在全球范围内,肝硬化、肝纤维化已成为导致死亡的主要原因之一。我国每年死于肝硬化、肝纤维化的人数仅次于心、脑血管疾病和肿瘤。到目前为止,临床上尚无有效的肝硬化、肝纤维化治疗方法。因此,开发有效的肝纤维化治疗药物显得尤为重要。

肝纤维化是慢性肝病逐渐恶化的共同后果,无论其病因是乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus,HCV)、还是酒精性肝病、或非酒精性脂肪性肝炎等。在人肝脏样本中,肝纤维化程度与新生血管形成直接相关^[1]。从慢性病毒感染、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎患者的肝活检样本,均发现新生血管密度增加和促血管生成分子的过度表达^{[2, 3]}。新生血管形成和纤维化发生并行进展,已成为肝纤维化一个典型特征。在多种肝纤维化动物模型上采用具有抑制新生血管形成功能的多靶点药物,如受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼或舒尼替尼进行干预,均可抑制肝纤维化进程^{[4, 5, 6]}。特别是采用仅靶向血管生成分子通路的药物干预,也引起肝纤维化程度减轻^{[1, 7]},说明新生血管形成可能是抑制肝纤维化发生的重要靶点,为肝纤维化的治疗提供了新的研究方向。

然而,最近也有实验证据表明,抑制新生血管形成可能加重纤维化^{[8, 9]}。这提示不同的抗血管生成药物具有不同的靶标,对靶标干预的时空关系可能对肝纤维化发生的进程有截然不同的结果。

病理性血管生成与重构,已经成为处于严重炎症和纤维化状态的慢性肝病的公认指标。在肝纤维化过程中,有多种分子及细胞参与其中,构成有治疗潜力的靶标。

无论何种病因引起的肝损伤,都会刺激肝脏启动创伤愈合反应,细胞迅速扩增,需要大量的血流及营养供应,导致肝组织局部缺氧。在组织缺氧诱导因子 (hypoxia-inducible factor,HIF-1) 的参与下,组织缺氧刺激肝脏细胞上调血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 和血管生成素 I (angiopoietin I,Ang I) 的表达,VEGF I型受体 (fms-like tyrosine kinase 1,Flt-1) 和II型受体 (fetal liver kinase-1,Flk-1) 以及Ang I受体 (tunica interna endothelial cell kinase-2,Tie-2) 的表达也上调。同时,具有促纤维化和促血管生成双重作用的其他生长因子,如血小板生长因子 (platelet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF),以及参与细胞外基质 (extracellular matrix,ECM) 重塑和血管生成的基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP)、整合素受体的表达也明显增加^[10]。

缺氧还可引起肝内血管重构,主要表现为肝窦的基底膜沉积和肝窦内皮细胞 (liver sinusoidal endothelial cell,LSEC) 的去窗孔化。肝窦是肝内一个独特的微血管系统,血管由窗孔化的、没有基底膜包围的LSEC构成。这种结构有利于调控肝细胞与肝窦血液的物质交换。发生肝纤维化时,LSEC持续去窗孔化,内皮下基底膜形成,这种现象被称为肝窦毛细血管化。在肝纤维化的病人和实验动物模型的肝脏,都发现明显的肝窦毛细血管化^{[11, 12]},且先于肝纤维化的发生^[12]。

肝星形细胞 (hepatic stellate cell,HSC) 的激活是肝纤维化的中心环节,也是肝内血管生成与血管重构的重要参与者。活化的HSC分泌VEGF和Ang I,促进血管生成。在血管生成分子刺激下,LSEC合成PDGF和TGF-β,从而刺激HSC向血管迁移和募集^[13]。活化的HSC以其触手状结构围绕血管壁延伸,覆盖肝窦血管,与LSEC处于理想的紧密接触状态,从而以旁分泌信号形式,促进血管收缩和持续的肝窦结构变化,实现病理性肝窦重塑^[14]。

LSEC的去窗孔化先于HSC活化,可能是发生肝纤维化的前提条件。窗孔化的LSEC可以抑制HSC的活化,并促进活化的HSC逆转为静息状态。但当LSEC去窗孔化后,则失去对活化HSC的逆转作用^[15]。LSEC窗孔化的维持,取决于肝细胞或HSC旁分泌的VEGF。VEGF通过一氧化氮 (nitric oxide,NO) 依赖和非依赖两种途径,调控LSEC的窗孔化。VEGF对LSEC窗孔化的维持作用,需要NO非依赖途径的参与,可能主要涉及丝裂原 活化蛋白激酶信号通路,通过肌动蛋白细胞骨架调节LSEC窗孔^[16]。NO是内皮细胞一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase,eNOS) 的下游分子,通过可溶性鸟苷酸环化酶 (soluble guanylyl cyclase,sGC)/环磷酸鸟苷 (cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)/蛋白激酶G通路发挥作用。在肝硬化动物模型,早已观察到LSEC细胞内eNOS活性、NO及cGMP水平降低^[17]。研究^[18]表明,sGC激活可以提高LSEC内的NO及cGMP水平,并在肝硬化动物模型逆转LSEC的毛细血管化 (去窗孔化),为促进肝纤维化逆转或防止其进展提供了新研究方向。

活化的HSC不仅仅参与肝内异常血管重构,更重要的是其作为ECM的主要生成细胞,是肝纤维化过程的主角。因此,抑制HSC的活化对于肝纤维化的治疗十分关键。HSC的去活化主要可通过促进其凋亡^[19]、抑制其增殖与迁移、以及促使其恢复到静息状态^[20]等机制实现。关于前两种机制已有大量文献介绍,本文不再赘述。

前述在体内激活sGC信号通路,也可以逆转活化的HSC至静息状态^[16]。但该策略对活化的HSC没有直接作用,因为活化HSC不表达sGC的异源二聚体α1β1,而α1β1型sGC是生成cGMP并启动下游反应所需要的。对已经发生的肝纤维化,激活的sGC通过恢复LSEC窗孔化、窗孔化的LSEC继而与HSC相互作用从而诱导纤维化的逆转,是由LSEC间接实现HSC的去活化。

虽然各种慢性肝病的病因不同,造成肝细胞损伤的机制也不同,但最终发生纤维化的机制却相似,即从特征为免疫细胞浸润和活化的炎症反应开始,逐渐启动伤口愈合反应,包括血管生成和结缔组织的形成。在肝损伤的初始阶段,肝细胞或胆管上皮细胞释放损伤相关分子模式 (damage associated molecular patterns,DAMPs) 分子,如RNA、DNA或警报素等,激活位于肝窦内的枯否细胞。激活的枯否细胞反过来分泌促炎症细胞因子,如白介素-1β (interleukin,IL-1β) 和TNF-α,诱导细胞凋亡,使肝实质细胞受到损害。此外,包括脂多糖在内的病原体相关分子模式 (pathogen associated molecule patterns,PAMPs) 分子,通过Toll样受体4 (Toll-like receptor,TLR4) 激活HSC,导致HSC对TGF-β敏感,并大量分泌趋化因子CCL2 (C-C chemokine ligand 2)。肝内CCL2水平的增加,可促进血液循环内单核细胞进入肝脏的趋化性。单核细胞在肝内分化成为具有促炎症表型的巨噬细胞。来自肝内外的炎症细胞,通过不同途径产生促血管生成因子,诱导血管生成,导致组织血管重构,增加肝内血管阻力,在血管生成和炎症之间创建了一个紧密交联的恶性循环^{[21, 22, 23]}。作者将具有抗炎和抗血管生成双重功能的组织激肽释放酶结合蛋白用于肝纤维化模型,能够显著抑制肝纤维化的发展^{[24, 25]}。

枯否细胞介导肝内炎症反应的作用可能很有限,而来自循环系统的单核细胞肝内浸润、分化,对肝脏炎症、血管生成及纤维化进展发挥关键作用。血液中的单核细胞是组织巨噬细胞和树突状细胞的前体。在肝损伤的情况下,骨髓单核细胞大量积聚在肝损伤部位,并分化为巨噬细胞,成为与纤维化相关主要细胞。根据单核细胞内趋化因子受体、黏附分子和基因表达谱的不同,可将其分为两个亚群,在小鼠体内为Ly6C^hi(Gr1^hi) 和Ly6C^lo(Gr1 ^lo) 亚群,分别对应人体内的CD14⁺⁺CD16^-和CD16⁺亚群。在肝损伤的初期,Ly6C^hi单核细胞迅速浸润肝脏,大量增殖并分化为CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺巨噬细胞。该巨噬细胞可以大量表达诱导性一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase,iNOS),具有促进炎症和纤维化的作用,表现为促进HSC活化、Th1 T细胞分化和TGF-β的释放等^[26]。另一方面,由Ly6C^lo单核细胞亚群分化而成的恢复性巨噬细胞 (CD11b^lo F4/80^hi),却具有促进纤维化逆转的功能。在HSC释放的趋化因子CX3CL1(C-X3-C motif chemokine ligand 1) 作用下,高表达CX3CL1受体CX3CR1 (C- X3-C motif chemokine receptor 1) 的Ly6C^lo巨噬细胞可生产MMP-9、MMP-12和MMP-13,有利于降解过度沉积的ECM,并诱导活化HSC的凋亡。

作为炎症信号的“第一反应者”,Ly6C^hi单核细胞在肝损伤初期即大量向肝脏迁移,并浸润炎症组织。这个 过程高度依赖于Ly6C^hi单核细胞表达的CCR2 (C-C chemokine receptor 2)。活化HSC的高表达CCL2驱动Ly6C^hi单核细胞从骨髓释放并迁移至肝脏,介导其迅速浸润炎症组织。在脂肪肝和脂肪性肝炎小鼠模型 ,采用CCL2抑制剂mNOX-E36进行治疗,发现Ly6C^hi单核细胞向肝脏的迁移明显抑制,肝组织内促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、γ干扰素等水平显著降低,脂肪肝和脂肪性肝炎的发展得以抑制^[27]。另外,在以CCR2基因敲除小鼠建立的CCl₄肝纤维化模型中,Ly6C^hi单核细 胞浸润降低,HSC的活化和肝纤维化的程度均得以抑制^{[26, 28, 29]},提示抑制CCL2/CCR2可能是抑制肝纤维化的有效方法。

Ehling等^[30]最新研究揭示了肝纤维化中炎症与血管生成的关系,表明Ly6C^hi单核细胞的肝内浸润及分化,是促进肝纤维化相关血管生成的重要因素。在四氯化碳及胆管结扎两种纤维化动物模型,CD11b⁺ F4/80⁺Ly6C⁺巨噬细胞的数量随肝脏损伤的积累而逐步增加,且定位在肝脏门静脉局部新形成的血管周围。在肝损伤后,VEGF在CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺巨噬细胞内的表达比正常肝增加10倍,而VEGF在枯否细胞、肝细胞、内皮细胞及HSC内的表达却显著降低。更重要的是,采用mNOX-E36抑制CCL2功能,可有效抑制肝纤维化初期的血管生成。

Baeck等^[31]以CCl₄中毒和代谢障碍 (蛋氨酸/胆碱缺乏饮食) 两种肝纤维化小鼠模型为研究对象,在撤除肝损害后的逆转期,以mNOX-E36抑制CD11b⁺F4/ 80⁺Ly6C⁺巨噬细胞的浸润,使得肝内巨噬细胞亚群间的平衡移向“恢复性”Ly6C^-巨噬细胞亚群,纤维化逆转明显加快。

新血管生成和重构与肝纤维化平行发展、相互促进,提示抗血管生成治疗可能有利于抑制或逆转肝纤维化。在临床前研究中,一些具有抗血管生成活性的药物,表现出良好的抑制肝纤维化发生疗效。但是,也有一些研究发现,抗血管生成反而会促进肝纤维化发生。

广谱受体酪氨酸激酶抑制剂,包括舒尼替尼、伊马替尼和索拉非尼,在肝纤维化动物模型显示出很好的抗炎、抗血管生成及 抗纤维化的功能。舒尼替尼治疗可显著降低CCl₄诱导肝纤维化大鼠体内的肝血管密度、炎性细胞浸润、HSC活力、胶原表达水平等指标。舒尼替尼在临床上用于肿瘤的抗血管生成,对受体酪氨酸激酶家族的多个成员有作用,包括FLT3 (fms-like tyrosine kinase 3) 和干细胞生长因子受体c-kit。其抗血管生成活性归因于抑制VEGFR和PDGFR。另外,抑制PDGFR还有助于抑制活化HSC的功能。索拉非尼则对VEGFR-2、PDGFR-β以及Raf/分裂素调节激酶 (signal-regulated kinase,MEK)/细胞外调节激酶 (extracellular-signal- regulated kinase,ERK) 等多条通路具有抑制作用^[32]。此类药物对炎症、血管生成及纤维化发生的作用,尚不能说明其抑制纤维化的疗效仅仅缘于抗血管生成活性。

采用仅靶向血管生成通路的药物,也能抑制肝纤维化的发生,为证明血管生成是肝纤维化治疗靶点提供了证据。在肝纤维化动物模型,采用VEGFR-1或VEGFR-2的中和抗体抑制VEGF与其受体的相互作用,可显著抑制肝纤维化与血管生成的进程,两者合用作用更彻底^[7]。Ang I是血管发育和重塑不可缺少的,它与受体Tie-2结合,可抵抗内皮细胞凋亡,促进血管出芽或分支,并使血管稳定化。采用Tie-2的胞外结构域抑制Ang I与其受体Tie-2的结合,也可成功同时抑制肝纤维化与血管生成^[1]。但仔细分析其原因,这两种治疗方式的靶细胞实际上至少包括内皮细胞与活化HSC两种。因VEGF与其受体不仅仅在内皮细胞高表达,也在活化HSC内高表达。而Ang I在活化HSC内高表达^[1],可作用于内皮细胞的Tie-2受体。

最近的研究结果,对于抑制VEGF可促进肝纤维化愈合这一观念提出了质疑。Yang等^[33]利用胆汁淤积性纤维化小鼠模型,发现以VEGF中和抗体阻断VEGF,竟然抑制了肝组织修复和纤维化愈合,而在肝组织内转基因表达VEGF反而促进修复和愈合。

VEGF对肝纤维化发生及肝纤维化愈合过程的影响呈现截然不同的双重效果。Yang等^[33]考虑到单核细胞的不同亚群以及对肝纤维化的双重效应,随即探究二者是否有关联。结果发现,MMP13与趋化因子9 (C-X-C motif chemokine ligand,CXCL9) 介导了VEGF的肝内活性。事实上,最初发现的VEGF功能即具有单核细胞趋化剂的作用,可促进血管的通透性。抑制VEGF后,肝窦的渗透性明显受损,肝内单核细胞浸润受到抑制,恢复性巨噬细胞明显减少。而恢复性巨噬细胞生产MMP13的作用,恰恰是驱动纤维化愈合^[34]。通过转基因方法表达的VEGF,可促进枯否细胞生产CXCL9,CXCL9以自分泌和旁分泌方式刺激枯否细胞和HSC生产MMP13,促进肝纤维化的愈合^{[35, 36]}。Stockmann等^[8]在小鼠肺纤维化模型,靶向敲除髓系细胞VEGF基因,导致血管生成减少,肺纤维化损伤加重,与以上Yang等^[33]的结论一致,即特定细胞 (如髓系细胞) 表达的VEGF,可能是调节血管生成与纤维化损伤相互关系的关键。

越来越多的证据表明,血管生成与重构是肝纤维化发生过程中非常重要的环节,以血管生成与重构为靶点进行药物干预,可能成为抑制或逆转肝纤维化的有效手段。在临床前研究中,对肝纤维化过程有抑制作用的有效药物,主要是广谱的受体酪氨酸激酶抑制剂。这类药物早已应用于肿瘤的临床治疗中,并取得了良好的效果。但是,当更换其适应证为肝纤维化或肝硬化时,仍然要制订严格的临床方案进行验证。因这类药物属于细胞毒药物,作用靶点多,分子机制复杂,对于肝纤维化或肝硬化等慢性疾病的治疗,必须慎重。

伴随肝纤维化过程发生的血管生成和重塑,涉及LSEC及肝浸润巨噬细胞等特殊细胞。在炎症、血管生成和纤维化发生三者之间密不可分且相互促进的关系中,对关键细胞及关键信号通路分子的干预,应当成为今后研究的重点。特别是在血管生成抑制过程的研究中出现对肝纤维化过程的双重效果,提示研究者必须重新思考肝纤维化过程中参与炎症与血管生成的各细胞和信号通路分子的时空关系,以便在合适的时间、对合适的细胞或过程进行干预以取得最佳结果。