药学学报  2015, Vol. 50 Issue (6): 719-724   PDF    
新型L-脯氨酸类化合物的设计、合成及其对乙酰胆碱酯酶的抑制活性研究
田云锋, 陈俊涛, 李俊杰, 张颖超, 曹婷婷, 马正月     
河北大学药学院, 河北省药物质量分析控制重点实验室, 河北 保定 071002
摘要:本文设计、合成了14个新型L-脯氨酸类化合物, 并考察了它们对乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性.以α-溴代苯乙酮为原料, 经过4步反应, 合成了新型L-脯氨酸类化合物; 并采用Ellman分光光度法测试了它们对乙酰胆碱酯酶的体外抑制活性.测试结果表明, 目标化合物具有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性, 其中化合物8b的抑制活性最好, 其IC50达到了5.45 μmol·L-1, 优于对照药利斯的明.L-脯氨酸类化合物对乙酰胆碱酯酶具有较好的抑制活性, 值得进一步研究.
关键词L-脯氨酸类化合物     乙酰胆碱酯酶     阿尔茨海默病    
Design, synthesis and evaluation of new L-proline derivatives as acetylcholinesterase inhibitors
TIAN Yun-feng, CHEN Jun-tao, LI Jun-jie, ZHANG Ying-chao, CAO Ting-ting, MA Zheng-yue     
Key Laboratory of Drug Quality Control of Hebei Province, College of Pharmaceutical Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China
Abstract: In this paper, fourteen new L-proline derivatives were designed and synthesized, and their acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activities were also investigated in vitro. New L-proline derivatives were prepared from substituted 2-bromo-1-acetophenones through four-step reaction; and their bioactivities as AChE inhibitors were measured by Ellman spectrophotometry. The results showed that the target compounds had a certain AChE inhibitory activity to in vitro. The bioactivity of compound 8b was the best of them, and its IC50 value was 5.45 μmol·L-1, which was better than that of rivastigmine. So the acetylcholinesterase inhibitory activities of new L-proline derivatives were worth to be further studied.
Key words: L-proline derivative     acetylcholinesterase inhibitor     Alzheimer's disease    

随着全球人口的急剧老龄化, 神经退形性疾病已成为一个严重的问题。在这些疾病中, 阿尔茨海默病已经成为人类晚年精神衰竭的最普遍的形式[1]。阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD) 是以大脑中β-淀粉样蛋白老年斑 (SPs) 沉淀、神经纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs) 和突触及神经元缺失为特征的一种疾病。根据国际阿尔茨海默病协会2011年公布的调查结果显示, 全球约有3 650万人患有AD, 且患病率随年龄增长而增加[2]。研究发现, 目前AD主要有3种特征性的病理表现: 神经传递基质乙酰 胆碱水平的降低[3]、患者大脑小半鞘翅中β-淀粉样蛋白增加[4, 5]和Tau蛋白 (含量最高的微管相关蛋白) 的过度磷酸化[6]。人们还在为探索AD的病因做着更多、更新的研究[7, 8, 9, 10, 11]。科学家们一直都在试图通过对上述3种主要病理特征的深入研究来找到AD的病因以及治疗策略[12, 13]。但AD病因相当复杂, 其发病机制涉及到各个方面。人们提出了细胞凋亡学说、AD病原体假说[14]、炎症学说、基因调控异常学说等, 研究发现人体内L-谷氨酸、雌性激素、自由基、神经营养因子和铝元素等与AD的发生有一定关系, 但这些病理机制的可靠性还需要进一步的研究证实。

由于AD的病因、病理尚不明确, 无法用现有的药物进行根治, 只能以预防和缓解症状为主。目前治疗AD的药物主要为抑制乙酰胆碱酯酶降解的乙酰胆碱酯酶抑制剂, 现用于临床上治疗AD的主要药物有他克林 (tacrine)、多奈哌齐 (donepezil)、加兰他敏 (galantamine)、利斯的明 (rivastigmine)、石杉碱甲 (huerzine A) 和美曲磷酯 (metrifonate)。已经开发的这些药物无法完全满足临床需求, 需要进一步开发新的药物。

本实验室近来合成了一新化合物I (图 1), 在抑制乙酰胆碱酯酶 (AChE) 活性方面有一定的效果[15]。本文将在化合物I的基础上, 对其结构进行改造, 将化合物IA部分替换成A1, 即在酰胺基团和碳链之间引入L-脯氨酸, 合成新的化合物II (图 1), 并考察它们对AChE的抑制作用。其主要思路为引入1个手性氨基酸, 形成1个手性的二肽链, 以此来探究具有手性中心的二肽是否能影响其乙酰胆碱酯酶抑制活性, 为新的乙酰胆碱酯酶抑制剂的开发做探索性研究。化合物II的合成路线如合成路线1所示。

Figure 1 The structures of compounds I and II

Scheme 1 Chemical structure of famitinib
结果与讨论 1 目标化合物的合成

合成的化合物结构经1H NMR、HR-MS及IR得以确证, 理化数据见表 1、2。

Table 1 NMR data of compounds 38, 5b8e

Table 2 Physical property and spectral data of compounds 38, 5b8e
2 乙酰胆碱酯酶体外抑制活性

为了评价化合物的生物活性, 进行了AChE体外抑制活性实验。测试结果表明, 制备的14个化合物中7个具有生物活性。其中化合物8b对乙酰胆碱酯酶的抑制活性最好, 其IC50值达到了5.45 μmol·L−1, 优于对照药利斯的明, 但与先导化合物对比并没有增强其抑制活性。结果表明具有手性中心的二肽的引入减弱了先导物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。

图 2所示, 苯环上R1取代基、含N的官能团R2和碳链X都对AChE的抑制活性有重要影响。表 3数据显示具有一定生物活性的化合物为5b5e6a6b8a8b8e。通过化合物的结构对比, 上述几个化合物中活性比较好的5b6b8b都含有吡咯基; 6b8b的生物活性大于5b7b, 由此推测碳链X为亚乙基活性普遍增强; 化合物8b几乎是6b抑制活性的10倍之多, 由此推测苯环对位含有甲氧基基团的化合物活性较好。

Figure 2 The structure of Compound II

Table 3 Inhibition of AChE activity by target compounds

另外选择对AChE抑制活性较好的化合物做了相应的丁酰胆碱酯酶 (BuChE) 体外抑制活性实验, 并与对照药进行了对比, 对BuChE抑制活性如表 4所示。本实验中对AChE抑制活性较好的化合物, 对BuChE抑制效果不佳, 因此选择性相对较好。

Table 4 Inhibition of BuChE activity by target compounds
3 小结

本研究合成的大部分新型L-脯氨酸类化合物都具有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性。其中化合物8b的生物活性最好, IC50值达到了5.45 μmol·L−1, 其活性优于对照药物利斯的明; 与先导物的生物活性对比, 引入L-脯氨酸后的化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性减弱。但此类化合物也有一定的生物活性, 其主体结构值得进一步研究。

实验部分

所有实验材料除另作说明外, 均为市售。乙酰胆碱酯酶 (电鳗) 购自Sigma公司; 卡巴拉汀购买于武汉鼎辉化工有限公司; 石杉碱甲购自上海源叶生物科技有限公司。用SGW X-4显微熔点仪测定熔点 (上海精密科学仪器有限公司, 温度未校正)。1H NMR由Bruker AVANCE600核磁共振仪 (TMS做内标) 测定。高分辨率 (HR-MS) 数据由Bruker apex ultra 7.0 T傅里叶变换型质谱仪测定。红外光谱采用FTIR-8400S傅里叶变换红外分光光度计测定。96孔板读取用1420 Victor酶标仪。

1 化合物的合成 1.1 化合物12的合成

参见文献[16]

1.2 化合物34的合成 (3合成为例)

取20 mmol化合物1、20 mmol Boc-L-脯氨酸和40 mmol三乙胺置于500 mL的圆底烧瓶中, 用83 mL二氯甲烷溶解, 室温下反应24 h。旋干有机溶剂后, 加入50 mL 10% 柠檬酸水溶液, 搅拌30 min, 抽滤, 晾干, 得到白色固体, 将其加入含有甲苯的三颈瓶中搅拌, 随后通入HCl气体, 脱去Boc。随着HCl气体的通入, 化合物溶解, 然后随着HCl气体的通入又有白色沉淀产生, 当白色沉淀不再增加, 停止通HCl气体, 抽滤晾干得到化合物3。同法合成化合物4, 物理和光谱数据见表 12

1.3 化合物58的合成 (5合成为例)

取10 mmol化合物3和15 mmol三乙胺, 溶于30 mL二氯甲烷, 然后将15 mmol酰氯的二氯甲烷 (50 mL) 溶液缓慢滴入反应体系中, 冰浴条件下搅拌。滴加完毕后, 冰浴条件下继续搅拌1 h。用20 mL水洗涤3次, 收集有机相, 用无水硫酸钠干燥。旋干有机溶剂, 剩余物用硅胶色谱柱纯化 (洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚, 体积比为1∶4), 得到白色化合物5。同法合成化合物68, 物理和光谱数据见表 12

1.4 化合物5b8e的合成 (以5b合成为例)

取 5 mmol化合物5溶于乙腈, 加入6 mmol四氢吡咯、10 mmol碳酸钾和0.5 mmol碘化钾, 加热回流。反应2 h后停止反应, 静置冷却, 然后减压旋干溶剂。残 余物用50 mL饱和碳酸氢钠溶液调节pH 8~9, 而 后用30 mL二氯甲烷萃取3次, 合并有机相, 旋干溶剂。剩余物经硅胶色谱柱 (洗脱剂为甲醇与二氯甲 烷, 体积比1∶20) 分离纯化得到棕色固体5b。同法合成化合物5b8e, 物理和光谱数据见表 12

2 体外AChE抑制实验

采用Ellman分光光度法[17]在体外考察化合物对电鳗乙酰胆碱酶的抑制作用, 同时用空白组, 利斯的明、石彬碱甲为阳性对照组进行实验。配制Tris缓冲液pH为7.2, 底物ACTI的浓度为0.6 mmol·L−1, 显色剂DTNB的浓度为3 mmol·L−1, 电鳗AChE总量为0.035 U, 抑制剂的配置浓度分别为1×10−5、1×10−6、1×10−7、1×10−8、1×10−9mol·L−1。分别取20 μL Tris缓冲液、10 μL电鳗AChE、10 μL各浓度的抑制剂于96孔板中, 37 ℃下保温12 min, 然后加入10 μL底物ACTI和50 μL的显色剂DTNB, 5 min后使用1420 Victor多标计数仪在405 nm处读取每孔吸光度。空白组用10 μL Tris缓冲液分别代替底物和抑制剂, 标准组用10 μL Tris缓冲液代替抑制剂, 每个化合物在不同浓度均实验3次, 然后以抑制率I (I = 100×(AA)/(AA)%) 对抑制剂浓度C作图, 进行S型曲线线性拟合, 得到半数抑制率IC50对应的浓度Cx, 为了得到准确的IC50, 然后从1×10−5~1×10−9mol·L−1中选择最接近Cx的浓度1×10−x mol·L−1, 且1×10−x mol·L−1小于Cx。配制1×10−x、3×10−x、5×10−x、7×10−x、9×10−xmol·L−1, 同法操作酶抑制实验, 然后以抑制率I对抑制剂浓度C作图, 进行直线线性拟合, 求出IC50

3 体外BuChE抑制实验

取5 mL静脉人血, 室温静置1 h, 4 ℃下放置 2 h。离心10 min (2 000 r·min−1), 取上清液, 用做丁酰胆碱酯酶酶液。其实验具体操作方法与乙酰胆碱酯酶酶活力测定方法相同, 将乙酰胆碱酯酶酶活力测定中的底物碘化硫代乙酰胆碱换成碘化硫代丁酰胆碱即可。

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