脑胶质瘤是颅内常见的发生于神经外胚层的恶性肿瘤, 近年来发病率不断提升, 每万人中有5~10人, 约占原发性中枢神经系统肿瘤的40%[1,2]。由于血脑屏障 (blood-brain barrier, BBB) 的存在, 目前脑胶质瘤的药物治疗依旧存在挑战[3]。另外, 药物入脑后若到达非脑胶质瘤部位, 使得脑胶质瘤部位药物浓度降低的同时还可能产生更严重的中枢系统副作用, 因此, 开发一种特定的载体使得药物既能跨越BBB又能靶向至肿瘤部位是非常必要的。
聚酰胺−胺 [poly (amido amine), PAMAM] 是一类合成的、单分散性、球状外形和表面众多官能团的树状大分子, 具有无免疫原性、载药量高、粒径小、表面的正电荷有利于药物递送和结构修饰等特点[4, 5], 是一种用于脑部给药系统的优良载体。随着研究的 深入, 发现带有正电荷的PAMAM通常有溶血性和细胞毒性[6]。因此本实验采用冰片 (borneol, BO) 对PAMAM进行结构修饰以降低其毒性。中医认为冰片具有“引药上行”的作用, 目前研究表明冰片与药物或纳米载药复合物共用具有促进药物入脑递送的作用[7, 8]。因此, PAMAM功能化修饰冰片具有增加药物BBB透过性的潜能。另外, 叶酸 (folic acid, FA) 是一种广泛应用于肿瘤主动靶向的配体, 在肿瘤细胞表面的叶酸受体的活性和数量显著高于正常细胞[9, 10], 因此本实验进一步选择叶酸修饰PAMAM载体, 从而提高药物在肿瘤部位的蓄积量。
本文制备了基于PAMAM载体, 以冰片作为促血脑屏障开放的功能基, 叶酸作为肿瘤靶向配体, 盐酸阿霉素 (doxorubicin, DOX) 作为模型药物的新型载药树状聚合物纳米载体给药系统 (FA-BO-PAMAM/ DOX)。考察其理化性质、体外跨BBB转运率和细胞摄取情况等, 研究其作为脑胶质瘤靶向治疗载体的可能性。
材料与方法 仪器、试剂和细胞Nano-ZS 90纳米粒度−电位分析仪 (英国Malvern仪器有限公司); Mill-Q超纯水仪 (美国Millpore公司); HT7700透射电子显微镜 (日本Hitachi公司); Mercury Plus 600核磁共振仪 (瑞士Bruker公司); 紫外分光光度计 (日本岛津公司); Agilent 1200高效液相色谱仪 (美国Agilent公司); SpectraMax M3酶标仪 (美国Molecular Devices公司); Guava Easycyte流式细胞仪 (德国Merck Millipore公司); DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 (郑州科创仪器有限公司)。
聚酰胺−胺 (PAMAM G5.0, Mw 28 826, 美国Sigma公司) ; 冰片 (borneol, BO, 江西巨鹏化学药品公司); 叶酸(facid acid, FA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 [1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcar- bodiimide hydrochloride, EDC·HCl]、N-羟基琥珀酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide, NHS)、丁二酸酐 (succinic anhydride, SA) (上海阿拉丁公司); 盐酸阿霉素 (doxorubicin, DOX·HCl, 浙江海正药业股份有限公司); 其他试剂均为分析纯。
脑胶质瘤细胞 (C6) 和人脑微血管内皮细胞 (HBMEC) 由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。
FA-BO-PAMAM的合成BO-PAMAM的合成 称取SA 2.0 g溶于50 mL无水二氯甲烷中, 加入等摩尔的二甲氨基吡啶 (DMAP) 和三乙胺 (TEA), 同时加入BO 500 mg, 室温下油浴反应48 h, 得产物BO-SA。取BO-SA 30 mg溶于DMF后, 与5倍当量的EDC和NHS的PBS (pH 5.7) 溶液混合, 室温下活化反应2 h后, 正己烷萃取得BO-SA活性酯。取以上活性酯加入到PAMAM (64∶1, mol/mol) 的水溶液中, 室温过夜反应后转移到透析袋中 (Mr 3 500), 用超纯水透析24 h, 冻干得到白色固体产物BO-PAMAM。
FA-BO-PAMAM的合成 叶酸分子与BO-PAMAM的合成依照文献[11]。称取FA 2 mg溶于4 mL DMF和DMSO的混合溶液中 (3∶1, v/v), 加入5倍当量 的EDC, 室温下活化反应3 h。将活化的反应液逐滴加入到BO-PAMAM的水溶液中, 反应24 h后, 用 大量的水透析24 h, 将透析液冻干得到黄色的固体产物FA-BO-PAMAM。合成路线见图 1。
原料冰片和叶酸分别溶于CDCl3和DMSO- d6, FA-BO-PAMAM溶于D2O中, 配成10 mg·mL−1溶液, 进行1H NMR表征。取FA-BO-PAMAM样品配置成0.5 mg·mL−1水溶液, 用微孔滤膜过滤 (0.45 μm), 收集续滤液, 用纳米粒度−电位分析仪 (DLS) 测定粒径和电位, 平行操作3次。另取少量复合物溶液滴加在铜网上, 待挥干后, 采用透射电镜 (TEM) 观察粒子的形貌特征。
载药准确称取盐酸阿霉素 (DOX·HCl) 1 mg (W0), 溶解于2 mL DMSO和3倍当量TEA的混合溶剂中, 室温搅拌过夜后逐滴加入到各载体的DMSO溶液中, 避光反应24 h。反应结束后, 向反应液中加入超纯水, 再用乙酸乙酯萃取除去游离的DOX, 冷冻干燥后得到深红色的冻干品, 称重 (W)。用紫外分光光度计测定载药复合物在501 nm处的吸光度, 计算载体中所含药量 (W1), 再计算载药量 (drug loading, DL) 和包封率 (encapsulation efficiency, EE)。
$DL\left( \% \right){\rm{ }} = \frac{{{W_1}}}{W}{\rm{ \times }}100\%$ |
$EE{\rm{ }}\left( \% \right){\rm{ }} = \frac{{{W_1}}}{{{W_0}}}{\rm{ \times }}100\% $ |
FA-BO-PAMAM/DOX复合物的PBS溶液2 mL, 放入经预处理的透析袋中, 再将透析袋置于50 mL的pH 7.4和pH 5.5 PBS溶液中, 在37 ℃、100 r·min−1条件下避光振荡, 分别于0.1、0.5、1、2、4、6、8、12、24、30、48和50 h时间点, 取释放介质1 mL, 并补充同温等量的释放介质。同法考察游离的DOX体外释放行为。释放到介质中DOX的浓度用HPLC测定。所有实验重复3次。
细胞培养HBMEC细胞和C6细胞培养于DMEM培养基 (含4.5 g·L−1葡萄糖、3.7 g·L−1碳酸氢钠、 10%胎牛血清、1% 非必需氨基酸、1% 谷氨酰胺、100 u·mL−1青霉素和100 μg·mL−1链霉素)。培养条件: 37 ℃、5% CO2及饱和湿度90%。
载体的细胞毒性实验取处于对数生长期的C6和HBMEC细胞, 以5×103个/孔接种于96孔板, 37 ℃培养24 h后移弃培养液, 分别加入不同浓度的PAMAM、BO-PAMAM和FA-BO-PAMAM继续培养48 h后, 吸去含药培养液, 每孔加入含0.5 mg·mL−1 MTT的无血清培养液0.2 mL, 于37 ℃继续孵育4 h, 吸去含有MTT的培养液, 用PBS清洗2次后, 每孔加入DMSO 0.1 mL, 待溶解均匀后用酶标仪测定吸光度值 (A, 570 nm), 计算细胞活力抑制50% 时的浓度 (IC50)。细胞存活率=A给药孔/A正常孔×100%。所有实验重复3次。
体外跨BBB转运实验体外BBB模型的建立: HBMEC细胞接种于12孔transwell板 (膜嵌套直径12 mm, 平均孔径3 μm, 比表面积1.12 cm2, 美国康宁公司), 细胞数1×105个/孔。培养3天后, 用细胞电阻仪 (Millicell-RES, 美国Millipore公司) 监控并检测跨细胞电阻 (TEER), 只有细胞单层跨细胞电阻超过250 Ω·cm−2才能用于实验研究[12]。
采用D-Hank’s缓冲液作为转运介质研究各个样品的跨膜转运率 (%)。实验时用预先37 ℃保温的D- Hank’s溶液冲洗供体池3次, 在供体池中分别加入含DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和FA-BO- PAMAM/DOX的DMEM培养液 (终浓度相当DOX 20 μmol·L−1), 受体池中加入空白缓冲液, 平行6孔, 继续孵育, 于30、60、90、120、150和180 min在受体池中吸取样品200 μL, 并及时补充等量空白介质。样品经HPLC检测DOX浓度。
细胞摄取实验取处于对数生长期的C6细胞, 以5×105个/孔接种于6孔板, 贴壁生长培养24 h, 然后与含DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和FA- BO-PAMAM/DOX的无血清培养液 (含20 μmol·L−1 DOX) 于37 ℃孵育, 在特定的时间内用4 ℃的PBS (pH 7.4) 清洗并消化, 用流式细胞仪 (Ex 498 nm, Em 550 nm) 测定平均荧光强度对细胞内吞的DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和FA-BO-PAMAM/ DOX进行定量。没有进行任何处理的细胞作为对照, 所有实验重复3次。
载药复合物体外抗肿瘤实验取对数生长期的C6细胞, 以5×103个/孔接种于96孔板, 37 ℃培养24 h后移弃培养液, 分别加入不同浓度的DOX、PAMAM/ DOX、BO-PAMAM/DOX和FA-BO-PAMAM/DOX 继续培养48 h后, 每孔加入含0.5 mg·mL−1 MTT的 无血清培养液0.2 mL, 孵育4 h。采用酶标仪测定A (570 nm), 计算细胞活力抑制50% 时浓度 (IC50)。所有实验重复3次。
统计学方法采用SPSS18分析软件进行独立样本t检验统计分析, 数据以均值 ± 标准差表示。
结果 1 表征FA-BO-PAMAM的核磁图谱见图 2。δ 0.8~1.2峰属于冰片母核3个甲基 (-C-(CH3)2-C-(CH3)-C-O) 的质子峰; δ 6.5、7.5和8.5的3个峰归属于叶酸的质子峰; 另外与PAMAM相关的峰在δ 2.2 (-NCH2CH2CO-)、δ2.5 (-CONHCH2CH2N-)、δ 2.7 (-CONHCH2CH2N-)、δ 2.9 (-NCH2CH2CO-)、δ 3.1 (-CONHCH2CH2NH2) 和δ3.2 (-NCH2CH2NHCO-), 该结果证明了FA-BO- PAMAM合成成功。
FA-BO-PAMAM经DLS测定后, 平均粒径为 (22.28 ± 0.42) nm (n = 3)。在粒径图中 (图 3A), 可以看到167 nm的光强比较高, 但粒径在22 nm左右的粒子占多数, 主要是因为粒子散射光强与其直径的6次方成正比[13]。通过TEM (图 3B) 观察, FA- BO-PAMAM外观呈球形、形态规整和大小基本均匀。但是由于TEM样品处于干燥状态导致粒子聚集, 因此测得的粒径比DLS测得的粒径稍大些。另外, PAMAM、BO-PAMAM和FA-BO-PAMAM的zeta电位分别为 (30.07 ± 2.97)、(11.47 ± 0.46) 和 (7.6 ± 0.89) mV (n = 3), 表明了BO的修饰显著降低了PAMAM表面的电位值。
取各载药复合物冻干粉适量, 用超纯水溶解后测定粒径; 同时采用紫外分光光度计测定A(501 nm处), 计算载药量和包封率。各详细参数见表 1。
体外释放实验考察了FA-BO-PAMAM/DOX在模拟生理环境 (PBS, pH 7.4) 和肿瘤环境 (PBS, pH 5.5) 的释药行为。体外释放曲线见图 4, DOX在体外的释放具有一定的pH敏感性, 随着释放介质pH值降低, DOX的累积释放量增多。原药DOX释放迅速, 在pH为7.4介质中, 4 h内已释放近90%; 在pH为5.5介质中, 4 h内基本释放完全。相比于原药, FA-BO-PAMAM/ DOX释药缓慢, 在pH为7.4和pH为5.5的介质中, 24 h内的累积释放量分别为28.2% 和48.8%, 并且 24 h后平稳释药, 在50 h内累积释药量分别为38.5% 和62.1%。
采用MTT法测定了PAMAM、BO-PAMAM和FA-BO-PAMAM对HBMEC和C6细胞的毒性, 结果见图 5。PAMAM对于HBMEC和C6细胞的毒性都比较大, IC50值分别为1.01和1.37 μmol·L−1。通过冰片修饰后, 对两种细胞的毒性显著降低, 在本浓度范围内没有得到BO-PAMAM和FA-BO-PAMAM的IC50值。BO-PAMAM和FA-BO-PAMAM对细胞的毒性未见显著性差异。
采用HBMEC细胞建立体外的BBB模型来评价DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和FA-BO- PAMAM/DOX不同组的跨膜转运能力。 结果 (图 6) 显示了跨BBB转运180 min后, DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和FA-BO-PAMAM/DOX的转运率分别为4.71%、4.82%、14.17% 和13.35%。且后两组的体外跨BBB转运比率具有一定的时间依赖性。根据统计学结果显示, 冰片的修饰增加了载药复合物体外跨BBB的转运率, 而叶酸的修饰对跨BBB转运率没有明显的影响。
采用流式细胞仪定量药物载体的摄取量, 评价叶酸的靶向性。结果 (图 7) 显示, 在相同的DOX浓度下, 孵育相同的时间, C6细胞对不同组的摄取量大小顺序依次为: FA-BO-PAMAM/DOX > DOX > PAMAM/DOX > BO-PAMAM/DOX, 且各组之间的差异具有统计学意义, 说明叶酸的修饰增加了C6细胞对载药复合物的摄取, 表明了叶酸对肿瘤细胞表面的叶酸受体具有较高的亲和力; 另外, C6细胞对BO-PAMAM/ DOX组的摄取量比PAMAM/DOX组少, 揭示了细胞摄取与载体表面的电荷具有一定的相关性。
原药DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和FA-BO-PAMAM/DOX对C6细胞的毒性见图 8。相比原药DOX, 各载药复合物的毒性降低, IC50值分别为0.73、6.17和2.48 μmol·L−1, 而DOX的IC50值为0.17 μmol·L−1。不同于BO-PAMAM, FA-BO-PAMAM对C6细胞的抑制率更大, 且差异具有显著性意义, 表明叶酸的修饰增加了肿瘤细胞对载药复合物的摄取量。
本文结合叶酸、冰片的性质和聚酰胺−胺的特性合成了新型纳米载体FA-BO-PAMAM, 并且利用该载体包载DOX, 从而实现减轻载体本身毒性、增加药物的BBB透过性和提高对脑胶质瘤靶向性的作用。有研究表明, 药物载体的粒径在10~100 nm内, 有利于治疗脑部肿瘤。当粒径小于5 nm时, 纳米粒极易被肾脏清除; 粒径大于100 nm时, 不能被肿瘤脉管系统识别[14]。本实验中载药复合物的粒径在25 nm左右, 具有治疗脑胶质瘤的优势。
体外释放实验结果表明, 在不同的pH介质下, DOX从FA-BO-PAMAM载体中的释放情况具有一定的pH敏感性。该结果可能与DOX自身的溶解性随pH值的降低而增加有关。另外冰片和叶酸修饰后的PAMAM载体表面还保留了小部分的正电性, 随着pH值的降低, 表面电荷密度增大, 分子之间的排斥力增加, 从而使得DOX更容易从载体中释放[15]。
通过MTT实验考察药物载体对于正常细胞HBMEC和肿瘤细胞C6的毒性, 从实验的结果中可知, PAMAM功能化修饰冰片显著地降低了载体表面的毒性, 而叶酸的修饰对载体的毒性没有明显影响, 主要与冰片修饰后降低PAMAM表面大量的氨基数目有关。另外体外跨BBB转运实验进一步证明了冰片的修饰增加了载药复合物的跨BBB膜转运率, 是冰片未修饰的载药复合物的3倍多。该结果证明了冰片促血脑屏障开放的作用不仅局限于冰片与药物或纳米载药复合物共用, 进一步拓展了冰片促血脑屏障开放的研究内容。然而, 对于冰片促血脑屏障开放的机制在至今的研究中尚未明确, 还有待于进一步研究。综合考虑细胞毒性和体外跨BBB转运实验结果, 证实了冰片修饰的PAMAM作为脑靶向载体的潜能。相比于采用聚乙二醇或脂肪酸等修饰[16, 17], 小分子化合物冰片的修饰简化了合成过程, 在减轻载体本身毒性的同时达到了增加载药复合物入脑递送的双重作用。
细胞摄取实验结果表明, C6细胞对载药复合物的摄取与载体表面的电位值有关, 冰片的修饰降低了PAMAM表面的电荷从而降低了C6细胞对BO- PAMAM/DOX的摄取。叶酸的进一步修饰增加了C6细胞对FA-BO-PAMAM/DOX的摄取, 表明了叶酸分子对肿瘤细胞具有一定的亲和性。另外结合体外抗肿瘤实验结果, 虽然C6细胞对于FA-BO-PAMAM/DOX的摄取量较DOX多, 但DOX对C6细胞的毒性最大, 这主要与DOX扩散渗透进入细胞、聚集于细胞核发挥毒性作用有关。然而, 由于BBB的存在和较短的血循环时间, DOX在体内药效受到了极大的限制。另外, 相比于原药DOX, FA-BO-PAMAM/DOX对C6细胞的毒性较小, 与DOX从载体中的释放具有缓慢持久的特性有关, 随后释放的DOX转移至细胞核, 发挥对肿瘤细胞的毒性作用[18]。PAMAM/DOX对C6
细胞的毒性较大主要是由于释放的DOX与未修饰的PAMAM载体本身的毒性共同作用所致。因此综合考虑上述实验结果, FA-BO-PAMAM/DOX减轻了载体本身毒性的同时达到了提高药物透过BBB及增加了药物在肿瘤部位蓄积量的目的。
总之, 在本文中制备的FA-BO-PAMAM/DOX发挥了对脑胶质瘤的逐级靶向作用。首先冰片促进载药复合物的BBB透过性; 其次叶酸受体介导的内吞促使C6细胞对载药复合物的摄取; 最后DOX在酸性的肿瘤环境释放, 转移至细胞核, 发挥抑制和杀死C6细胞的作用。
综上所述, 采用冰片和叶酸共修饰PAMAM树状大分子, 并包裹抗癌药物DOX, 首次构建了FA- BO-PAMAM/DOX纳米递药系统, 提供了一种利用PAMAM作为药物载体的新方法, 丰富了冰片促血脑屏障开放的研究内容, 为脑胶质瘤的治疗开辟了一条新途径。
致谢: 浙江中医药大学动物实验研究中心的屠珏研究员对于细胞实验提供的技术帮助; 浙江大学化学系的陈芳研究员在TEM表征方面提供的帮助; 浙江中医药大学基础医学院的张继达研究员在NMR表征方面给予的热情帮助。
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