肝纤维化 (liver fibrosis) 是多种原因引起的慢性肝损害的病理改变, 表现为肝细胞间质成分异常沉积, 进而影响肝功能, 是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。现认为肝纤维化尚有逆转至正常的可能, 所以在肝纤维化的发展过程中及时用药进行干预, 会降低肝硬化的患病率^[1]。萱草花总黄酮 (hemerocallis citrina baroni flavonids, HCBF) 是药食同源植物萱草花 (Hemerocallis citrina baroni) 中的主要黄酮类成分, 具有抗癌、抗抑郁、镇静催眠和抗氧化等作用^{[2, 3]}。有研究报道氧化损伤参与肝纤维化的发展过程^[4]。因 此, 在前期工作的基础上, 本研究通过构建四氯化碳 (CCl₄) 大鼠肝纤维化模型, 探讨了HCBF的改善作用以进一步明确其作用机制, 为肝纤维化的临床用药提供依据。

Wistar大鼠, SPF级, 体重 (220 ± 20) g, 雌雄各半, 长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供, 合格证编号SCXK (吉)-2010-0001; 萱草花总黄酮提取物 (总黄酮提取率为26.5%, 1 g提取物相当于生药材28 g); 谷丙转氨酶 (alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (aspartate aminotransferase, AST)、r-谷氨酰转肽酶 (gamma glutamyl transpeptidase, GGT)、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 及丙二醛 (maleic dialdehyde, MDA) 试剂盒 (南京建成生物公司); Ⅰ型胶原 (procollagen I N-terminal peptide, PINP) 试剂盒 (北京北方生物技术研究所); 转化生长因子 (transforming growth factor-β1, TGF-β1) 抗体 (美国Santa cruz公司 ); CCl₄ (宜兴化学试剂三厂); 苏木素、酸性品红 (美国Sigma公司); AB-8大孔吸附树脂 (沧州宝恩化工有限公司)。

CM1900冰冻切片机 (德国Leica公司); 低温离心机 (Thermo公司); Model550型酶标仪 (Bio- Rad公司); 倒置显微镜 (日本Olympus公司); 750型自动生化分析仪 (日本日立公司); Scientz-12SN冷冻干燥机 (宁波生物科技股份有限公司)。

取萱草花粗粉适量, 添加20倍量70%乙醇, 加热、回流提取4 h, 提取3 次, 冷冻干燥, 得提取物粉末, 按照文献^[5]方法测定总黄酮含量, 萱草花总黄酮含量为9.4 mg·g^-1, 提取物粉末总黄酮含量为5.6%。取提取物粉末加水溶解成10 g·L^-1水溶液 (总黄酮: 0.56 g·L^-1), 作为大孔吸附树脂纯化准备液。取预先处理好的AB-8大孔吸附树脂, 按照径高比1∶6湿法装柱, 取准备液6倍柱体积 (BV) 上样 (2 mL·min^-1), 上样结束, 用6BV蒸馏水洗脱除杂 (2 mL·min^-1), 然后加入30% 乙醇洗脱, 收集3倍BV洗脱液, 30% 洗脱液浓缩回收乙醇, 冷冻干燥, 得提取物粉末, 依法测定总黄酮含量, 纯化粉末总黄酮含量为26.5%, 进行下述实验时以蒸馏水配置成所需浓度溶液, 备用。

Wistar大鼠30只, 随机分成5组: 空白对照组、CCl₄模型组、HCBF 25 mg·kg^-1组、HCBF 50 mg·kg^-1组、秋水仙碱 (colchicine, COL) 0.5 mg·kg^-1组。第1天, 除空白对照组, 其他各组大鼠皮下注射含40% CCl₄的花生油溶液5 mL·kg^-1, 之后每两天注射一次含CCl₄的花生油溶液3 mL·kg^-1, HCBF各剂量组和COL组于实验第2天灌胃给药, 每天1次, 连续50天。

实验结束后, 以3% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠, 腹主动脉取血, 分离血清, 按照试剂检测说明, 置于自动生化分析仪中, 检测血清中ALT、AST、GGT和ALP活性。

取上述分离后血清, 按照试剂盒使用说明, 用比色法测定血清中SOD、MDA含量。采用ELISA方法测定TGF-β1, 按照试剂盒说明进行, 采用自动酶标仪于492 nm处测定吸光度值。

取各组大鼠肝组织, 匀浆处理后, ELISA方法检测大鼠肝组织中PINP含量, 具体操作按照试剂盒说明进行。

将分离的肝组织固定在10% 甲醛中24 h, 常规石蜡包埋、切片, 60 ℃、2 h后, 二甲苯脱蜡, 酒精梯度水洗, 常规HE染色, 树胶封片, 采用倒置显微镜观察。

采用免疫组化S-P法, 将 肝组织石蜡切片加入稀释后的TGF-β1一抗4 ℃孵 育24 h, 过氧化物酶 (HRP) 酶标二抗室温孵育2 h, 二氨基联苯胺显色15 min, 显微镜下观察肝组织中TGF-β1表达情况。

取肝组织, 匀浆、提取总蛋白, 测定蛋白质含量。加入SDS- PAGE蛋白上样缓冲液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 转膜, 加入1∶500稀释一抗, 孵育过夜, HRP二抗孵育1 h, 显影, 用Image J图像分析图像, 进行目的条带灰度值分析^[7]。

数据均采用x± s表示, 应用SPSS 13.0软件对所有资料进行分析, 组间比较采用t检验, P < 0.05具有统计学意义。

1 HCBF对CCl₄诱导肝纤维化大鼠血清ALT、AST、GGT和ALP的影响

与空白对照组比较, 模型组大鼠血清ALT、AST、GGT和ALP含量明显升高 (P < 0.01), 而25 mg·kg^-1 HCBF组与CCl₄模型组比较, 大鼠血清ALT、GGT和ALP含量明显降低 (P < 0.05或P < 0.01); 50 mg·kg^-1 HCBF组、COL组分别与CCl₄模型组比较, 大鼠血清ALT、AST、GGT和ALP含量明显降低 (P < 0.05或P < 0.01)。结果表明, HCBF可以减轻CCl₄诱导的大鼠肝细胞损伤, 改善肝功能。见表 1。

表 1(Table 1)

Table 1 The effects of HCBF on the ALT, AST, GGT, ALP and PINP levels of liver fibrosis induced by CCl4 in rats. n = 6, x± s. HCBF: Hemerocallis citrina baroni flavonids; COL: Colchicine; ALT: Alanine transaminase; AST: Aspartate aminotransferase; GGT: Gamma glutamyl transpeptidase; ALP: Alkaline phosphatase; PINP: Procollagen I N-terminal peptide; **P < 0.01 vs control group, #P < 0.05, ##P < 0.01vs CCl4 group Group ALT/U·L-1 AST/U·L-1 GGT/U·L-1 ALP/U·L-1 PINP/ng·mL-1 Control 78.2 ± 5.8 64.6 ± 7.4 53.6 ± 3.5 23.9 ± 3.1 2.16 ± 0.12 CCl4 123.1 ± 9.2** 145.5 ± 9.5** 112.5 ± 9.1** 61.2 ± 2.8** 6.34 ± 0.91** HCBF 25 mg·kg-1 109.1 ± 9.4# 139.3 ± 8.9 80.3 ± 5.4## 42.7 ± 3.3# 4.00 ± 0.36# 50 mg·kg-1 97.0 ± 10.3## 91.2 ± 11.1## 74.2 ± 7.2## 39.5 ± 3.7# 3.21 ± 0.29# COL 95.0 ± 7.4## 121.9 ± 7.6## 54.7 ± 6.4## 43.2 ± 2.3# 3.06 ± 0.27#

Table 1 The effects of HCBF on the ALT, AST, GGT, ALP and PINP levels of liver fibrosis induced by CCl4 in rats. n = 6, x± s. HCBF: Hemerocallis citrina baroni flavonids; COL: Colchicine; ALT: Alanine transaminase; AST: Aspartate aminotransferase; GGT: Gamma glutamyl transpeptidase; ALP: Alkaline phosphatase; PINP: Procollagen I N-terminal peptide; **P < 0.01 vs control group, #P < 0.05, ##P < 0.01vs CCl4 group

与空白对照组比较, CCl₄组大鼠血清SOD含量降低; 与CCl₄组比较, HCBF (25和50 mg·kg^-1) 组大鼠血清SOD水平明显升高 (P < 0.01)。同时, 与空白对照组比较, CCl₄组大鼠血清中MDA的含量增加; HCBF (25和50 mg·kg^-1) 组大鼠血清中MDA含量下降, 与CCl₄组比较有明显统计学差异 (P < 0.05或P < 0.01 )。结果提示, HCBF可以减少肝组织氧自由基和脂质过氧化物产生, 减轻肝氧化应激反应。见图 1。

图 1(Figure 1)

Figure 1 The effects of HCBF on the superoxide dismutase (SOD, A), maleic dialdehyde (MDA, B) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1, C) level of liver fibrosis induced by CCl4 in rats. n = 6, x± s. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CCl4 group

CCl₄模型组大鼠的肝组织PINP含量增加, 与空白对照组比较有显著性差异 (P < 0.01); HCBF (25和50 mg·kg^-1) 组PINP含量降低, 与CCl₄模型组比较有统计学意义 (P < 0.05)。结果提示, HCBF减少Ⅰ型胶原生成, 改善肝纤维化进程。见表 1。

空白对照组的肝组织结构正常, 细胞大小均匀, 排列整齐, 无变性及坏死, 未出现明显病理改变。CCl₄模型组的肝组织结构改变, 肝细胞形态肿胀, 组织损伤明显, 有大量中性粒细胞及巨噬细胞浸润, 大量胶原沉积。与CCl₄模型组比较, HCBF各组大鼠肝组织损伤减轻、纤维结缔组织增生程度减轻、胶原沉积有所减少, 肝组织病理结构得到改善。说明HCBF可以改善CCl₄诱导的大鼠肝纤维化, 对肝组织有保护作用。结果见图 2。

图 2(Figure 2)

Figure 2 The effects of HCBF on the liver tissue pathological changes of liver fibrosis induced by CCl4 in rats (400×). A: Control group; B: CCl4 group; C: HCBF (50 mg·kg-1) group; D: COL group

ELISA结果显示, 与空白对照组比较, CCl₄模 型组TGF-β1含量增加; 与CCl₄模型组比较, HCBF (25和50 mg·kg^-1) 组TGF-β1含量明显下降 (P < 0.05或P < 0.01, 图 1)。HE染色表明, 空白对照组大鼠的肝细胞TGF-β1几乎无表达; CCl₄模型组大鼠的肝组织可见胞浆中阳性颗粒表达显著增加; 与CCl₄模型组比较, HCBF (50 mg·kg^-1) 组肝组织阳性颗粒表 达显著减少, 见图 3。Western blot的系统条带可见, CCl₄组TGF-β1表达显著增加 (P < 0.01); 与CCl₄模型组相比, HCBF (25和50 mg·kg^-1) 组TGF-β1表达显著降低 (P < 0.05, 图 4)。多种检测结果表明, HCBF可以抑制TGF-β1在肝组织的表达, 改善肝纤维化的发生。

图 3(Figure 3)

Figure 2 The effects of HCBF on the TGF-β1 expression of liver fibrosis inducedby CCl4 in rats. A: Control group; B: CCl4 group; C: HCBF (50 mg·kg-1) group; D: COL group

图 4(Figure 4)

Figure 2 The effects of HCBF on the TGF-β1 expression of liver fibrosisinduced by CCl4 in rats. n = 6, x± s. A: Control group; B: CCl4 group; C: HCBF (25 mg·kg-1) group; D: HCBF (50 mg·kg-1) group; E: COL group. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CCl4 group

目前中国仅批准了两种中药复方——鳖甲软肝片和扶正化癖片用于治疗肝纤维化, 并正在进行Ⅳ期临床试验^[8]。新药的研发是目前研究所关注的。本研究所用萱草花总黄酮是萱草花的主要成分, 是萱草花利湿热、安五脏、治酒疽的主要原因^[5]。

在CCl₄诱导的大鼠肝纤维化模型上, 观察到纤维化特征性标志物Ⅰ型胶原的增加; 导致纤维化的细胞因子——转化生长因子-β1 (TGF-β1) 表达增多; 病理切片也观察到模型组肝组织成纤维细胞增生、大量胶原沉积, 表明肝纤维化模型构建成功。本研究发现萱草花总黄酮可以减少Ⅰ型胶原和TGF-β1表达, 对CCl₄诱导的大鼠肝纤维化有改善作用^[9]。

TGF-β1在正常肝组织几乎无表达, 肝细胞发生纤维化时表达明显增多^[9]。TGF-β1的效应部位与Smads蛋白相结合, 激活胶原基因表达、增强胶原蛋白合成及蛋白多糖产生, 同时也减少胶原降解, 使胶原在细胞中沉积, 引起组织纤维化^{[7, 10, 11]}。本实验通过酶联免疫吸附反应、肝组织免疫组化和Western blot等手段观察到肝纤维化发生时TGF-β1在肝组织表达的增加, HCBF可以明显抑制TGF-β1在肝组织的表达, 进一步证明HCBF的抗肝纤维化作用。

在肝组织发生纤维化病变时伴有肝功能的改变。ALT和AST是临床上常用来反映肝细胞膜损伤程度的指标。肝细胞受损时, 血清中ALT和AST急剧升高^{[12, 13]}。GGT和ALP也常用于肝病的临床诊断。本实验中观察到HCBF组的上述指标比CCl₄模型组均有明显降低, 提示HCBF抑制CCl₄诱导大鼠肝纤维化的同时改善了肝功能, 减轻肝细胞损伤。

研究证明, 氧化应激与肝纤维化的发生关系密切^[3]。CCl₄被细胞色素P₄₅₀酶分解, 产生CCl₃和Cl^-等自由基, 增强肝微粒体脂质过氧化反应, 导致肝抗氧化能力降低, 生成大量氧自由基, 损害细胞脂质 膜, 引起肝细胞结构和功能受损。SOD能够清除氧

自由基; MDA反映了机体内脂质过氧化的程度^{[12, 13]}。HCBF组可以改善CCl₄引起的氧化应激损伤, 提高肝纤维化模型组大鼠血清中的SOD活性, 降低MDA水平, 说明HCBF可以减轻肝纤维化过程中的氧化应激反应, 减少氧自由基产生和脂质过氧化物堆积, 进而缓解肝纤维化, 保护了肝功能。