阿霉素 (doxorubicin,DOX) 属蒽醌类抗生素,是一种高效、广谱的抗肿瘤药,临床广泛应用于白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肉瘤等^{[1, 2]}肿瘤疾病的治疗,是治疗癌症强有力的药物。临床报道显示使用阿霉素化疗的病人常发生心脏毒性、骨髓抑制、肝、肾功能损伤^{[3, 4]}等不良反应,其中以心脏毒性较明显,且呈剂量依赖性。因此在毒理学研究中常用于心脏毒性动物模型制备^{[4, 5, 6]}。病理学研究发现阿霉素还可引起SD大鼠肝脏细胞核溶解,肝血窦扩大^[7]。研究^{[8, 9]}发现阿霉素的肝脏毒性机制与肝脏转氨酶代谢异常、脂质代谢异常有关。

代谢组学通过高通量分析方法 (如LC-MS、GC- MS和NMR) 对生物体液 (如尿液和血液)、细胞或组织进行系统分析, 检测其中的内源性小分子代谢产物, 并利用模式识别方法进行分类和预测, 确定相关的生物标志物, 对样本的整体代谢状态做出评价。目前代谢组学广泛应用于毒理学、疾病诊断、药物作用机制研究、新药研发等领域^[10], 如Xie等^[11]研究三聚氰胺急性肾毒性的代谢变化, Li等^[12]应用UPLC- QTOF/MS代谢组学技术研究佛手散对血虚小鼠养血补血机制等。目前对阿霉素肝脏毒性的代谢组学研究较少, Price等^[13]发现阿霉素可引起SD大鼠肝脏氨基酸含量发生变化, 但未关注肝脏其他成分的代谢并深入探究引起变化的原因。本研究拟采用基于¹H NMR技术的代谢组学方法, 对阿霉素诱导大鼠肝脏内源性代谢物进行分析, 从代谢的角度阐明阿霉素肝毒性的作用机制。

Bruker 600-MHzAVANCE III核磁共振检测仪 (德国布鲁克公司); TGL-16高速台式冷冻离心机 (湖南湘仪离心机仪器有限公司); 超声波细胞粉碎机 (宁波新芝生物科技股份有限公司); KYJ-3氮吹仪专用空气源 (北京斯珀特科技有限公司); Sartorius BSA124S分析天平 (德国Sartorius公司)。阿霉素 (注射用盐酸多柔比星, 浙江海正药业股份有限公司, 批号: 130401); 三甲基硅烷丙酸钠盐 (TSP, CambridgeIsotope Laboratories Inc., MA); NMR试剂重水 (Norell, Landisville, USA);乙腈 (天津市登丰化学品有限公司); 娃哈哈纯净水。

SPF级雄性SD大鼠, 体重 (200 ± 20)g, 北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 动物许可证号SCXK(京) 2011-0012; 动物饲养室保持温度 (23 ± 1.5) ℃, 相对湿度 (45 ± 15)%。动物适应1周后进行实验。

阿霉素给药参考文献方法^[7]。大鼠随 机分为两组: 空白组 (n = 10)和模型组 (n = 16),模型组隔日腹腔注射阿霉素, 给药方案为: 第1、3天, 1 mg·kg⁻¹; 第5、7天, 2 mg·kg⁻¹;第9、11天, 3 mg·kg⁻¹; 第13、15天, 4 mg·kg⁻¹。空白组腹腔注射等体积生理盐水, 实验期间动物自由饮食饮水。给药结束后, 用4% 的水合氯醛 (0.8 mL·100 g⁻¹) 麻醉大鼠, 取出肝脏, 称重, 保存于−80 ℃备用。

称取肝左叶200 mg于2 mL EP管中, 加入50% 乙腈1 000 μL, 低温匀浆, 4 ℃、13 000 r·min⁻¹离心15 min, 上清液转移置5 mL EP管中, 低温空气干燥,复溶于含0.01% TSP的磷酸盐 (含D₂O, 0.1 mol·L⁻¹, pH 7.4) 缓冲液, 离心 (4 ℃、13 000 r·min⁻¹、15 min), 取上清液600 μL转移至5 mm核磁管中。

样品于600 MHzNMR (25 ℃)仪上测定, 采用noesygppr1d脉冲序列, 扫描次数为64, 谱宽12 345.7 Hz, 脉冲时间14 μs, 采样时间2.654 s, 延迟时间1.0 s, 采样数据点65 536, FID分辨率0.188 Hz, 采样间隔40.5 μs, 内标为TSP。

核磁图谱采用MestReNova (version 8.0.1, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, Spain) 软件处理。核磁图谱以TSP (δ 0.00) 定标、经相位、基线校准后, 以δ 0.01积分段对δ 0.50～9.70区间进行积分。图谱中δ 4.70～5.03不进行积分, 以消除残余水峰的影响。积分数据采用归一化处理, 用于多元统计分析。采用SIMCA-P 13.0 (Umetrics,Sweden) 软件将积分数据标准化后,进行主成分分析 (principalcomponent analysis, PCA), 偏最小二乘法判别分析 (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析 (Orthogonal PLS-DA, OPLS-DA)。使用SPSS16.0软件进行统计学处理, 两组间比较采用独立样本t检验。代谢通路 可视化分析采用MetPA (http://metabolomics.ca) 软件, 结合KEGG数据库 (Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes) 对涉及的相关代谢通路进行初步探讨。

空白组大鼠肝脏指数是3.28 ± 0.25,模型组大鼠肝脏指数是3.52 ± 0.21。模型组大鼠肝脏指数较空白组显著增加 (P < 0.05), 说明阿霉素造成肝脏功能异常。

参照文献^[14]报道、结合公共数据库HMDB (http://www.hmdb.ca/)、BMRB (http://www.bmrb.wisc. edu/),对图谱中的主要化合物进行归属。空白组和模型组肝脏¹H NMR图谱共指认出50个化合物, 其中包括3个结构未知成分。肝脏¹H NMR图谱大致可以划分为3个区域: 高场区 (δ 3.10～0.00) 主要包括有机酸和氨基酸, 如乳酸、乙酸、柠檬酸、亮氨酸、丙氨酸等。碳水化合物区 (δ 5.50～3.10) 主要为糖类、脂类代谢物, 包括糖原、α-葡萄糖、阿拉伯糖、β-葡萄糖、氧化三甲胺、甜菜碱和胆碱等。低场区 (δ 9.60～5.50) 指认的化合物主要包括嘌呤、嘧啶及核酸代谢物, 如次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、肌苷和尿苷等 (表 1)。图 1显示空白组和模型组存在一定差异, 模型组大鼠肝脏中黄嘌呤、缬氨酸和苯丙氨酸等化合物含量发生了变化, 说明阿霉素引起大鼠肝脏代谢网络某些环节的紊乱。为全面寻找引起两组差异的主要内源性代谢物, 下一步采用多元统计分析方法对空白组和模型组的核磁图谱进一步分析。

Figure 1 The typical 1H NMR spectra of rat liver from control group and model group

首先应用PCA多变量模型判别方法对数据进行降维处理, 提取数据集所包含的绝大部分信息, 观察两组的自然分布和组别关系, 结果见图 2a。从第一和第二主成分 (PC1: 34.0%; PC2: 16.4%) 构建的得分图可以看出, 空白组和模型组可明显区分, 说明阿霉素给药后, 动物肝脏代谢轮廓发生改变。模型组大鼠组内的差异大于空白组, 说明个体对药物的毒性反应存在差异。PCA作为无监督的分析方法, 只反映了数据的原始状态, 但在实验过程中, 环境、饮食等因素, 以及实验的一些系统误差都会影响实验结果。为了过滤掉与实验目的不相关因素所引起的代谢变化, 获得更为准确的结果, 本研究采用有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析对数据进行进一步处理。

评价PLS-DA模型拟合效果常采用R²X、R²Y和Q²等3个指标, R²X和R²Y分别代表模型所能解释的X和Y矩阵的百分比, Q²表示模型的预测能力。以上3个值越接近1, 表示模型的可信度越高。结果显示本研究PLS-DA模型拟合效果较好 (R²X = 0.851,R²Y = 0.970, Q² = 0.863)。外部模型验证方法 (排列实验) 常用于模型有效性判定。由图 2b可见, 两条回归线斜率较大, 左端任何一次随机排列产生的R², Q²均小于右端, 且最右端的两个值差距较小, 说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力, 证明模型有效, 可进一步分析。图 2c为OPLS-DA得分散点图, 与无监督的主成分分析相比, 空白组和模型组得到最大程度的分离, 并有效降低组内个体差异。通过S-plot (图 2d) 结合VIP值(> 1) 寻找差异代谢物, 共找到33个差异化合物。t检验结果 (表 1) 表明16个化合物含量具显著性差异 (P < 0.05, P < 0.01)。

表 1(Table 1)

Table 1 1H NMR assignments of majormetabolites in rat liver. “U” represents for unknown compounds. ↑ or ↓ representhigher or lower in model group compared with control group. P < 0.05, **P < 0.01 vs control group No. Metabolite VIP Trend No. Metabolite VIP Trend 1 Lipid 26 Myo-Inositol 2.58 ↑ 2 Isoleucine 1.46 ↓** 27 Glycine 2.58 ↓ 3 Leucine 2.97 ↓** 28 β-Glucose 1.01 ↑ 4 Valine 1.65 ↓ 29 Cytidine 5 3-Hydroxybutyrate 2.27 ↓** 30 Adenosine 1.71 ↑ 6 Lactate 2.85 ↑ 31 β-Arabinose 1.59 ↓ 7 Alanine 1.73 ↓** 32 α-Mannose 8 Acetate 33 α-Glucose 1.97 ↑ 9 Glutamate 1.12 ↓ 34 Glycogen 2.37 ↑ 10 Methionine 1.16 ↓ 35 Uracil 11 Glutamine 1.88 ↓ 36 Uridine 1.38 ↑** 12 Succinate 2.31 ↑** 37 Inosine monophosphate 13 Glutathione 2.29 ↑ 38 Fumarate 14 Aspartate 1.28 ↓** 39 Tyrosine 1.22 ↓** 15 Dimethylamine 40 Histidine 16 Trimethylamine 1.33 ↓** 41 Phenylalanine 1.09 ↓** 17 Glutathione disulfide 1.85 ↑ 42 Nicotinamide 18 Ornithine 1.67 ↓** 43 Xanthine 1.67 ↓** 19 Creatine 1.63 ↓ 44 Hypoxanthine 20 Choline 2.52 ↓ 45 Inosine 21 Phosphocholine 4.91 ↑ 46 Formate 22 Glycerophosphocholine 47 Nicotinamide mononucleotide 23 Taurine 3.38 ↓ 48 U1 2.27 ↑ 24 Betaine 1.47 ↑ 49 U2 25 Trimethylamine-N-oxide 3.20 ↑ 50 U3

Table 1 1H NMR assignments of majormetabolites in rat liver. “U” represents for unknown compounds. ↑ or ↓ representhigher or lower in model group compared with control group. P < 0.05, **P < 0.01 vs control group

Figure 2 PCAscore plot (a), permutation test model validation plot (b), OPLS-DA score plot (c) andcorresponding S-plot (d) between control group and model group

为研究阿霉素肝毒性相关生物标志物所涉及的代谢途径, 研究各个标志物之间可能的相互作用关系, 本文参考KEGG数据库, 发现16个生物标志物的变化涉及17条代谢通路的紊乱。为了进一步确定阿霉素对这些代谢通路影响值的大小,采用MetPA进行分析。MetPA的优势在于能够基于高质量的代谢物信息数据库 (KEGG), 利用计算机自动将差异代谢物归纳到相关的生物化学变化网络中, 筛选出与疾病最相关的代谢通路。将上述的16个化合物导入MetPA软件, 结果如图 3所示。图中横坐标Pathway impact表征由拓扑分析计算所得的代谢通路的重要性值, 纵坐标−logP表示代谢通路富集分析的显著性水平。代谢通路的Pathway impact与−logP值越大, 不同组间代谢差异的相关性越高, 图中的圆圈就越大。本研究将代谢通路影响值设置为0.10, 当代谢通路影响值高于这个值, 即被视为潜在的靶标代谢路径。结果显示阿霉素诱导的肝脏代谢紊乱主要与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成, 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成, 苯丙氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢, 丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢, 以及酪氨酸代谢密切相关, 提示氨基酸代谢异常与阿霉素肝毒性关系密切。将这些生物标志物和相关的代谢通路相联系, 构建了阿霉素肝毒性代谢网络示意图, 结果如图 4所示。

Figure 3 Summary diagram ofpathway analysis with MetPA: phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis (1); valine, leucine andisoleucine biosynthesis (2); phenylalaninemetabolism (3); glycine, serine andthreonine metabolism (4); alanine,aspartate andglutamate metabolism (5); tyrosine metabolism (6)

Figure 4 Summary of pathway alternationsin DOX-treated rat liver

肝内氨基酸代谢的酶类十分丰富,参与氨基酸转氨基、脱氨基、转甲基和脱羧基等反应的发生,进而影响机体糖异生、氧化供能和酮体代谢等过程。此外,肝脏还可利用某些氨基酸合成嘌呤、嘧啶类等含氮化合物。通过氨基酸的体内转化,可将机体中糖类、脂类及氨基酸类成分有机地统一和整合,表征机体的生命特征。当肝脏受到外部刺激,必然导致氨基酸代谢的异常^[15],进而影响肝脏正常的生理功能。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸属于支链氨基酸,其合成所需的碳骨架来源于糖无氧代谢和有氧代谢的中间产物。模型组肝脏中的这3个氨基酸低于正常组,表明阿霉素的毒性作用影响肝脏氨基酸正常水平,与临床报道结果一致^[16]。丙氨酸和甘氨酸是生糖氨基酸,可转化为乙酰辅酶 A并参与三羧酸循环为机体提供能量。与空白组相比,模型组这些氨基酸的含量显著降低 (P < 0.01),提示阿霉素肝毒性涉及能量生成障碍。苯丙氨酸是人体必需的芳香族氨基酸,在正常情况下,除合成机体组织细胞各种蛋白之外,主要在肝脏组织经苯丙氨酸羟化酶转化为酪氨酸,进而在神经系统和肾上腺髓质合成某些激素和神经递质。肝脏病变可引起苯丙氨酸代谢失调,致使苯丙氨酸转化为酪氨酸受阻,引起血中苯丙氨酸浓度过高^[17]。本研究中阿霉素组苯丙氨酸、酪氨酸的含量显著低于空白组 (P < 0.01),说明大鼠肝脏病变造成苯丙氨酸代谢紊乱。天冬氨酸是三羧酸循环的重要成分,参与尿素合成的鸟氨酸循环。合成尿素是肝脏特有的功能之一。血液中的氨通过肝脏鸟羧酸循环转化为尿素后排出体外,是机体排泄“氨毒”的主要方式。当肝功能发生障碍时,鸟羧酸循环能力降低会导致氨中毒,进而诱发肝性脑病^{[18, 19]}。本研究中天冬氨酸、鸟氨酸在模型组降低显著 (P < 0.01),说明阿霉素肝毒性造成鸟氨酸循环平衡失调,肝脏生物转化能力下降。此外,蛋氨酸是机体最重要的甲基供体,参与多种甲基化反应,阿霉素亦造成蛋氨酸代谢异常。本研究显示阿霉素肝毒性造成多种氨基酸代谢异常,与文献^[13]报道结果相似。

糖类、脂类和嘌呤类成分的代谢紊乱及氧化应激等相关的生物学过程也参与了阿霉素肝脏毒性的发生。三羧酸循环是机体生成ATP的主要方式,琥珀酸作为三羧酸循环的一种中间产物,在模型组中含量显著升高 (P < 0.01),表明三羧酸循环失调,机体能量代谢过程出现障碍。3-羟基丁酸是脂肪酸在肝脏氧化分解产生的一种特有代谢物,参与肝外组织 (主要脑组织) 的供能过程。3-羟基丁酸含量在模型组中显著降低,表明肝脏脂肪酸代谢异常,可能造成肝外组织能量利用障碍,与文献^{[8, 9]}报道一致。黄嘌呤是嘌呤碱代谢的中间产物,通过氧化作用生成尿酸而排出体外。与空白组相比,模型组中黄嘌呤含量显著降低 (P < 0.05),表明肝脏嘌呤代谢平衡被破坏。谷胱甘肽是有机体重要的抗氧化剂和还原缓冲剂^[20],参与氧化还原过程,保护巯基酶,防止过氧化积累。谷胱甘肽氧化后形成氧化型谷胱甘肽。本研究中阿霉素导致动物肝脏氧化型谷胱甘肽含量显著升高 (P < 0.05),说明谷胱甘肽过度消耗,氧化应激反应参与了阿霉素毒性作用的发生。此外阿霉素刺激还造成嘧啶代谢 (尿苷)、甲胺代谢 (三甲胺) 异常。

肝脏是阿霉素代谢的主要器官,也是被其原形和代谢产物致损的重要靶器官。当肝损伤发生后,肝脏蛋白质代谢、氨基酸的清除以及外周氨基酸代谢均会受到影响,甚至造成尿液中氨基酸丢失^[21]。研究显示甘氨酸具有细胞保护作用,能防止肝细胞坏死^[22]。本研究中甘氨酸的异常降低可能与肝细胞坏死有关。线粒体是细胞内合成ATP的主要场所,三羧酸循环的改变预示其功能受到干扰,与肝细胞萎缩和肝血窦扩张密切相关^{[21, 23]}。本研究中琥珀酸代谢异常反映肝脏线粒体功能受损。阿霉素经肝脏微粒体P450氧化酶系代谢生成氧自由基和脂质过氧化物,造成细胞膜损伤和钙超载^{[24, 25]}。本研究结果显示模型组大鼠氧化型谷胱甘肽也发生代谢异常。上述标志物的变化均从内源代谢物的角度提示了肝脏损伤的发生。

本实验结合模式识别和代谢通路分析方法对阿霉素肝毒性的作用机制进行了研究,共鉴定了16个相关的生物标志物,涉及氨基酸、脂质、嘌呤代谢异常、能量代谢失衡、生物转化紊乱和氧化损伤等病理过程,深入分析了阿霉素肝毒性机制中氨基酸水平改变所涉及的代谢通路及生化途径,同时发现阿霉素的毒性机制还与脂类、嘌呤等物质代谢、能量代谢、肝脏生物转化及氧化应激等过程有关。阿霉素经动脉、静脉或腹腔注射给药后可广泛分布于各组织脏器,因而具有多脏器毒性^[25]。Andreadou等^{[26, 27]}发现阿霉素能造成大鼠心肌组织脂类、有机酸、胆碱等多种物质代谢紊乱。与阿霉素的心脏毒性相比,阿霉素肝毒性的发生与肝脏内氨基酸代谢的异常具有密切关系。除此之外,脂类、嘌呤等物质代谢以及能量代谢的改变也是阿霉素诱导肝脏毒性的重要途径。