癌症严重威胁人类的生命安全,近年来其发病率呈上升趋势,死亡人数逐年增加。尽管现有治疗手段取得了一定疗效,但多数癌症患者生存时间有限,缺乏有效的可以治愈的药物,亟需开发新的药物来满足癌症患者需要。从天然产物中发现药物先导化合物依然是现代药物研发的重要途径之一,据统计,超过50% 的现有药物来自于对天然产物先导化合物的结构改造。天然产物在抗癌领域的研究取得了显著的成就,目前临床使用的抗癌药物中超过60% 来源于天然产物,已成为抗肿瘤药物研究和开发的重要途径之一[1, 2]。
苦参碱 (matrine,MT) 是传统中药苦参的主要活性成分之一,是一类结构特异的生物碱。苦参碱具有多种药理作用,如抗肿瘤、镇痛、抗乙型肝炎病毒等,临床上广泛用于治疗慢性肝炎和肝纤维化。近年 的研究表明[3, 4, 5, 6],苦参碱具有广谱抗肿瘤作用,且毒副作用小。尽管苦参碱具有药用资源来源广,使用安全等优势,但由于抗肿瘤活性较低,使其临床应用受到一定的限制。如何提高其抗肿瘤活性成为药学工作者的研究热点之一。本课题组前期以苦参碱为先导化合物,对其D环进行了优化,得到去氧苦参碱和开环
物苦参酸。在苦参酸的基础上,经结构进一步优化,得到N-苄基苦参酸苄酯,将其水解得N-苄基苦参酸,两者均具有较强的抑制HepG2细胞活性 (IC50 = 0.25、0.69 mg·mL-1)。
研究表明,高浓度的NO可诱导肿瘤细胞凋亡,阻止肿瘤的扩散和转移[7]。呋咱氮氧化物是一类重要的NO供体,在体内可释放高浓度NO,抑制肿瘤生长[8]。研究也表明,将具有一定抗肿瘤活性的化合物与呋咱氮氧化物偶联,得到的偶联物可发挥协同效应,增强抗肿瘤效果[9, 10, 11]。为此,本课题组将N-苄基苦参酸通过酯基与NO供体偶联,设计合成了30个NO供体型苦参碱衍生物[12,13],体外抗肿瘤活性实验结果显示,该类化合物具有比母体化合物苦参碱更强的抑制肝癌细胞HepG2和Bel-7402的增殖活性,且多个化合物对HepG2细胞的抑制活性优于5-氟尿嘧啶。在此基础上,本论文将N-苄基苦参酸苄酯中的酯基还原,得到N-苄基苦参醇,再以琥珀酸为连接桥,与不同二醇或氨基醇取代的苯磺酰呋咱偶联,设计、合成了14个N-苄基苦参醇-呋咱氮氧化物杂合物,并对其进行体外抗人肝癌细胞SMMC-7721、Bel-7402、Bel-7404和HepG2的活性筛选,期望获得具有高活性的抗肝癌化合物。
以苦参碱 (1) 为原料,经水解、苄基化反应,得到N-苄基苦参酸苄酯 (3); 再经四氢铝锂还原其酯基得到N-苄基苦参醇 (4); 4与丁二酸酐在无水二氯甲烷中经缩合反应生成N-苄基苦参醇丁二酸单酯 (5); 5与7a~7n在DMAP/EDCI作用下脱水成酯,得到目标物8a~8n (合成路线1)。
结果与讨论 1 化学合成
在制备N-苄基苦参醇丁二酸单酯过程中,课题组对其反应条件进行了优化。多次实验结果表明,当反应物配比为N-苄基苦参醇∶丁二酸酐 (n∶n) = 1∶1时,N-苄基苦参醇不能完全转化; 随着丁二酸酐量的增加,转化率也随之提高,当N-苄基苦参醇与丁二酸酐配比达1∶1.5时,N-苄基苦参醇完全转化。反应温度对反应进程有一定的影响: 室温反应时,反应时间较长,且转化率较低; 温度升高,反应时间缩短,当反应温度为35~40 ℃时,反应时间只需5 h。为此,确定最佳的反应条件为: N-苄基苦参醇∶丁二酸酐 (n∶n) = 1∶1.5,反应温度为35~40 ℃。
在目标物的制备过程中,首先尝试以DCC为脱水剂,N-苄基苦参醇丁二酸单酯与各种单取代的呋咱脱水得到相应的目标物。实验过程中发现,以DCC为缩合剂,生成的DCU在后处理中不易除尽,影响产物的纯度。后用EDCI为脱水剂,得到较为满意的结果,后处理简单,且目标物产率较高。合成的14个目标化合物的理化常数及波谱数据见表 1、表 2。
以苦参碱和5-FU为阳性对照,采用MTT法测试了目标化合物对人肝癌细胞Bel-7402、SMMC-7721、HepG2和BelEL-7404的体外抑制细胞增殖活性。实验结果见表 3。
由表 3可以看出,目标化合物均具有比母体化合物苦参碱和阳性对照药氟尿嘧啶更强的抑制肝癌细胞增殖的活性,其中,对肝癌细胞HepG2和Bel-7402 的抑制作用更强,其IC50值达微摩尔甚至亚微摩尔浓度。化合物抑制肝癌细胞增殖的活性与分子中的连接基团相关,不同的连接基团对不同的肝癌细胞的增殖抑制活性影响不同: 针对人肝癌细胞SMMC-7721、Bel-7402、Bel-7404,当连接基团X为氨基醇片段时,其抗增殖活性略强于以相同碳数的二醇为连接链的化合物,如8k > 8a,8l > 8b; 当碳链延长时活性有所提高,如8g > 8f > 8d > 8b > 8a,8l > 8k; 而对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制活性的影响则不同,如8a > 8k,8b > 8l。当连接基团X中含苯环或碳碳三键时,所得化合物具有较高的抗增殖活性,如8h< /span>和8j对人肝癌细胞HepG2的IC50值分别为0.26 μmol·L-1和0.12 μmol·L-1; 当连接基团X中含杂原子时,活性较低,如8i,连接基为一缩乙二醇,其抗肿瘤细胞的增殖活性低于以相同原子数的戊二醇为连接链的8f。
4 小结本文以苦参碱为先导物,得到14个N-苄基苦参醇—苯磺酰呋咱杂合物,体外抗肿瘤活性实验结果表明,目标化合物对不同肝癌细胞增殖均具有较强的抑制作用,且活性强于阳性对照药氟尿嘧啶 (5-FU),其中,化合物8a~8h、8j抑制肝癌细胞HepG2的活性最强,IC50值达亚微摩尔浓度 (0.12~0.93 μmol·L-1),由此可见将具有一定抗肿瘤活性的化合物N-苄基苦参醇与呋咱氮氧化物偶联可增强抗肿瘤活性。
实验部分LCQ ADVANTAGE MAX液质联用质谱仪 (美国FINNIGAN公司); Nicolet Avatar 370 DTGS型红外光谱仪 (美国Thermo Electron公司); AV300型核磁共振仪 (德国Bruker公司,溶剂为氘代氯仿,TMS为内标); 薄层硅胶G板(合肥森瑞有限公司,100 mm × 100 mm); 苦参碱 (西安鸿生生物技术有限公司,含量大于98%),试剂为市售分析纯。
1 合成部分 1.1 N-苄基苦参酸苄酯 (3) 的合成参照文献[12]制备,mp 73.2~73.8 ℃ (文献: mp 73.5~74.0 ℃)。
1.2N-苄基苦参醇 (4) 的合成在100 mL圆底烧瓶中加入4.18 g (10 mmol) N-苄基苦参酸苄酯、40 mL 乙醚,冰浴条件下缓慢加入0.68 g四氢铝锂,室温搅拌反应,TLC检测反应进程。反应完毕,搅拌下缓慢滴加水至无气泡产生。抽滤,滤液用乙酸乙酯萃取 (3×50 mL)。有机层用水洗2次,无水MgSO4干燥,过滤。滤液减压浓缩至干,得乳白色粉末3.12 g,收率91.2%。mp 79.8~80.2 ℃ (文献[14] mp 80.0~80.2 ℃)。
1.3 N-苄基苦参醇丁二酸单酯 (5) 的合成在50 mL圆底烧瓶中加入N-苄基苦参醇 (1.71 g,5 mmol)、丁二酸酐 (0.75 g,7.5 mmol)、DMAP (0.61 g,5 mmol)、25 mL无水二氯甲烷,搅拌下回流反应,TLC检测反应进程。反应完毕,冷却后将反应液倾入20 mL水 中,用二氯甲烷 (3×20 mL) 萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,有机层用无水MgSO4干燥。过滤,滤液浓缩,得淡黄色油状物2.02 g,收率91.5%。ESI-MS m/z 443.4 [M+H]+。
1.4 化合物7a~7n的合成(参照文献[15]制备)。
1.5 目标化合物8a~8n的合成通法 在50 mL圆 底烧瓶中加入N-苄基苦参醇丁二酸单酯5(0.44 g,1 mmol)、化合物 (7a~7n) (1 mmol)、DMAP (0.12 g,1 mmol) 和10 mL二氯甲烷,冰浴下滴加EDCI (0.29 g,1.5 mmol) 的二氯甲烷溶液,滴完后室温搅拌反应,TLC跟踪。反应完毕,抽滤,滤液浓缩,经硅胶柱色谱得到目标物。
2 细胞毒活性测试用MTT法测试目标化合物对人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、Bel-7404和HepG2体外抑制细胞增殖活性。实验方法如下: 取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶,胰蛋白酶消化,使贴壁细胞脱落,制成每毫升含5×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上 ,每孔100 μL,置恒温CO2培养箱中培养24 h换液,加入受试化合物 (化合物用DMSO溶解后用PBS稀释,受试化合物浓度分别为100、33.33、11.11、0.41、0.14、0.05、0.015 μmol·L-1),每孔100 μL,培养72 h。将MTT加入96孔板中,每孔10 μL,培养箱中反应4 h。吸去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,平板摇床上振摇5 min。用酶联免疫检测仪在波长为490 nm处测定每孔的吸收度,并计算细胞抑制率。
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