越来越多的研究表明药物性肝损伤 (drug-induced liver injury, DILI) 是急性或/和慢性肝脏疾病的重要诱因之一, 在西方国家药物性肝损伤是导致急性肝衰竭的首要因素; 也是导致新药申报未能获批、经FDA批准上市药物最终撤市 (如曲格列酮、曲伐沙星等) 最普遍的原因之一。虽然DILI的发生率相对较低, 约为1/10 000至1/100 000^[1], 但在DILI患者群中出现急性肝衰竭的风险和死亡率相对较高, 相关数据表明由DILI引发最终需接受肝移植或导致死亡的人数约占10%^{[2, 3]}。另外, 由于相关研究方法的限制, 在药物开发的临床前研究及传统临床病理检测中约有40% 具有潜在肝毒性的化合物未能筛查出^[4]。因此, DILI不容小觑。

DILI是一类复杂的疾病, 指由药物本身或/及其代谢产物或由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低所导致的肝脏功能异常或肝脏损伤。根据其病理特征分为肝细胞型肝损伤、胆汁淤积型肝损伤及混

合型肝损伤。用药人群对肝毒性药物的机体反应可分为3个层次, 即适应、耐受和损伤发生^[1]。药物在批准上市前都需通过安全性评价检测, 因此对大多数人来说, 治疗剂量的药物发生肝损伤风险很小, 只有在某些肝毒性药物 (如对乙酰氨基酚) 摄入过量、超过机体耐受能力时才会发生药物剂量依赖性肝损伤。而对于DILI易感人群, 某些药物在治疗剂量下就可能引发特异质型肝损伤。这类肝损伤在新药开发前期研究中不易发现, 与用药剂量无关, 并且在临床用药时采用常规肝损伤指标难以预测。因此, 寻找能预测特异质型肝损伤的发生、识别易感人群的理想生物标志物是当前研究的热点和难点。

DILI初发症状一般特异性不高, 大多与其他非药源性肝脏疾病类似, 同时其体征还具有一定的隐匿性, 部分患者在发生DILI早期表现出轻微肝脏生化指标异常甚至正常。因此, 临床上采用现行的检测指标难以对DILI及早诊断、明确病理类型, 由此不利于进行针对性地干预或及时停药。虽然大部分轻微的肝损伤症状在停药后可自行缓解, 但一旦错过最佳诊疗时机, 发生不可逆严重肝损伤, 预后情况则不佳。另外, 具有肝毒性的药物其种类、结构多样, 有研究表明单从药物分子理化特性的角度不能找到有助于筛查药物肝毒性信息^{[5, 6]}。同时DILI分子机制的复杂性也增大了其检测诊断难度。DILI的致病机制包括: 药物毒性代谢产物的生成、亲电性化合物或活性氧引发氧化应激和线粒体功能紊乱、药物分子作为半抗原结合细胞蛋白, 干扰细胞蛋白分子的正常生理功能或激活免疫系统引发特异质药物性肝损伤等。

总之, 目前临床上运用传统的肝损伤指标来预测、诊断DILI的能力极为有限。为了能有效预测、及时诊断和治疗DILI, 寻找能在药物开发和临床相关性肝损伤发生发展早期能特异性评估发病风险的生物标志物是亟待解决的问题。

Hy’s法则是目前临床上诊断DILI的金标准。包括丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、总胆红素和总胆汁酸等在内的传统指标已被广泛应用于临床多年, 这些指标在对严重DILI的诊断方面具有重要的地位, 但对于肝损伤的早期诊断、易感人群的识别区分等方面具有一定的局限性。

ALT、AST主要分布于肝细胞内, 肝细胞出现损伤或坏死时, 肝细胞完整性被破坏, ALT、AST被释放入血, 由此引起血浆中相应含量上升, 因此血浆中ALT、AST的升高反映了肝细胞膜破坏程度。血浆中ALP、γ-谷氨酰转肽酶的含量通常用作胆汁淤积的诊断指标, 其异常升高直接反映了肝胆管膜的损害。总胆红素和总胆汁酸在循环血中的浓度取决于代谢酶的诱导作用和肝细胞内生物合成活性, 因此总胆红素和总胆汁酸反映了肝功能的状态, 并非肝损伤的发生程度^[7]。因此, 这些指标实质是根据肝细胞膜的完整性和肝功能异常来间接反映肝损伤, 适用于在肝损伤发生之后对其进行诊断检测, 而对肝损伤发生早期的预测较差。同时, 部分传统指标在肝损伤诊断方面所具有的特异性不强。因为骨骼肌损伤也会导致血浆ALT、AST的增高^[8], 某些不涉及临床相关肝损伤的药物 (如双氯芬酸钠) 也有可能发生ALT一过性升高^[9], 另外肝脏具有一定的胆红素清除潴留效应, 也有可能引起血浆胆红素非病理性变化^[7]。

肝功能相关生化指标检测是目前临床上用来诊断DILI最为有效的手段。

当前蛋白质组学在生物标志物的筛选方面应用较多。Amacher等^[10]利用蛋白质组学技术在大鼠模型上将苹果酸脱氢酶 (MDH)、嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)、对氧磷酶 (PON1) 筛选作为与肝毒性相关的血清生物标志物。Schomaker等^[11]为检验MDH、PNP、PON1、谷氨酸脱氢酶(GLDH) 能否作为人体肝损伤指标进而开展临床队列研究。研究结果表明GLDH、MDH与ALT升高的水平具有高度相关性, 并且不受年龄和性别因素的影响, 对于肝损伤具有较高的预测效力, 同时也具有良好的诊断价值。Antoine等^[12]选取对乙酰氨基酚导致肝损伤的首诊患者进行临床研究, 最终结果表明, 相比于ALT, 高迁移率族蛋白1 (HMGB1)、凋亡型角蛋白18 (K18) 能及时灵敏地诊断对乙酰氨基酚过量引起的肝损伤。另外, Bailey等^[13]进行的大鼠实验结果提示α-谷胱甘肽巯基转移酶 (α-GSTA)、精氨酸酶1 (ARG1)、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶 (HDP) 用以监测DILI具有比ALT更高的特异性和灵敏性, 其中ARG1作为检测指标能提高对胆管损伤的检测灵敏度, α-GSTA与ALT结合可以更灵敏地检测肝细胞空泡样变性的病理变化, HDP协同ALT用于诊断肝肿大具有更高的特异性。2012年, Bell等^[14]运用蛋白质组学技术对DILI前瞻性研究机构收集的相关人群血样展开了一项系统性研究, 发现不少蛋白质分子可以在一定程度上表征DILI发生与否、发生程度、病理类型及预后状态等。如DILI患者与健康人体内apolipoprotein E水平有显著性差异, fumarylacetoacetase可以用来鉴别肝细胞型DILI与混合型DILI等。

由此看来, 这些蛋白质分子作为生物标志物都具有较大的潜力, 但考虑到药物肝毒性机制的复杂性, 关于这类分子所具有的潜在临床价值是否具有普适性还是仅适用于某种特定的肝毒性药物等方面仍不明确, 还需开展更加深入的研究。

循环血中含有的部分RNA来源于某些组织中细胞的裂解或坏死, 具有一定的组织特异性。这些循环RNA大多与血中蛋白结合形成微囊或外泌体, 避免了核糖核酸酶的降解作用, 因此能比较稳定地分布于血液中。Wang等^[15]采用小鼠对乙酰氨基酚肝损伤模型对循环miRNA进行了DILI方面的研究, 发现miR-122、miR-192与肝损伤的发生密切相关。其中miR-122是一种具有较高肝脏特异性的miRNA, 其在肝脏中的分布丰度约占体内总含量的70%^[16]。随后, Starkey等^[17]对此开展了相应的临床试验, 研究结果表明在miR-122、miR-192同样适用于检测人体对乙酰氨基酚肝损伤, 并且miR-122在检测灵敏性和特异性上更加优于ALT。这一结论随后在一项对乙酰氨基酚肝损伤首诊患者的临床研究^[12]中再次得到证实。

外周血中也同样存在着具有肝脏特异性的mRNA, Kudo等^[18]研究发现通过检测白蛋白Alb和结合珠蛋白haptoglobin的mRNA水平能更加灵敏地检测肝脏纤维化的发生与发展。Wetmore等^[19]证实在肝毒性药物干预过程中, 相关肝脏特异性mRNA的改变发生在血清转氨酶和肝脏组织病理出现变化之前。目前肝脏特异性mRNA的相关研究都是建立在大鼠等动物模型上, 后续还需足够样本量的临床试验来对其临床价值予以佐证。

血浆或血清中的总胆汁酸水平可以表征肝脏排泄功能, 现已作为检测肝损伤的指标之一应用于临床。近几年相关文献^{[20, 21, 22, 23]}报道体液中胆汁酸谱, 即结合型胆汁酸含量、游离型胆汁酸含量或其相对比例的变化与肝损伤的发生有密切联系。本课题组在前期研究^[24]中发现, 在抗结核药物所致肝损伤引起血浆生化指标和肝脏病理显著改变之前, 相关胆汁酸转运体表达水平和活性已出现一定的改变。Yamazaki等^[20]将多种肝毒性药物作用于大鼠模型, 发现在肝毒性药物低剂量作用早期, 在血清转氨酶还未出现明显改变的情况下, 体液中的胆汁酸含量已显著上升, 并且随着发生的肝毒性病理种类不同, 其胆汁酸谱的变化也呈现出一定的差异, 由此表明机体内胆汁酸稳态的破坏是发生DILI的早期事件之一。Ellinger-Ziegelbauer等^[21]研究指出大鼠模型体液中游离型胆汁酸的升高可指示为肝细胞型肝损伤, 结合型胆汁酸的升高大多表明肝胆管损伤。若这一结论能在临床试验方面得到进一步的证实, 胆汁酸谱将能作为具有肝损伤病理类型区分特性的生物标志物。同时, 某些胆汁酸还有可能作为肝损伤预后判断的生物标志物。Woolbright等^[25]研究发现甘氨脱氧胆酸作为对乙酰氨基酚所致急性肝衰竭的预后指标其评估效能较高, 提示可用于预测进展为急性肝衰竭患者的存活率。

另外, 体内脂肪酸谱与DILI之间也存在着一定的联系。有文献^[26]报道在伏立康唑用药人群中, 相比于未出现肝损伤的患者, 发生肝损伤患者其血浆中脂肪酸含量发生了一系列变化。在检测的12种脂肪酸中, 发现有10种其含量都出现明显增加, 其中C14∶0、C16∶1 t、C18∶3 t、C20∶2、C20∶4这5种脂肪酸含量改变尤为显著。由此, 机体内脂肪酸谱的相应变化将有可能表征伏立康唑所致肝损伤的发生。

从根本上避免DILI, 尤其是特异质型肝损伤, 最理想的情况是在用药人群接触具有潜在肝毒性药物之前就能及时辨别DILI易感人群, 从而对其选用其他安全性高的药物。个体化医学强调, 个体携带的某些特定基因在一定程度上已经决定了相关药物或化合物的代谢途径及程度。因此不少研究团体借助药物基因组学技术试 图在该领域寻找具有良好预测价值的理想生物标志物。目前已发现一些与DILI易感性高度相关的特定基因。

先后有几项研究^{[27, 28, 29]}表明, 除了年龄、营养状态、性别、合并用药等独立风险因素外, 具有282 T/T、590A/A、857 G/A或857 A/A; NAT2*5B/5B或NAT2*6A/6A; GSTT1基因缺失纯合子基因型的个体很有可能为抗结核药物肝损伤的高风险人群, 其中NAT2慢乙酰化基因型可能是异烟肼引起DILI的主要风险因素。抗生素类药物虽然常被用以短期给药, 但也出现了肝损伤的相关病例。研究^{[30, 31, 32]}发现分别筛查HLA-B*5701与HLA class II SNP rs9274407基因型可以在一定程度上帮助识别氟氯西林、阿莫西林克拉维酸肝损伤易感人群。另外, 胆酸盐外排泵BSEP功能障碍易导致肝内胆汁淤积, 继而引发肝损伤。Lang等^[33]研究发现携带突变型BSEP基因的个体发生胆汁淤积型肝损伤的风险明显增大, 如BSEP 676位点由天冬氨酸突变为酪氨酸, 与氟伐他汀钠导致的肝损伤显著相关, BSEP 855位点由甘氨酸突变为精氨酸, 与雌二醇引发的肝损伤高度相关。

截至目前, 绝大部分研究都是选取血液样本来寻找理想生物标志物。从血液样本中发现的相关潜在标志分子越来越多, 研究手段和建立的检测方法也日趋成熟, 但发现与确定能应用于临床的新生物标志物仍然面临不少问题。血液样本的采集必须由医护人员协助, 采样的次数、时间及采样量受到一定的限制, 同时也存在着来自医学伦理学的约束。其次, 血液样本中成分复杂, 测定干扰因素多, 研究所采用的相关组学分析或芯片技术成本较高。同时血样中存在着多种降解转化酶, 在DILI发生早期, 某些特异性和灵敏度高的指示分子发生酶解的可能性较大。更重要的一点是血液样本量极为有限。若要增大研究结果的置信度, 提高研究结果向临床转化的应用价值, 最根本的方法即为扩大样本量, 开展前瞻性研究, 而这一点目前受到多方面的限制。

近年来不少研究致力于从尿液中寻找特异性较好的肝损伤生物标记物。尿液中的成分及其含量与其在血液中的分布具有一定的相关性, 相比于血液样本, 尿液中的蛋白丰度更低, 样品检测的信噪比更小, 因此更有利于标志物的检测。更为重要的是尿样检 测具有无创性, 这些特性使得尿液中生物标志物具有较好的临床价值。值得注意的是, 尿液样本的生成比血液样本多一步肾脏的滤过排泄过程, 因此在进行尿液样本中生物标志物的研究过程中需将肾功能可能产生的影响考虑在内^[7]。

当前从尿液中发现潜在肝损伤生物标志物的研究比较有限, 主要围绕蛋白质分子展开。van Swelm等^[34]采用对乙酰氨基酚肝损伤小鼠模型对尿液样本进行蛋白组学研究, 结果发现尿样中超氧化物歧化酶1 (SOD1)、碳酸酐酶3 (CA3) 和钙调蛋白 (CaM) 含量变化与对乙酰氨基酚所致肝损伤的发生高度相关。他们继而收集对乙酰氨基酚中毒患者和健康人群尿样对以上指标进行深入研究, 结果显示SOD1、CA3只有在对乙酰氨基酚中毒患者尿样中才能检测到, 更为有趣的是, 尿样中CaM的浓度与肝损伤患者血浆中对乙酰氨基酚的药物浓度高度相关 (r = 0.97; P < 0.0001), 在ALT未出现明显病理性升高的患者尿样中CaM已呈现显著性上升, 由此CaM显示出比ALT更高的灵敏度和预测效力。另外, 该研究团体还以长期服用甲氨蝶呤治疗银屑病的人群为研究对象, 发现服用高剂量药物的人群容易发生肝纤维化, 其尿液中神经钙粘素N-cadherin、结合珠蛋白haptoglobin和转铁蛋白serotransferrin等水平与甲氨蝶呤所致肝纤维化相关^[35]。

从尿液样本中发现的肝损伤潜在生物标记分子已有部分进入临床研究阶段, 但目前仍存在不少问题^[7]限制了其向临床应用方面的转化。尿液中蛋白质的组成易受到饮食、运动、疾病等多个因素的影响, 因此生物标志物候选分子必须具有足够的特异性和稳定性来便于检测。另外, 尿量的波动范围较大, 水、盐的摄入和流汗、腹泻等都会引起尿量的改变, 进而导致尿液中蛋白质分子浓度的变化, 因此将相关分子浓度标准化是发挥这些特异性生物标志物应用价值的前提条件, 因此制定尿液蛋白质分子浓度标准化指南是该领域尚需解决的问题。

近10年来, 在DILI生物标志物研究领域已取得较大进展, 表 1整合了部分潜在生物标志物。

(Table 1)

Table 1 Potential biomarkers for DILI Candidate biomarker Potential value in DILI Marking type ofliver injury Experimental model Ref. miR-122 Early and sensitive detection,prognosis,differentiation between hepatocyte injury and inflammation Hepatocellular DILI, cholestatic DILI Human,mice,rats [12, 36, 37, 38, 39] High mobility group box-1 (HMGB1) Diagnosis,prognosis Hepatocellular DILI Human [12, 39, 40] Keratin-18 (K18) Diagnosis,prognosis Hepatocellular DILI Human [12, 39, 40] Malate dehydrogenase (MDH) Prediction,diagnosis Human,rats [10, 11] Glutamate dehydrogenase (GLDH) Prediction,diagnosis Hepatocellular DILI Human [11, 12] Fructose-bisphosphate aldolase B Diagnosis (differentiation between hepatocellular DILI and cholestatic DILI) Human [14, 41] Haptoglobin Prediction,identification DILI severity (differentiation between moderate,severe and fatal DILI) Human [14, 42] Lactotransferrin Sensitive detection (differentiation between control and DILI) Human [14] Prostaglandine-H2 D-isomerase Diagnosis (differentiation between hepatocellularand cholestatic/mixed DILI) Human [14] Serotransferrin Diagnosis (differentiation between hepatocellularand cholestatic/mixed DILI) Human [14] Calmodulin (CaM) Prediction,diagnosis Hepatocellular DILI Mice,human [34, 43] Superoxide dismutase 1 (SOD1) Diagnosis Hepatocellular DILI Mice,human [34, 43] Carbonic anhydrase 3 (CA3) Diagnosis Hepatocellular DILI Mice,human [34, 43] Glycodeoxycholic acid (GDCA) Prognosis Hepatocellular DILI(acute liver failure) Human [25] HLA-B*5701 Prediction Flucloxacillin-related liver injury Human [30, 44] HLA class II SNP rs9274407 Prediction Amoxicillin/clavulanate-related liver injury Human [31, 32] NAT2*5B/5B,NAT2*6A/6A Prediction Anti-tuberculosis-relatedliver injury Human [27]

Table 1 Potential biomarkers for DILI

理想的生物标志物应是在生物体受到严重损害之前, 就能对严重毒性损伤提供早期警报, 有助于从药物代谢转运、机体免疫和炎症相关因素等多个方面综合评估DILI的发生风险。传统的肝损伤检测指标未能满足这些要求, 同时, 新药开发前期药物安全性评价体内体外研究模型与人体之间存在的差异以及尚未明确的特异质型肝损伤致病机制都提示研究者应尽快找到更为理想的生物标志物, 降低DILI造成的危害, 保障用药安全。要想尽快达到这一目标, 需要掌握更加充足的用药信息, 综合临床医生提供的药物不良反应报告、药物临床试验所取得的相关信息、专业研究机构、网站和数据库 (如LiverTox) 资源, 由多领域专家 (药物学家、毒理学家、临床医生等) 协同推进DILI研究, 让潜在生物标志物尽早服务于药物开发与临床。