三磷酸腺苷二钠 (ATP)是一种核苷酸衍生物,参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸以及核苷酸的代谢,ATP注射液用于进行性肌萎缩、脑出血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎等的辅助治疗,是一种常见的、重要的辅酶类药物。

ATP注射液在生产和储存过程中易混入或产生二磷酸腺苷二钠 (ADP)、一磷酸腺苷二钠 (AMP)、磷酸钠和焦磷酸钠。目前,分析ATP注射液的方法主要有色谱法、电泳法和光学分析法等^[1]。 其中纸电泳法和高效液相色谱法是最主要的分析方法^{[2, 3, 4, 5, 6]}。纸电泳法是我国卫生部药品标准指定的测定方法,但该法操作繁琐、实验周期长、专属性差^[7]。高效液相色谱法的分离效能高,中国药典 (2010年版) 推荐的测

定方法是分光光度法与高效液相色谱法的结合^[8],但高效液相色谱法的分析时间长^[9]、需要配制流动相,分析步骤较繁琐,而且紫外光度检测器要求待测物对紫外光有吸收,这样就限制了对紫外光无吸收的物质 (如磷酸盐) 的检测。

近年来,随着核磁共振技术的不断发展,特别是超导傅里叶变换核磁共振仪的使用,使得定量分析的精密度和准确度已达到或接近高效液相色谱仪,越来越多的工作者用核磁共振来定量 ^{[10, 11, 12, 13]},核磁共振已成为同时进行定性定量分析的重要仪器,2010年版中国药典已将核磁共振法作为一种重要的分析方法^[8]。核磁共振磷谱 (³¹P NMR) 只对磷原子有吸收峰,无其他元素的干扰、不破坏样品、操作简单、快速。在报道的文献中,对ATP注射液的分析只针对ATP、ADP和AMP,而同时分析ATP注射液中ATP、ADP、AMP、磷酸钠和焦磷酸钠的方法未见报道。本文采用³¹P NMR对同一样品中ATP、ADP、AMP等含磷物质进行定性定量分析,方法重现性好、准确度高。进而把这种方法应用到对ATP注射液的分析,建立了一种快速、有效的分析ATP注射液中各种成分含量的方法。

材料与方法 仪器

AVANCE 500 MHz超导傅立叶变换核磁共振仪 (瑞士,Bruker); 5 mm核磁共振样品管; LC- 20AT高效液相色谱仪,SPD-20A紫外检测器 (日本岛津公司); UV-2450紫外可见分光光度计。

试剂 ATP、ADP、AMP二钠盐 (Amresco公司,98%); 氘代重水 (D₂O,中国科学院武汉分院,99.8%); 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄,湖南师大化学试剂厂,99%); 焦磷酸钠 (Na₄P₂O₇,广州化学试剂厂,99%); 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄,国药集团化学试剂有限公司,99%); 无水磷酸二氢钾 (KH₂PO₄,国药集团化学试剂有限公司,99%); 四丁基溴化铵 (C₁₆H₃₆BrN,国药集团化学试剂有限公司,99%); ATP注射液 (购于社区医院,规格2 mL∶20 mg)。 实验条件

³¹P NMR谱 待测物质均在室温下采用5 mm BBO探头测定,经过简单优化确定实验参数为: 谱宽: 20 161.291 Hz; 中心频率: -3 036.85 Hz; 采样时间: 2 s; 脉冲激发时间: 11.5 μs; 延迟时间: 4 s; 扫描次数: 64; 空扫次数: 4。

液相色谱条件 色谱柱为C₁₈柱; 流动相为0.2 mol·L^-1磷酸盐缓冲液 (pH 7,含四丁基溴化铵1.61 g·L^-1) - 甲醇 (95∶5); 柱温为35 ℃; 检测波长为259 nm。

实验参数的考察 弛豫时间对于核磁定量分析非常重要,反映到具体的参数就是延迟时间 (D1) 和采样时间 (AQ),本文对这两个参数做了详细考察。

将D1 = 4 s,其他条件不变,改变AQ,使之分别为0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5和3 s,测定样品溶液的³¹P NMR谱,发现在0.5 s后峰面积不随AQ的增大而增大,基本保持不变; 将AQ = 2 s,其他条件不变,改变D1,使之分别为0.1、0.3、0.5、1、2、3、4和5 s,测定样品溶液的³¹P NMR谱,发现在0.5 s后峰面积不随D1的增大而增大。为使本方法的适用范围更广,选取AQ = 2 s、D1 = 4 s。

在实验中发现谱宽大于120时,得到的谱图相位校正不好,因此将谱宽频率减少到: 20 161.291 Hz; 对应的中心频率为: -3 036.85 Hz,其他实验参数为仪器推荐参数。 线性范围与检出限的测定

称取ATP、ADP、AMP、NaH₂PO₄和Na₄P₂O₇适量放入同一个5 mL量瓶中,通过稀释配成ATP、ADP、AMP的系列浓度均为: 0.080、0.020、0.008、0.004、0.002和0.001 mol·L^-1; NaH₂PO₄与Na₄P₂O₇的系列浓度均为: 0.100、0.025、0.010、0.005、0.002 5、0.001 25 mol·L^-1。均加入0.500 mol·L^-1 KH₂PO₃溶液1.0 mL作为内标,用含10% D₂O的蒸馏水定容,摇匀后制成系列标准溶液,在实验条件下测³¹P NMR谱。 精密度与回收率的测定

按等物质的量之比,准确称取ATP、ADP、AMP、NaH₂PO₄、Na₄P₂O₇和KH₂PO₃于核磁管内,加入适量D₂O溶解,充分振荡摇匀后制成样品溶液,在实验条件下测³¹P NMR谱,连续采样6次,每次对所需的峰面积积分5次,作为精密度结果; 将样品溶液做3个梯度的加样回收率,按测定质量的约20%、50% 和80%添加,在实验条件下测³¹P NMR谱,连续采样5次,每次对所需的峰面积积分5次,作为回收率结果。 实际样品的测定

³¹P NMR谱 准确移取ATP注射液1.0 mL于 5 mm核磁管内,加入适量D₂O和KH₂PO₃,充分振荡溶解后制成待测溶液,在实验条件下测定³¹P NMR谱,连续采样5次,每次对所需的峰面积积分5次。核磁共振磷谱定量原理: 磷原子的峰面积与磷原子个数成正比,通过加入的内标物就可以算出含磷化合物的含量,公式为: ${W_{\rm{S}}} = \frac{{{A_{\rm{S}}}/{n_{\rm{S}}}}}{{{A_{\rm{R}}}/{n_{\rm{R}}}}} \cdot \frac{{{M_{\rm{S}}}}}{{{M_{\rm{R}}}}} \cdot {W_{\rm{R}}}$

式中: 下标S代表待测定物质; 下标R代表内标物; M为摩尔质量; W为质量; A为峰面积; n为吸收峰所包含磷原子个数。

药典方法 为了验证³¹P NMR方法的准确性,按照药典 (ChP) 的方法^[7]测定了ATP注射液的含量。

总核苷酸的测定 取ATP注射液50 μL于25 mL量瓶中,用磷酸盐缓冲溶液 (pH 7) 定量稀释成约 20 μg·mL^-1溶液,用紫外-可见分光光度计在259 nm处测定吸收度。

三磷酸腺苷二钠重量比的测定 取ATP注射液1 mL于25 mL量瓶中,用流动相定量稀释成约0.4 mg·mL^-1溶液,用高效液相色谱仪测定,连续测定6次。按下式计算三磷酸腺苷二钠的含量:

ATP重量比= $\frac{{{T_3}}}{{0.671{T_1} + 0.855{T_2} + {T_3} + {T_{\rm{X}}}}}$

ATP的含量 = 总核苷酸 × ATP重量比

式中: T₁为AMP的峰面积; T₂为ADP的峰面积; T₃为ATP的峰面积; T_X为其他物质的峰面积; 0.671为AMP与ATP分子量的比值; 0.855为ADP与ATP分子量的比值。

结果 1 样品溶液的³¹P NMR谱分析

样品溶液的³¹P NMR谱,如图 1,通过添加标准物质,比较积分,可以对各个吸收峰进行定性分析,在δ = -22.625处为ATP的吸收峰,在δ = -11.165处为ATP与ADP的吸收峰发生重叠,在δ = -10.517处为ATP、ADP与Na₄P₂O₇的吸收峰发生重叠,在δ = 0.018处为NaH₂PO₄的吸收峰,在δ = 0.249处为AMP的吸收峰,在δ = 1.036、4.138处为KH₂PO₃的吸收峰。

Figure 1 31P NMR spectrum of sample solution

实验结果表明: ATP、ADP、AMP在0.004～0.080 mol·L^-1,NaH₂PO₄、Na₄P₂O₇在0.005～0.100 mol·L^-1内具有很好的线性关系,见表 1,在测试中发现ATP、ADP、AMP在0.001、0.002 mol·L^-1,NaH₂PO₄、Na₄P₂O₇在0.001 25、0.002 5 mol·L^-1时有相应的特征峰出现,但信号比较弱,积分峰面积与浓度不成线性,因此ATP、ADP、AMP的检出限为0.001 mol·L^-1,NaH₂PO₄、Na₄P₂O₇的检出限为0.001 25 mol·L^-1。

表 1(Table 1)

Table 1 Linear regression equation of five compounds Compound Linear regression equation R2 ATP Y = 9.505 3 X - 0.004 2 0.999 94 ADP Y = 10.181 6 X - 0.000 1 0.999 97 AMP Y = 10.080 1 X - 0.003 0 0.999 97 NaH2PO4 Y = 10.039 5 X - 0.003 1 1.000 00 Na4P2O7 Y = 9.763 9 X - 0.004 1 1.000 00

Table 1 Linear regression equation of five compounds

样品溶液的精密度结果见表 2,样品溶液的RSD在0.40%～1.30%,表明该方法的重现性很好。

表 2(Table 2)

Table 2 Determination results of precision. n = 6,x± s Compound Content/mg RSD/% ATP 21.0 ± 0.12 0.57 ADP 18.9 ± 0.18 0.95 NaH2PO4 6.1 ± 0.08 1.30 AMP 14.7 ± 0.11 0.75 Na4P2O7 15.0 ± 0.06 0.40

Table 2 Determination results of precision. n = 6,x± s

样品溶液的回收率结果见表 3,回收率的结果在96.9%～105.2%,说明该方法的准确度高,能够准确测定含磷化合物的含量。

表 3(Table 3)

Table 3 Determination results of recovery. n = 5,x± s Compound Added/mg Found/mg Average recovery/% 3.9 28.4 ± 0.07 98.4 ATP 11.2 31.9 ± 0.13 97.5 21.3 42.0 ± 0.16 98.4 4.0 23.0 ± 0.11 102.0 ADP 10.3 29.4 ± 0.10 101.5 15.2 34.4 ± 0.14 102.0 1.3 7.4 ± 0.07 96.9 NaH2PO4 4.4 10.6 ± 0.07 101.4 5.8 12.2 ± 0.07 105.2 3.4 18.3 ± 0.07 104.7 AMP 8.2 23.2 ± 0.07 103.7 12.2 27.4 ± 0.16 104.4 3.0 18.0 ± 0.05 100.0 Na4P2O7 7.9 23.0 ± 0.17 101.3 12.0 27.1 ± 0.14 100.5 div>

Table 3 Determination results of recovery. n = 5,x± s

对ATP注射液的³¹P NMR谱进行分析,实验结果显示该注射液的杂质为ADP与NaH₂PO₄,而药典方法结果表明该注射液的杂质为ADP,这两种方法测定3批ATP注射液的结果见表 4。

表 4(Table 4)

Table 4 Result of three batches of ATP injection by 31P NMR and ChP. n = 5,x± s Method Compound Content / mg 1 2 3 31P NMR ATP 9.6 ± 0.13 9.7 ± 0.15 9.4 ± 0.14 ADP 1.6 ± 0.09 1.5 ± 0.08 1.7 ± 0.11 NaH2PO4 0.5 ± 0.007 0.4 ± 0.004 0.4 ± 0.005 ChP ATP 9.2 ± 0.04 9.4 ± 0.03 9.2 ± 0.06 ADP 1.3 ± 0.05 1.2 ± 0.06 1.4 ± 0.03

Table 4 Result of three batches of ATP injection by 31P NMR and ChP. n = 5,x± s

通过对比实验数据可知,用³¹P NMR谱测得的结果和用药典方法测定的结果很接近,且符合药典要求,说明了³¹P NMR谱有很高的准确性,可以准确测量ATP注射液的含量,而且比药典中ATP注射液的测定方法操作简单、耗时短,整个测试过程只需几分钟,并且还可以同时测定ATP注射液中磷酸钠和焦磷酸钠的含量。

本文利用³¹P NMR谱建立了一种可以同时分析ATP、ADP、AMP、磷酸钠和焦磷酸钠的方法,该方法精密度为0.40%～1.30%,加样回收率为96.9%～105.2%,得到ATP、ADP、AMP在0.004～0.080 mol·L^-1,NaH₂PO₄、Na₄P₂O₇在0.005～0.100 mol·L^-1内具有很好的线性关系。把该方法应用于ATP注射液的测定,测得ATP注射液中的杂质为ADP和磷酸盐,ATP的含量符合药典要求。与其他方法相比,该方法快速、准确,而且无需前处理,同时该方法也为其他含磷物质的研究提供了一种新的思路。