药学学报  2015, Vol. 50 Issue (6): 714-718   PDF    
LC-MS/MS法定量测定人血浆和尿液中西格列汀浓度及其应用
赵芊, 王博雅, 江骥, 胡蓓     
中国医学科学院&北京协和医学院, 北京协和医院临床药理研究中心&转化医学中心, 北京 100730
摘要:建立快速、灵敏的LC-MS/MS法定量测定人血浆和尿液中西格列汀浓度, 并用于首次在中国人群中评价单次和多次给药后西格列汀片药代动力学特征的研究.血浆样品经液液萃取、尿液样品经直接稀释后, 以甲醇-水 (85:15) 作为流动相, 采用ESI离子源MRM质谱扫描模式对血浆和尿液中的西格列汀浓度进行 定量检测.研究结果表明, 西格列汀血浆和尿液浓度测定方法的线性范围分别为0.5~1 000 ng·mL-1和0.2~100 μg·mL-1、日内/日间准确度分别为98.98%~103.69% 和97.63%~102.29%.日内/日间精密度 < 5.51% 和 < 4.26%.西格列汀母液在-30 ℃条件下可稳定放置55天; 经过预处理的血浆和尿液样品在自动进样器中 (15 ℃) 可稳定放置24 h; 血浆和尿液样品中的西格列汀在室温放置24 h、反复冻融3次 (-30 ℃至室温) 以及-30 ℃条件下冻存40天的情况下, 能够保持良好的稳定性.西格列汀的血浆提取回收率为71.1%, 无明显基质效应.本方法专属性强、灵敏度高、快速, 满足生物分析的法规要求, 可用于西格列汀的药代动力学研究.
关键词西格列汀     LC-MS/MS     定量    
Quantification of sitagliptin in human plasma and urine by LC-MS/MS method and its application
ZHAO Qian, WANG Bo-ya, JIANG Ji, HU Pei     
Clinical Pharmacology Research Centre & Translational Medicine Centre, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China
Abstract: A rapid and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) method for quantification of sitagliptin in human plasma and urine had been developed. This method was applied to the pharmacokinetics study of sitagliptin tablet after single- and multiple-dosing in Chinese population. Plasma samples were prepared by a liquid-liquid extracted method, and urine samples were diluted. Compounds were analyzed by multiple reaction monitoring (MRM) mode with a electrospray ionization (ESI) interface. Mobile phase consisted of methanol and water (85:15, v/v). The linear concentration range of calibration curve was 0.5-1 000 ng·mL-1 and 0.2-100 μg·mL-1, intra-run/between-run accuracy was 98.98%-103.69% and 97.63%-102.29%, intra-run/between-run precision was < 5.51% and 4.26% for plasma and urine sample, respectively. The stability of sitagliptin stock solution was tested for 55 days at -30 ℃. Sitagliptin was stable when stored under the following conditions: 24 hours in the autosampler after sample preparation; 24 hours at room temperature, after 3 freeze and thaw cycles (from -30 ℃ to room temperature), 40 days at -30 ℃ for plasma and urine samples. The absolute recovery in plasma was 71.1%, and no matrix effect was founded. This method was proved simple, specific, sensitive, rapid and suitable for pharmacokinetics study of sitagliptin in human being.
Key words: sitagliptin     LC-MS/MS     quantification    

西格列汀 (sitagliptin) 是口服的强效二肽基肽酶IV (DPP-IV) 选择性抑制剂,用于治疗2型糖尿病。该药在许多国家和地区均已批准上市,如美国、欧盟和一些亚洲国家。目前,已有文献[1, 2, 3]评价了西格列汀在高加索人和日本人中单次和多次给药后的药代动力学特征, 但在我国尚未见相关报道。目前国内外有关西格列汀的测定方法较少, 国内文献[4]报道使用HPLC紫外检测法测定西格列汀片中药物的浓度, 由于检测目的不同, 该方法灵敏度低 (230 μg·mL−1), 不能用于西格列汀人体血药浓度的测定。Swales等[5]报道使用激光二极管热解吸−大气压力化学离子化串联质谱 (laser diode thermal desorption interfaced with atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry, LDTD-APCI-MS/MS) 法测定小鼠和人干血片中西格列汀的药物浓度, 灵敏度为5 ng·mL−1; Zeng等[6]报道使用高效液相色谱串联质谱 (Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS) 法测定经蛋白沉淀处理的人血浆中 西格列汀浓度, 方法灵敏度为1 ng·mL−1; Uçaktürk 等[7]报道使用气相色谱法 (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 测定人尿液中西格列汀浓度, 灵敏度为50 ng·mL−1, 但该方法在样品前处理时需要进行衍生化处理, 耗时费力; 另有文献[8]报道测定西格列汀制剂浓度, 灵敏度在μg级。

本文首次在国内建立了LC-M/MS定量测定人血浆和尿液中西格列汀浓度的方法, 用于西格列汀片在中国健康受试者体内的药代动力学研究。本方法也可为建立西格列汀的质量控制方法提供参考。

材料与方法 药品与试剂

西格列汀对照品由默沙东 (美国) 制药有限公司提供, 纯度100% (批号L-000224715); 内标 (西格列汀结构类似物, MK-II) 对照品由默沙东 (美国) 制药有限公司提供 (批号L-000390308- 002R004)。甲醇和乙腈为色谱纯, 购自美国Burdick & Jackson公司; 乙酸乙酯为分析纯, 购自北京化学试剂公司。西格列汀片由默沙东 (中国) 制药有限公司提供, 规格为每片10 0 mg (批号WL00028175)。6个不同个体的空白人血浆和尿液样品由北京协和医院临床药理研究中心提供。

仪器

API-4000型三重串联四级杆质谱仪: 美国Applied Biosystems公司, 配备电喷雾离子源 (electrospray ionization, ESI) 以及Analyte 1.5.1数据处理软件; DGU-20A型高效液相色谱仪: 日本岛津公司, 包括LC-20AD型二元泵、SIL-20AC型自动进样器、CTO-20A型柱温箱和SCL-10Avp型控制器; 本研究所用其他设备还有Mettler AX-150型十万分之一分析天平、Heraeus Pico型台式离心机和Millipore Q型纯水机等。

色谱质谱条件

选用Waters公司Atlantis 5 µm色谱柱 (4.6 mm × 100 mm), 流动相由甲醇和纯水组成 (85∶15, v/v), 流速1.0 mL·min−1 (分流比为1∶5, 入∶出), 柱温为室温 (约25 ℃), 每个样品的检测时间为2.8 min。选用ESI离子源, 在正离子电离模式下采用多反应监测 (multiple reaction monitoring, MRM) 的质谱扫描方式检测, 采用内标法定量西格列汀的浓度。西格列汀和内标的检测母→子离子对的质荷 比 (m/z) 分别为: 408.3→234.8和422.1→248.9, 结构见图 1。碰撞气 (CAD) 为7 units、气帘气 (CUR) 为14 units、雾化气GS1为30 units、GS2为50 units、电离电压 (IS) 为5 000 V、离子源温度 (TEM) 为350 ℃、碰撞能 (CE) 为25 V、扫描时间为200 ms。

Figure 1 Structures of precursor ion and daughter ion for sitagliptin (A) and internal standard (B)
血浆和尿液样品处理

血浆样品: 冰冻血浆 样品在室温下解冻30 min, 在涡旋振荡器上混匀 30 s。取100 μL血浆样品, 加入50 μL内标水溶液 (50 ng·mL−1), 振荡后加入600 μL乙酸乙酯, 充分振荡1.5 min, 使化合物和内标被充分提取。在13 000 r·min−1 (约2 000×g) 条件下离心10 min, 使有机相与下层分离。吸取上层有机相400 μL, 转移至干净的玻璃管中。在氮气吹干仪上35 ℃水浴将样品吹干, 然后用甲醇−水 (70∶30) 溶液400 μL复溶。振荡混匀1 min后, 13 000 r·min−1 (约2 000×g) 条件下离心3 min, 进样5 μL测定。尿液样品: 冰冻尿液样品在室温下解冻30 min, 之后在涡旋振荡器上混匀30 s。取50 μL尿液样本, 加入50 μL内标 (25 µg·mL−1水溶液), 振荡后, 加入甲醇−水 (70∶30) 溶液900 μL, 充分混匀1 min。从上述溶液中吸取20 μL, 再加入甲醇−水 (70∶30) 溶液980 μL, 充分混匀1 min。13 000 r·min−1 (约2 000×g) 条件下离心3 min, 5 μL进样测定。

方法学考核

特异性 按上述样品处理和检测条件, 测定6个不同个体的空白人血浆和尿液 (double blank) 样品、空白血浆和尿液加入内标工作液 (blank)、定量下限 (lower limit of quantitation, LLOQ)、以及含西格列汀的临床未知血浆和尿液样品的质量色谱图。在获得的质量色谱图中观察保留时间处有无干扰峰。

标准曲线 分别在3个分析批中检测西格列汀血浆 (浓度为0.5、1、2、10、50、100、500、800和1 000 ng·mL−1) 和尿液 (浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、50和100 µg·mL−1) 标准曲线样品, 以待测 物与内标的峰面积之比为Y, 浓度为X, 进行线性拟合。权重系数1/X2, 标准曲线的曲线回归方程为Y = aX + b

最低定量限 以血浆和尿液标准曲线的最低浓度点作为本方法的最低定量限 (LLOQ), 按照上述方法处理并测定5个, 计算日内精密度和准确度。

准确度与精密度 从低至高3种不同浓度的质控样品 (血浆: 1.5、150和750 ng·mL−1; 尿液: 0.5、50和80 µg·mL−1), 按照上述方法处理并测定5个, 连续3批, 计算日内和日间精密度和准确度。

稳定性 母液稳定性: 母液 (1 mg·mL−1) 在 −30 ℃放置55天后测定, 并与新制备的母液进行比较, 考察其稳定性。自动进样器放置稳定性: 3个浓 度的血浆和尿液质控样品处理后在自动进样器中 (15 ℃) 放置24 h后, 用新制备的标准曲线进行测定, 考察其在自动进样器中放置后浓度有无变化。冻融、室温放置、长期储存稳定性: 3个浓度的血浆和尿液质控样品从−30 ℃至室温冻融3次、室温 (25 ℃) 放置24 h、−30 ℃放置40天后制备并用新制备的标准曲线进行测定, 与理论浓度进行比较。

血浆提取回收率和基质效应 从低至高3种不同浓度的质控样品, 处理并平行测定5个 (A样), 与经过样品前处理后的空白样品作为溶剂配制的相同浓度溶液 (B样, 配制溶液时, 所用的母液体积小于经过样品前处理后的空白样品体积的1%) 的测定结果进行比较, 计算萃取回收率。B样和相同浓度标准品溶液 (C样) 的测定结果进行比较, 计算基质效应。各浓度质控样品的血浆提取回收率和基质效应一致。

临床试验设计

16名中国健康受试者 (男女各半) 入选单次和多次口服100 mg西格列汀片的药代动力学试验, 试验方案经北京协和医院伦理委员会批准, 受试者签署了书面的知情同意书。采用开放、平行的试验设计, 受试者在给药日早上空腹 (禁食10 h) 口服西格列汀片100 mg, 给药日为: 第1、4、5、6、7、8、9天。采集受试者第1、9天的给药前和给药后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、16、24、32、48、72 h的肘静脉血4 mL; 以及给药前0 h、给药后0~6 h、6~12 h和12~24 h的分段尿液。

血样本在取血后30 min内于4 ℃、1 500×g条件下离心10 min分离出血浆。血浆和尿液样品在 −80 ℃条件下冷冻保存用于西格列汀浓度测定, 从而进行药代动力学分析, 计算有关药代动力学参数。

结果 1 方法学考核 1.1 特异性

按选定的HPLC-MS/MS条件, 测得的空白血浆和尿液、空白血浆和尿液加入内标工作液、定量下限和未知临床样品的质量色谱图分别见图 2A~2H。由图可见, 在本实验条件下对待测物的分离和测定无干扰。

Figure 2 Chromatograms of sitagliptin in human plasma and urine (upper: sitagliptin; lower: internal standard). A: Double blank plasma; B: Blank plasma (Double blank plasma spiked with internal standards (50 ng·mL−1); C: Lower limit of quantitation (LLOQ) of plasma;D: Unknown plasma sample from clinical study; E: Double blank urine; F: Blank urine (25 μg·mL−1); G: LLOQ of urine; H: Unknown urine sample from clinical study
1.2 标准曲线

结果表明: 血浆和尿液中西格列汀分别在0.5~1 000 ng·mL−1和0.2~100 µg·mL−1内, 其峰面积与内标峰面积的比值具有良好的线性关系。在方法学考核期间各标准曲线的相关系数 (r) 值均在0.990~1.000之间。

1.3 最低定量限

血浆和尿液中西格列汀的最低定量限分别为0.5和0.2 µg·mL−1。血浆LLOQ的日内精密度和准确度分别为97.6% 和9.9%, 尿液LLOQ的日内精密度和准确度分别为107.8% 和4.1%。

1.4 准确度与精密度

测得血浆、尿液质控样品的日内/日间精密度和准确度, 结果见表 1

1.5 稳定性

结果表明在所述各实验条件下血浆和尿液中西格列汀测定的准确度分别为92.4%~107.6%和92.0%~112.4%, 精密度分别<10.2% 和<6.0%, 稳定性良好。

1.6 血浆基质效应和萃取回收率

以峰面积比值计算萃取回收率和基质效应, 西格列汀的提取回收率为71.1%。西格列汀和内标的基质效应分别为100.5% 和101.0%, 不存在明显的基质效应。

Table 1 Precision and accuracy of the determination of sitagliptin in human plasma and urine samples. n = 5, x ± s
2 人体药代动力学研究

16位中国健康男性和女性受试者 (性别比例为1∶1) 单次和多次口服西格列汀片100 mg后, 西格列汀的平均血药浓度−时间曲线见图 3。结果显示: 给药后西格列汀血药浓度迅速上升, 于给药后3 h左右达到峰浓度。多次给药达到稳态后, 西格列汀在体内没有明显蓄积。使用WinNonlin 5.2软件非房室模型计算的单次给药和稳态时西格列汀在中国健康受试者体内的达峰浓度分别为 (0.39 ± 0.11) μg·mL−1和(0.39 ± 0.10) μg·mL−1; 半衰期分别为 (10.80 ± 2.39) h和 (10.40 ± 1.69) h; 药时曲线下面积 (AUC0−∞) 为(3.17 ± 0.49) μg·mL−1·h和 (3.41 ± 0.49) μg·mL−1·h; 表观清除率分别为 (32.20 ± 4.51) L·h−1和 (29.80 ± 3.66) L·h−1; 表观分布容积分别为 (496.00 ± 108.96) L和(445.00 ± 81.18) L; 稳态时24 h尿药累积排泄率约为给药剂量的73.4%, 提示通过尿液排泄是西格列汀从体内清除的主要途径。

Figure 3 Mean plasma concentration of sitagliptin over time after po single- and multiple-dose of sitagliptin tablet 100 mg in 16 healthy Chinese volunteers
讨论

目前国内尚未见报道血浆中西格列汀的检测方法, 本文建立的LC-MS/MS法定量测定人血浆和尿液中西格列汀的浓度具有更高的灵敏度、样品处理方法简单快捷。通过比较乙酸乙酯、正己烷、乙醚等有机溶剂液液萃取的效果, 发现乙酸乙酯萃取效率最高, 且易于吹干和后续制备。流动相中无需加入有机酸, 减少了有机酸对色谱柱的损伤。通过系统的方法学考察, 本方法能够满足生物分析的需求, 可用于西格列汀片在中国人群中的药代动力学研究。

参考文献
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