甘草主要来源于甘草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch)的根和根茎[1],是我国常用的大宗药材。近年来栽培甘草已成为甘草药材市场的主流商品,但栽培甘草的甘草酸含量普遍偏低,达不到药典标准,是制约甘草可持续发展的瓶颈[2]。进行优良品种选育是提高甘草酸含量的有效途径,甘草道地性分子机制的研究是进行优良种质资源发掘的重要基础,对甘草的分子育种具有重要意义。
β-香树脂醇合成酶 (β-AS) 基因是甘草酸合成途径关键功能基因,其编码的β-AS能够催化2,3-氧化鲨烯环化生成甘草酸的骨架成分β-香树酯醇,在甘草酸生物合成中具有重要作用[3, 4]; SNPs(single nucleotide polymorphisms) 是指基因中普遍存在的单核苷酸多态性现象,根据分子生物学中心法则,SNPs会导致基因碱基序列的改变,理论上有可能影响mRNA的结构,进而影响酶蛋白的结构,导致酶活性的改变,使其催化产物的含量改变[5]。因此,β-AS的SNP很可能会影响到甘草酸的合成,可能是甘草道地性形成的分子机制之一。
现代甘草的道地产区主要分布在甘肃、宁夏、陕西、山西和内蒙杭锦旗[6]。目前研究甘草道地性分子机制主要采用ISSR、RAPD、AFLP技术,或通过DNA条形码技术、功能基因拷贝数 (CNVs) 检测技术等分析道地药材的基因特化现象,将基因特化的强弱作为道地性显著与否的标志[7, 8, 9, 10, 11]。以上甘草道地性分子机制研究所采用的技术和甘草酸合成途径关键功能基因SNP没有直接联系,不能为甘草分子育种提供明确依据。
本文拟采用PCR-SSCP和测序组合技术分析道地和非道地产区β-AS基因SNP,将其和产地进行相关分析,揭示甘草道地性的分子机制,进而从道地药材中发掘优良种质资源,提高栽培甘草药材的质量。
材料与方法 植物材料作者根据目前甘草药材主产区和道地产区研究结果[6],采集内蒙古杭锦旗、敖汉旗、赤峰市,山西应县,黑龙江肇州县及新疆甘草种子,栽培在北京中医药大学药用植物园。采集103株甘草叶片,液氮冷冻后保存入 -80 ℃低温冰箱。其中内蒙古杭锦旗23株、敖汉旗12株、赤峰市11株,山西应县12株,黑龙江肇州市11株,新疆34株。所有样本由北京中医药大学刘春生教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.。
试剂rTaq DNA聚合酶购于TaKaRa公司; 氢氧化钠、甲酰胺、二甲苯青FF、溴酚蓝、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、TEMED、Tris购于上海生工生物工程公司; 广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒、DL2000核酸分子量标准样购于北京博迈德科技发展有限公司。
仪器SIGMA3K-15低温高速离心机 (SIGMA公司),TECHNE TC-3000PCR扩增仪,Bio-Rad电泳仪,水平电泳槽 (北京六一仪器厂),垂直电泳槽 (北京君意东方电泳设备有限公司),JS-680B全自动凝胶成像分析仪 (上海培清科技有限公司)。
DNA样品的制备按照广谱植物基因组DNA 快速提取试剂盒操作步骤提取样品DNA,1% 琼脂糖凝胶电泳检查DNA 纯度及完整性。
引物的设计与合成根据甘草β-AS外显子序 列[12],运用primerpremier 5.0软件设计引物,引物 序列见表 1。
20μL反应体系中含10×PCR buffer 3.2 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1) 1.6 μL、Forward Primer (5 μmol·L-1) 1.0 μL、Reverse Primer (5 μmol·L-1)1.0 μL、rTaq0.2 μL、Template 1.0 μL、ddH2O 12.0μL。
PCR反应条件第一外显子片段的反应条件如下: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,56 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,35个循环; 72 ℃ 10 min。第二外显子片段的反应条件如下: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,57 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,35个循环; 72 ℃ 10 min。第三至十五外显子片段的反应条件如下: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,35个循环; 72 ℃ 10 min。
SSCP分析取PCR扩增产物3 μL,加入7 μL变性缓冲液 (95% 甲酰胺、10 mmol·L-1 EDTA、0.01% 二甲苯青FF、0.01% 溴酚蓝),混匀后95 ℃水浴变性10 min,立即冰浴5 min,迅速上样于16% 非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。20 ℃下140 V电泳10h。银染检验: 固定液 (10% 乙醇,0.5%冰醋酸溶液) 固定7 min,去离子水漂洗10 s,0.2% 硝酸银染色30 min,去离子水漂洗10 s,显色液 (15% 氢氧化钠溶液,0.4% 甲醛) 显色7 min。
结果 1 PCR扩增PCR扩增所得片段特异性好,条带清晰明亮,可用于后续SSCP分析。以引物1F、1R扩增所得片段为例,4个样品PCR扩增结果如图 1所示。
2 甘草β-AS基因外显子SSCP分型
根据所用样本的SSCP结果,只在第一外显子产生不同的带型,可以划分成3个类型 (图 2),分别命名为I型、II型和III型。
3 甘草β-AS基因外显子不同带型PCR产物测序
对不同SSCP类型的PCR产物进行测序分析,结果显示,I型、II型和III型分别为94A型、94A/G杂交型和94G型,测序峰图如图 3。用DNAman软件进行氨基酸序列预测分析,94 bp位点的SNP突变为错义突变,导致第32个氨基酸发生甘氨酸/天冬氨酸转换。
对不同产地甘草的β-AS基因第一外显子SNP进行分型统计,计算基因型频率和等位基因频率,统计结果如表 2。
结果表明,道地产区94A型所占比例为37.1%、94G型所占比例为2.9%、94A/G杂交型所占比例为60.0%。非道地产区中94A型所占比例为5.9%、94G型所占比例为14.7%、94A/G杂交型所占比例为79.4%。运用SPSS17.0软件对各基因型在不同产区中所占比例进行卡方检验,其中94A型在道地产区和非道地产区间所占比例具有极显著差异(P < 0.001)。
对等位基因频率进行分析,发现道地产区的94 bp位点碱基A出现频率为67.1%、碱基G出现频率为32.9%。非道地产区的94 bp位点碱基A出现频率为45.6%、碱基G出现频率为54.4%。运用SPSS17.0软件对94 bp位点碱基A、G在不同产区中出现频率进行卡方检验后发现,A、G在道地产区和非道地产区间出现的频率具有极显著差异 (P < 0.01),A在道地产区出现频率明显高于非道地产区,而G在道地产区出现频率明显低于非道地产区。
讨论本文采用PCR-SSCP与测序相结合的方法,对甘草β-AS基因外显子中可能存在的SNPs进行检测。首先利用PCR-SSCP方法高通量找到可能存在SNPs位点的片段,再对该片段进行扩增、测序验证,二者结合能够快速、准确地找到SNPs位点,是检测功能基因SNPs的有效方法之一。
本研究发现甘草β-AS基因编码区第一外显子的94 bp位点存在一处SNP,推测的氨基酸序列表明,该SNP导致此处产生错义突变,使第32个氨基酸位点发生甘氨酸/天冬氨酸转换。
通过BLASTX在线分析,发现β-AS的功能结构域包括一个MXCYCR结构、一个FIKKSQ结构、一个DCTAE结构和4个QW结构,而第32位氨基酸不处于β-AS基因的功能结构域上,故此处氨基酸的突变不会对β-AS蛋白功能造成显著影响。使用ProtScale软件对β-AS蛋白进行预测,第32位为甘氨酸或天冬氨酸的值均为 (-1.467),说明该位置的氨基酸转换并未对β-AS蛋白的疏水性造成影响。再进行β-AS蛋白二级结构预测、跨膜预测和信号肽预测后发现,第32位为甘氨酸或天冬氨酸对该酶的二级结构和性质无明显影响。但是,有人利用异源表达方法报道了该SNP导致该酶功能的变化,使β-香树脂醇的合成速率显著提高[13]。因此,该SNP是否影响β-AS蛋白功能,进而影响甘草的质量尚需进一步研究。
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