药学学报  2015, Vol. 50 Issue (8): 1032-1037   PDF    
基于1HNMR代谢组学和偏最小二乘法的小柴胡汤证判别研究
邢婕1,2, 原曙春3, 孙慧敏1,2, 范玛莉1, 李震宇1 , 秦雪梅1     
1. 山西大学 中医药现代研究中心, 山西 太原 030006;
2. 山西大学 化学化工学院, 山西 太原 030006;
3. 山西省荣军医院, 山西 太原 030031
摘要:本文以临床观察选取的小柴胡汤证典型病例为研究对象, 采用1H NMR代谢组学技术对小柴胡汤证患者与健康受试者尿液进行对比分析, 从尿液核磁图谱中指认出内源性代谢物34种。正交偏最小二乘法-判别分析 (OPLS-DA) 显示, 小柴胡汤证患者与健康受试者尿液中的代谢物可明显区分, 说明小柴胡汤证患者体内代谢物轮廓发生了明显变化。结合S-plot散点图和VIP值找到15种差异代谢物, 其中患者尿液中浓度升高的代谢物有亮氨酸、甲酸、甘氨酸、马尿酸、尿嘧啶, 降低的有苏氨酸、2-羟基异丁酸、乙酰胺、2-氧化戊二酸、柠檬酸、二甲胺、丙二酸、甜菜碱、氧化三甲胺、苯乙酰甘氨酸、尿苷。这些代谢物涉及肠道微生物平衡、能量代谢和氨基酸代谢通路, 与小柴胡汤证主证具有一定的相关性。应用偏最小二乘法建立小柴胡汤证的数学预测模型, 该模型可准确判别小柴胡汤证患者。本研究为小柴胡汤证的客观诊断和合理用药奠定了实验基础。
关键词小柴胡汤证     PLS分析     代谢组学     1H NMR    
Discrimination of patients with Xiao-Chaihu Tang syndrome using 1H NMR metabonomics and partial least square analysis
XING Jie1,2, YUAN Shu-chun3, SUN Hui-min1,2, FAN Ma-li1, LI Zhen-yu1 , QIN Xue-mei1     
1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
3. Shanxi Rongjun Hospital, Taiyuan 030031, China
Abstract: 1H NMR metabonomics approach was used to reveal the chemical difference of urine between patients with Xiao-Chaihu Tang syndrome (XCHTS) and healthy participants (HP). The partial least square method was used to establish a model to distinguish the patients with Xiao-Chaihu-Tang syndrome from the healthy controls. Thirty-four endogenous metabolites were identified in the 1H NMR spectrum, and orthogonal partial least squares discriminant analysis showed the urine of patients with Xiao-Chaihu Tang syndrome and healthy participants could be separated clearly. It is indicated that the metabolic profiling of patients with Xiao-Chaihu Tang syndrome was changed obviously. Fifteen metabolites were found by S-pot of OPLS-DA and VIP value. The contents of leucine, formic acid, glycine, hippuric acid and uracil increased in the urine of patients, while threonine, 2-hydroxyisobutyrate, acetamide, 2-oxoglutarate, citric acid, dimethylamine, malonic acid, betaine, trimethylamine oxide, phenylacetyl glycine, and uridine decreased. These metabolites involve the intestinal microbial balance, energy metabolism and amino acid metabolism pathways, which is related with the major symptom of Xiao-Chaihu Tang syndrome. The patients with Xiao-Chaihu Tang syndrome could be identified and predicted correctly using the established partial least squares model. This study could be served as the basis for the accurate diagnostic and reasonable administration of Xiao-Chaihu-Tang syndrome.
Key words: Xiao-Chaihu Tang syndrome     partial least square analysis     metabonomics     1H NMR    

小柴胡汤首出于《伤寒论》, 是广泛应用的千古名方, 其治疗范围广泛, 疗效明显[1]。《伤寒论》和《金匮要略》中涉及到小柴胡汤的条文多达二十余条, 涉及到的疾病多种多样。由于证候的获得主要依赖于医生的主观判断, 缺乏客观指征, 导致小柴胡汤证诊断标准一直存在争论[2]。部分医生在临床上凭借“以方测证”的方式, 即需要患者服用药物一段时间观察疗效以判断诊断正确与否, 有可能延误病情, 甚至造成小柴胡汤的滥用。

中医的“证”是指在疾病的发生、发展过程中, 一组具有内在联系的并能反映疾病过程在某一阶段的病机, 其本质是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反映的一种功能状态的总和[3]。近年来发展的各类组学技术, 是对一个细胞或整个生命体的基因以及所编码的蛋白质和代谢产物的研究[4]。将组学技术应用于中医证候诊断的研究中, 将有助于中医证候本质的客观描述, 对中医现代化具有重要的意义[5]

各类组学技术中, 基因组学和蛋白质组学解释“即将发生的事”, 代谢组学主要解释“已经发生的事”[6]。对于已经处于疾病或亚健康状态的生物体, 其代谢图谱往往会产生一定程度的差异。已有研究将代谢组学技术应用到证候研究中, 例如田俊生等[7]采用代谢组学方法对脾虚证模型大鼠脾脏进行了研究, 盛国光等[8]对肝气郁结证大鼠以及肝气郁结证临床患者的血液和尿液进行了代谢组学研究, 何丽清课题组[9−11]采用代谢组学技术对小青龙汤证大鼠模型的血、尿、肺等多种生物样本进行检测和分析, 对其本质进行了研究。上述研究大致可以分为两类, 一类以动物模型作为研究对象, 造模方式虽然考虑到中医证候产生的原因, 但造模手法与中医证候机制不完全一致, 动物也无法完全复制人类因情志等因素产生的证候表现。另一类以针对性比较专一的 “证”为研究对象, 各种“方证”与之相比, 其内容较宽, 适应证较广, 其诊断难度相对也较高。以中医临床病例为对象, 采用代谢组学技术对中医方证进行研究的报道还很少见。

本文通过临床观察选取经小柴胡汤治疗有效的小柴胡汤证典型病例, 对患者尿液与正常人尿液进行1H NMR代谢组学分析对比, 寻找导致小柴胡汤证患者与正常人之间的尿液产生差异的代谢物, 并采用偏最小二乘回归分析 (PLS) 建立小柴胡汤证的预测模型, 为临床准确诊断小柴胡汤证、合理应用小柴胡汤提供实验依据。

材料与方法

研究对象来源

21例患者来源于山西省荣军医院中医科, 经临床医生诊断为小柴胡汤证, 在用药前收集尿液, 用小柴胡汤 (柴胡24 g, 黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣各9 g) 治疗3到7天后见效, 说明诊断正确。受试者全部签署了参与试验知情同意书。正常对照组样品25份由健康志愿者提供, 患者和健康受试者平均年龄分别为 (40.7 ± 16.5) 岁、(31.8 ± 7.1) 岁, 性别比例分别为11/10、13/12 (男/女), 两组受试者年龄、性别均无显著性差异 (P > 0.05), 所有尿液收集后置于 −80 ℃冰箱保存。

试剂与仪器

Bruker 600 MHz Avance III NMR Spectrometer (600.13 MHz质子频率, 德国Bruker公司)。核磁试剂重水 (Norell, USA), 3-三甲基硅基 [2, 2, 3, 3-d4] 氘代丙酸钠 (TSP, Cambridge Isotope Laboratories Inc., MA)。

样品配制

参照本实验室建立的方法[12], 冰水混合溶液解冻尿液样品, 取尿液500 μL于EP管中, 加入PBS磷酸盐缓冲溶液50 μL (81∶19, v/v, 包含0.2 mol·L−1 Na2HPO4和0.2 mol·L−1 NaH2PO4; pH 7.4), 加入10% 重水进行锁场和0.03% TSP作为化学位移参照, 离心20 min (4 ℃, 13 000 r·min−1), 取上清液500 μL于内径5 mm的核磁管中。

数据采集和图谱处理

温度25 ℃, 600 MHz, 序列: 1D NOESY (RD-90º-t1-90º-tm-90º-acquire), 检测谱宽为8 kHz, 混合时间 (mixing period, tm) 0.15 s, 延迟时间 (recycling delay, RD) 2 s, 自由感应衰减 (free induction decay, FID) 信号累加次数为64次, 采样点为32 768。线宽0.5 Hz, FID信号经过傅里叶变换为一维NMR谱图。

采用MestReNova核磁图谱处理软件对所有NMR图谱进行傅立叶转换并进行相位、基线调整, 同时以TSP的化学位移 (0.0) 为标准对谱图进行化学位移的校正。以δ 0.02为单位, 对δ0.52~9.30区域的谱图进行分段积分, 去掉δ 4.32~5.26和δ 5.58~6.10区间的积分值, 以消除残留的水峰及尿素峰对分析结果的影响, 共得到367个小的积分区域。将数据保存在Excel文档。采用面积归一化前处理, 使数据集中在0~1内, 用于多变量统计分析。

多元统计分析

运用SIMCA-P 13.0软件将积分数据进行中心化和规格化后, 进行主成分分析 (PCA) 或正交偏最小二乘法−判别分析 (OPLS-DA), 得出散点图和S-plot图。

模式识别分析

以小柴胡汤证患者赋值为1, 健康受试者赋值为0, 设定因变量; 以面积归一化后的367个积分值为自变量, 导入SIMCA-P 13.0软件进行PLS分析。随机选取样本总量的20% 为验证集, 即患者中的18、19、20、21号, 健康受试者中的21、22、23、24、25号, 其余为训练集。

结果

1 中医诊断及治疗

当患者出现下列症状中的两个以上时则诊断为小柴胡汤证: 正气不足 (精神差), 邪气也不很盛 (不是特别痛苦), 胃气较弱 (饮食差), 患病时间较长 (缠绵难愈), 实验室检查无明显阳性结果 (不明病因), 舌质淡, 舌苔白厚, 关脉较寸尺脉出现浮、细、数等异常感觉。应用小柴胡汤 (加减) 治疗后, 在21例患者中, 11例症状全部消失, 剩余10例症状部分消失或减轻, 表明临床诊断和方剂应用基本正确。

2 尿液NMR图谱指认

图谱大致可以分为3个区域, 通过分析图谱中峰的化学位移、偶合常数、峰型等信息, 采用对照品比对、文献[13, 14]报道数据以及BMRB数据库中的标准物质对照等方式, 从尿液1H NMR图谱中指认出34个内源性代谢物 (图 1, 表 1)。

Figure 1 600 MHz 1H NMR spectrum of urine. A: Patients of Xiao-Chaihu Tang syndrome; B: Healthy participants

Table 1 1H NMR assignments of major metabolites in urine and content change in patients’ urine. Only the trend of metabolites with VIP > 1 was listed here; P < 0.05, **P < 0.01 vs healthy participants

3 多元统计分析

首先对小柴胡汤证患者与正常人的尿液样品进行PCA分析 (图 2A), 在由PC1 (15.5%) 和PC2 (7.3%) 组成的散点图中可见, 小柴胡汤证患者大多位于散点图的上半部, 而正常人群大多位于散点图的下半部, 患者和健康人群尿液样品存在明显分离趋势, 说明两者存在一定差异, 且组间差异大于组内差异。

Figure 2 The distinction between patients of Xiao-Chaihu Tang syndrome and healthy participants. A: Score plot of PCA; B: Effective validation of the model; C: Score plot of OPLS-DA; D: S-plot of OPLS-DA; XCHTS: Patients of Xiao-Chaihu Tang syndrome; HP: Healthy participants

PCA分析属于无监督的模式识别方法, 它能反映数据的原始状态, 但不能忽略与研究目的无关的组内误差和随机误差, 因而不利于准确确定组间差异。为了确定两组样品的差异, 继续进行OPLS-DA分析。由图 2C可见, 在OPLS-DA散点图中两组样品得到最大分离, 有效降低了组内差异。OPLS-DA分析必须以PLS-DA分析通过模型验证为基础, 排列实验模型验证结果 (R2 = 0.816, Q2 = −0.194, CV-ANOVA验证P值为0.000 1) 显示模型可靠有效 (图 2B)。通过OPLS-DA分析的S-plot图 (图 2D) 和代谢物VIP值找出对分组贡献最大差异代谢物 (表 1)。在VIP值 大于1的代谢物中, 亮氨酸、甲酸、甘氨酸、马尿酸、尿嘧啶在小柴胡汤证患者尿液中的含量较健康受试者高, 而苏氨酸、2-羟基异丁酸、乙酰胺、2-氧化戊二酸、柠檬酸、二甲胺、丙二酸、甜菜碱、氧化三甲胺、苯乙酰甘氨酸、尿苷含量低于健康受试者。

4 模式识别分析

将两类人群尿液的训练集和验证集谱图导入SIMCA-P 13.0软件中进行分析, 以主成分1 (t[1]) 和主成分2 (t[2]) 的得分值为横纵坐标绘制得分散点图(图 3)。由图 3可见, 主成分1和主成分2可以将两类尿液样本明显区分。本文选择的样品来源于门诊和随机选择的健康受试者, 其饮食结构、年龄等均不相同, 因而样品点较为离散。验证集 (患者中的18、19、20、21号, 健康受试者中的21、22、23、24、25号) 分别与小柴胡汤证患者和健康受试者聚集在一起, 说明该模型能够准确判别和预测两类尿液样本。

Figure 3 PLS model analysis score plot of the training set and test set. XCHTS: Patients of Xiao-Chaihu Tang syndrome; HP:Healthy participants

两种尿样之间的真实值与估计值之间的关系。此方 法[15]是以真实值为纵坐标、估计值为横坐标, 绘制散点图。图 4A显示了训练集样本真实值和估计值两者之间的差异, 由评估均方差 (root mean square error of estimation, RMSEE) 表示, RMSEE值为0.094。为了验证PLS训练集模型, 将两种尿液样本的验证集带入训练集所创建的模型中进行验证 (图 4B)。模型的预测能力由验证集产生的预测均方差 (root mean square error of prediction, RMSEP) 表示, RMSEP值为0.169。RMSEE值和RMSEP值均较小且数值较为接近, 说明本模型可以较为准确地预测未知样本。

Figure 4 PLS-derived relationship between observed and estimated value of training set (A) and test set (B)
讨论

本研究采用代谢组学技术对小柴胡汤证患者的尿液代谢物进行了分析, 结果显示小柴胡汤证患者与健康受试者尿液能明显分开, 患者尿液中亮氨酸、甲酸、甘氨酸、马尿酸、尿嘧啶等成分的含量高于健康受试者, 而苏氨酸、2-羟基异丁酸、乙酰胺、2-氧化戊二酸、柠檬酸、二甲胺、丙二酸、甜菜碱、氧化三甲胺、苯乙酰甘氨酸、尿苷等成分的含量低于健康受试者。患者尿液中丙二酸、柠檬酸、2-氧化戊二酸浓度下降, 说明三羧酸循环能量代谢异常。小柴胡汤证患者处于病程的迁延期, 导致相关代谢物含量降低, 表现在患者身体上往往会出现正气不足即精神较差的症状。甜菜碱是胆碱的代谢产物, 胆碱也可以代谢为三甲胺, 继而在肠道微生物作用下代谢成为氧化三甲胺和二甲胺[16]。患者尿液中甜菜碱排泄量减少, 而二甲胺浓度升高, 说明患者肠道微生物系发生了紊乱。马尿酸是甘氨酸和苯甲酸的代谢产物, 一直被看做是肠道微生物平衡的一项重要指标[17], 本研究中, 患者尿液中马尿酸和甘氨酸含量均升高, 也提示体内肠道菌群出现了失衡。上述代谢物浓度的改变与小柴胡汤证患者出现的胃气弱、饮食差的症状相关。肝脏的氨基酸代谢发生紊乱, 例如非典型近端小管受到损伤时, 低分子组分再吸收会减少导致氨基酸排泄量增多。小柴胡汤证患者尿液中亮氨酸含量的升高说明其肝功能可能发生一定改变[18], 从而产生心烦、喜呕的症状。本实验结果客观反映了小柴胡汤证患者体内代谢物轮廓发生了改变, 相关代谢物涉及多个代谢途径, 与小柴胡汤证的部分“主证”具有一定的相关性。证明中医方证具有一定的内在规 律, 传统诊断方法具有一定的科学性, 可以依靠现代科学手段解释和证明。

此外, 本研究还采用偏最小二乘法建立了小柴胡汤证的数学判别模型, 模型预测结果准确性较高, 可实现未知样本的准确判别, 且方法为无创性采样, 样品前处理简单, 测定快捷。中医诊断的核心在于辨证施治, 历经几千年实践, 历代中医总结了大量的诊断和用药经验, 对于病症的治疗也有其独到的意义和作用, 因而经久不衰。但其辨证的主要依据是望、闻、问、切等医生的直观感觉体察, 缺乏定量指标, 虽有其内在规律, 但其重现性和可操作性都难于西医。尽管西医诊断也需要依靠医生的经验, 但现代仪器和手段的使用大大提高了其客观性。近年来, 中医诊断也开始借助于一些内窥镜、超声波等仪器和常规生化检查手段, 有学者称其为“微观辨证”[19], 即利用现代医学的各种方法诊察人体内部的组织结构、功能代谢等微观变化。区别于针对局部的探察和单一生化指标, 代谢组学反映的是人体受到疾病影响之后产生代谢物扰动的整体变化, 与中医“证”的思想具有一致性。采用代谢组学结合模式识别技术作为中医辨证的辅助验证手段, 相较于“以方测证”方式, 具有简单快速的特点, 对提高临床诊断的准确性和速度有一定的研究意义。

此次试验的受试者来源于门诊就诊的患者, 大多症状较轻, 多数患者治愈后便不再前来就诊, 用药后的样本量偏少, 因而本文未涉及用药后的验证以及小柴胡汤的治疗作用, 而是将重点放在了小柴胡汤证这一中医内科汤证基于体液检测的鉴别和预测上。今后的工作将继续收集相关的病例和样本, 以验证和进一步完善本方法。

参考文献
[1] Hu ZJ, Zheng XY, Xue SL, et al. Progress in clinical application of Xiao-Chaihu-Tang [J]. Mod J Integr Tradit Chin West Med (现代中西医结合杂志), 2011, 20: 254-256.
[2] Xu JH, Zhang Q, Chen JX, et al. An analysis of Xiaochaihu decoction based on 147 medical cases [J]. J Tradit Chin Med (中医杂志), 2014, 55: 424-426.
[3] Zhu MD, Du WX, Jiang M, et al. Discussion of research idea of TCM syndromes and genomics, proteomics, metabolomics [J]. Chin J Basic Med Tradit Chin Med (中国中医基础医学杂志), 2010, 16: 69-71.
[4] Pan ZQ, Fang ZQ. Research status of nature of TCM syndrome and new trend of application of systems biology techniques [J]. Chin J Inf Tradit Chin Med (中国中医药信息杂志), 2009, 16: 104-107.
[5] Wang J, Xie SP. Research status of metabonomics of TCM syndrome [J]. China J Chin Med (中医学报), 2013, 28: 1148-1150.
[6] Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E. “Metabonomics”: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiologieal stmuli viamultivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data [J]. Xenobiotica, 1999, 29: 1181-1189.
[7] Chen L, Xiang H, Xing J, et al. 1H NMR based metabolomics study of Bu-zhong-yi-qi-tang in the Spleen-Qi deficiency rat model [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2014, 49: 1320-1325.
[8] Wang WM, Sheng GG. The Stagnation of Liver-Qi Syndrome Experiment and Clinical Study Based on Metabonomics (基于代谢组学的肝气郁结证实验与临床研究) [D]. Wuhan: Hubei University of Chinese Medicine, 2010.
[9] He LQ, Gai JH, Guo X. Experimental study of blood of rats with suitable for small Qinglong decoction [J]. Chin Arch Tradit Chin Med (中华中医药学刊), 2014, 32: 1805-1808.
[10] He LQ, Gai JH, Guo X. Experimental study on rat's urine of syndrome suitable for small Qing-Long decoction [J]. World Sci Technol/Mod Tradit Chin Med Mater Med (世界科学技 术-中医药现代化), 2014, 16: 1542-1546.
[11] He LQ, Gai JH, Guo X. Experimental study on rat's lung of syndrome suitable for Small Qing-Long decoction based on NMR [J]. China J Tradit Chin Med Pharm (中华中医药杂志), 2014, 7: 198-205.
[12] Zhou YZ, Lu LL, Li ZF, et al. Antidepressant-like effects of the fractions of Xiaoyaosan on rat model of chronic unpredictable mild stress [J]. J Ethnopharmacol, 2011, 137: 236-244.
[13] Alexandros P, Sarantos K, Ploutarchos S, et al. 1H NMR based metabonomics investigation of the effect of two different session on the metabolic fingerprint of human urine [J]. J Proteome Res, 2010, 9: 6405-6416.
[14] He P, Li ZY, Fan SC, et al. Differences between Hengshanhuangqi and Chuanhuangqi based on metabolomics and ITS2 sequences [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 1595- 1601.
[15] Seung OY, Yoo SS, Sun HH, et al. NMR-based metabolic profiling and differentitation of ginseng roots according to cultivation ages [J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 58: 19-26.
[16] Xu WF, Wang HF, Chen G, et al. 1H NMR-based metabonomics study on the toxicity alleviation effect of other traditional Chinese medicines in Niuhuang Jiedu tablet [J]. J Ethnopharmacol, 2013, 148: 88-98.
[17] Huang CY, Lei HL, Zhao XJ, et al. Metabolic influence of acute cyposure on Kunming mice [J]. J Proteome Res, 2013, 12: 537-545.
[18] Cui HZ, Chen JX. The Study of Sub-Health Liver Stagnation and Spleen Deficiency Syndrome Based on Metabonomics (基于代谢组学的亚健康肝郁脾虚证的证候特征研究) [D]. Beijing: Beijing University of Chinese Medicine, 2011.
[19] Zu JY. Discussion of the relationship between the dualization and objectification of TCM diagnosis [J]. Chin Arch Tradit Chin Med (中华中医药学刊), 2004, 22: 1139-1140.