, 许多研究者又相继提出了不同的片段组合方案^{[9, 14, 24]}。国际条形码协会植物工作组在2009年对来自55个物种907个样品的7个序列进行了比较分析, 认为rbcL+matK的组合可以作为植物通用条形码^[14]; Chen等^[24]研究认为psbA- trnH可以作为nrDNA ITS的互补序列对药用植物进行鉴定; 邵世光等^[25]研究发现,psbA-trnH作为叶绿体中进化速率最快的间隔区之一, 可以用来鉴定石斛属物种及其混伪品。在本研究中, 通过对霍山石斛和细茎石斛的nrDNA ITS序列比对后, 发现单一片段无法将其区分开来, 然而nrDNA ITS序列仍具有较高变异位点率, 高达59.6%; 在叶绿体不同片段中,psbA-trnH片段的变异位点率最高, 约占8.0%, 之后依次为matK、rbcL, 分别为6.7% 和2.5%。

线粒体基因序列因具有较好的位点多样性水平, 在动物中有着广泛的应用, 很多序列片段不仅可以应用于谱系地理、系统发育方面的研究, 还可以筛选为DNA条形码序列, 用于物种鉴定研究^{[26, 27, 28]}。一段648 bp的co I基因片段可以适用于多个动物类群鉴 定, 已经成为动物鉴定的基础片段, 然而该基因在植物中非常保守, 并不适合植物的物种鉴定^[29]。因此, 筛选出适合的线粒体标记, 可以为植物物种鉴定提供一种新的思路。本文通过对17种枫斗类石斛39份石斛样品的不同区域进行对比研究发现, 线粒体基因nad 1-intron 2变异位点所占百分率远高于叶绿体基因psbA-trnH, 高达10.5%, 而在线粒体基因nad 5和co I片段中,变异位点仅分别有4个和7个。

目前,DNA条形码鉴定分析的方法主要有3种, 即相似性搜索法、距离法和建树法。因nrDNA ITS序列不能对所有枫斗类石斛属植物进行有效鉴别, 因此利用联合片段建树法则是较好的鉴别方法。建树法是应用MEGA或PAUP等生物软件构建NJ、UPGMA、MP等系统发育树, 确定与未知样品的DNA条形码序列聚类在一起的物种, 从而达到鉴定物种的目的。只有当DNA序列的变异率合适的时候才能较好的利用建树法来进行物种鉴定, 目前评价序列变异率的方法主要有两种,PIC^[30]和p-distance^[31], 其中p-distance方法较为简便、快速。本研究通过计算比较7个DNA序列的p-distance值发现,nrDNA ITS最高, 其次为nad 1-intron 2和psbA-trnH。

在对17种枫斗类石斛构建UPGMA树鉴定的 过程中发现, 利用单一片段或是结合nrDNA ITS和psbA-trnH构建UPGMA树时, 不能对枫斗类石斛中的霍山石斛及细茎石斛进行有效鉴定, 通过对目前已获得的霍山石斛和细茎石斛的nrDNA ITS序列比对发现, 大多数霍山石斛与细茎石斛共享同一种单倍型。而加入了nad 1-intron 2序列片段后可以提供足够的变异位点, 从而使霍山石斛及细茎石斛得以区分。因此, 新型联合片段: nrDNA ITS+nad 1-intron 2的组合明显优于nrDNA ITS和叶绿体片段psbA-trnH的组合, 其构建的UPGMA树则能区分霍山石斛和细茎石斛, 从而对所有枫斗类石斛基原植物进行鉴定。

石斛属植物作为名贵的中药材, 种间鉴定方面的研究仍有待完善。筛选出有效的石斛属DNA条形码序列可以为其物种鉴定及规范石斛市场提供理论依据。本研究首次对线粒体编码及非编码序列进行筛选, 并利用新型联合片段: nrDNA ITS+nad 1-intron 2构建UPGMA树对17种枫斗类石斛进行鉴定, 为石斛属枫斗类药材的鉴定提供了一种新的思路。