有机磷化合物由于具有丰富的生物活性及多变的结构类型,一直是药物研究的热点[1]。在众多有机磷衍生物中,膦酸酯类化合物备受关注,在新药设计与合成中扮演着重要角色,文献报道该类衍生物呈现多种生物活性,如抗病毒[2]、抗菌[3]、抗肿瘤[4]、舒张血管[5]等。
其中,有机磷衍生物在抗肿瘤方面的应用一直受到人们的重点关注,从早期的抗癌药物环磷酰胺到双磷酸盐类抗肿瘤药物的出现,人们对含磷抗癌新药的探索始终没有停止过。近年,研究报道表明部分膦酸酯类衍生物具有潜在的抗肿瘤作用[6,7,8],更加引起了人们对该类化合物的注意与研究兴趣。前期,本课题组设计合成了几类不同系列的膦酸酯衍生物,抗肿瘤活性测试显示部分衍生物对胃癌细胞SGC- 7901和肺癌细胞A-549有较好的增殖抑制作用,表现出潜在的抗肿瘤活性[9,10,11]。通过进一步分析几类化合物的构-效关系,发现共有的膦酸酯结构可能是其抗肿瘤作用药效团。因此,以膦酸酯为药效片段,进行合理的分子设计,合成不同结构特点的新化合物,进一步研究其抗肿瘤作用具有重要意义。
2,3-取代芳基丙烯酸作为一种重要有机中间体,应用于医药、农药、化工等多个领域。近年来,有研究报道称许多天然产物或药物活性分子中含有2,3-二苯丙烯酰基片段,且表现出抗肿瘤[12,13,14]、抗炎[15]、抗菌[16]等多种生理活性。其中,该类衍生物在抗肿瘤方面的应用引起了研究者的注意。
基于上述理论研究与文献依据,作者在前期研究基础上,根据活性片段组合原理,将抗肿瘤活性片段膦酸酯与2,3-二芳基丙烯酸结构结合,设计合成了一系列新型E-2,3-二芳基丙烯酰氧基膦酸酯衍生物 (合成路线1),并研究了其抗肿瘤活性。
结果与讨论 1 目标化合物的合成中间体2合成中 (以2a为例) 采用两种方法进行了实验,一是加NaOH回流,二是加无水K2CO3反应后,再加NaOH回流,实验结果表明: 方法二比方法一的产率高25%。
目标物的合成中 (以3a为例) 分别实验了DCC、DCC/DMAP、EDC三种催化缩合剂,结果发现不同催化缩合剂对该反应产率的影响差别较小。因此,选择了价格更便宜的DCC催化合成该反应。
目标化合物结构经IR、1H NMR、13C NMR及元素分析得以确证,理化数据见表 1和表 2。
抗肿瘤活性筛选表明: 目标化合物对肿瘤细胞SGC-7901、A-549、EC-109有一定增殖抑制活性,结果见表 3。从表中可以看出: ① 化合物3c、3i、3k、3l对肿瘤细胞SGC-7901有较好抑制活性; ② 化合物3a、3e、3k对A-549有较好的增殖抑制作用,尤以3e [IC50 = (12.7 ± 1.9) μmol·L-1] 最为突出,与对照药的活性 [IC50 = (8.0 ± 1.5) μmol·L-1] 较为接近; ③ 大多目标化合物对EC-109有较好的抑制活性,其中3g、3k对EC-109的增殖抑制活性最好,IC50分别为 (9.5 ± 1.8) μmol·L-1、(11.5 ± 0.9) μmol·L-1; ④ 所有目标化合物中,3i、3k对SGC-7901、A-549、EC-109三种肿瘤细胞均有较好抑制活性; ⑤ 氟原子的存在可能对抗肿瘤作用有利。同时,对照前期已研究膦酸酯化合物抗肿瘤活性[10],本文部分目标物抗肿瘤活性优于前期设计合成的化合物,进一步证实结构优化、分子设计的有效性。
设计、合成的一系列新型E-2,3-二芳基丙烯酰氧基膦酸酯衍生物对肿瘤细胞SGC-7901、A-549、EC- 109有不同程度的增殖抑制活性。其中,以化合物3i、3k活性最为突出,对3种所测试肿瘤细胞有较好的抑制作用,呈现潜在的抗肿瘤活性,有关该类化合物的进一步结构优化与深入研究十分必要。
实验部分用SGW X-4显微熔点仪测定熔点 (上海精密科学仪器有限公司,温度未校正); NMR用Bruker Avance 400型核磁共振仪测定 (TMS为内标,CDCl3为溶剂); 红外光谱采用Varian傅里叶变换红外分光光度计; 元素分析采用德国Elementar Vavio-Ⅲ型元素分析 仪; 96孔板读取用ELX800酶标仪; 药品与试剂均 为分析纯。
1 化合物的合成 1.1 中间体1的合成在50 mL三颈瓶中加入10 mmol芳香醛和10 mmol亚磷酸二乙酯,使之混合,再将5.9 mmol三乙胺逐滴加入混合液中 (约30 min加完),油浴加热到60~80 ℃,搅拌1.5 h,再室温反应过夜,薄层色谱跟踪监测,减压蒸出三乙胺。重结晶 (乙醚-石油醚=3∶1) 得纯品1。
1.2 中间体2的合成将10 mmol取代苯乙酸、10 mmol芳香醛、9.8 mmol无水碳酸钾和15 mL重蒸乙酸酐加入50 mL三颈瓶中,搅拌升温至100~120 ℃,恒温反应6 h,冷却,加入适量冰水,有红色油状物析出,弃去水层,在油状物中加入10 mL (2 mol·L-1) NaOH溶液回流1 h,过滤,滤液用浓盐酸酸化,有白色沉淀析出,过滤,滤饼用80% 乙醇重结晶,得固体。
1.3 目标化合物3的合成在50 mL三颈瓶中加入5 mmol中间体1和5 mmol中间体2,再加入10 mL无水二氯甲烷,使其溶解,冰盐浴冷却至0 ℃以下,搅拌下逐滴加入1.45 mmol DCC (无水二氯甲烷溶解),反应过程用薄层色谱跟踪监测,8 h后停止反应,抽滤,滤液减压浓缩,得黄色黏稠液。柱色谱纯化 (乙酸乙酯-石油醚=1∶5),浓缩溶剂,得产物。
2 MTT法抗肿瘤活性实验参照文献[17],以顺铂为对照药,将胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A-549和食管癌细胞EC-109 培养液接种于96孔板上,培养24 h,加入不同浓度(0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-1) 待测化合物。培养48 h,弃上清液,加入MTT (10 μL/孔,5 mg·mL-1 磷酸缓冲盐溶液),培养4 h,加入DMSO 150 μL/孔,以酶标分析仪于570 nm测定各孔OD值。实验重复3次,计算IC50值。
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