痛风是目前常见严重的代谢性疾病,以高尿酸血症为特征并通过尿酸在关节处形成晶体,引起与自由基损伤相关的组织损伤,危害患者运动功能并引起巨大痛苦。黄嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase,XO)[1]是一种黄素蛋白酶,存在于多种生物体中,可催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸,在此过程中伴随着超氧阴离子的产生[2]。当体内XO活性过高,引起尿酸生成过多,将导致高尿酸血症,进而引发痛风[3,4]。黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇通过抑制体内XO的活性而减少尿酸生成,对高尿酸血症和痛风产生良好的防治效果[5]。近年又发现,黄嘌呤氧化酶抑制剂对缺血再灌注损伤[6]、内皮损伤[7]和心功能衰竭[8]具有明显的保护作用,有可能成为治疗心血管系统疾病尤其是心衰的药物。虽然XO抑制剂具有现实和潜在价值,但临床应用的该类药物品种极少,而且别嘌醇作为嘌呤类似物,对人体正常嘌呤代谢也会产生不良影响[9],限制了其应用,因此发现和寻找具有新结构的XO抑制剂具有重要的现实意义。
在正常状态下,O2·-自由基作为新陈代谢的活性中间体,在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身具有一定的O2·-清除能力。细胞色素c[10]、超氧化物歧化酶等可以将其转化为无害物质。当细胞受到外界刺激或发生病变时会产生过量的O2·-引起氧化应激,引起多种生理病变[11]。在痛风患者体内,次黄嘌呤和黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶作用被氧化成尿酸过程中会产生大量的超氧阴离子[12],继而引起氧化和抗氧化体系失衡,故痛风患者发生心脑血管疾病的可能性也大为提高[13]。因此,异常状况下O2·-的清除对于维持正常的生理活动具有重要意义。
近年来,陆续报道了关于评价黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和超氧阴离子清除活性的方法。黄嘌呤氧化酶抑制剂活性的测定可以通过定量测定酶的反应产物尿酸以及超氧阴离子的含量。尿酸的含量可以通过分光光度法[14]或液相色谱法[15]的方法来定量。超氧阴离子可通过化学发光方法[16]或光谱法进行定量。电子自旋共振法也可用于检测和量化超氧阴离子[17]。这些方法有时也被用来评估超氧阴离子清除活性化合物。然而,上述方法不能同时测定化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧化物清除活性,且一些方法容易得到假阳性和阴性结果。刘书等[18]利用UHPLC- TQ-MS方法实现了黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和超氧阴离子清除活性的同时检测,这种方法虽然灵敏,但操作较复杂,且成本较高,不能满足快速大量的高通量筛选的要求。
本研究利用自动加样器和384微孔板,通过酶标仪检测紫外与可见光吸收,可以实现化合物黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧阴离子清除活性的双重评价。
材料与方法 试剂丹酚酸A (salvianolic acid A,SAA),中国医学科学院药物研究所新药筛选中心自制,批号20101109; 黄嘌呤 (xanthine,Xan),批号95490,购自Fluka公司; WST-1,生产批号EQ756,购自日本Dojindo Laboratory公司; 焦磷酸钠,批号L590L06,购自Amethyst Chemicals公司; 别嘌呤醇 (allopurinol,Allo),批号A8003,购自北京华迈科生物技术有限责任公司; 黄嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase,XO),批号SLBB1570V,购自美国Sigma Aldrich公司; EDTA,生产批号20120412,购自国药集团化学试剂有限公司。
仪器SpectraMax M5连续光谱酶标测试仪 (MD公司); Corning 384孔紫外板 (Corning Incorporated公司); Mini Sharkeer (MH-1,Kylin-Bell Lab Instruments公司); Purelab Plus型超级应用型超纯水器 (美国PALL公司)。
试剂配制 0.1 mol·L-1焦磷酸钠缓冲液 (Buffer)用双蒸水配制0.1 mol·L-1焦磷酸钠溶液,含0.3 mmol·L-1 EDTA,超声溶解,调pH 8.3,现用现配。
WST-1工作液双蒸水配制WST-1储备液 (6.51 g·L-1),避光4 ℃保存; 取WST-1储备液288 μL + Buffer 6912 μL混匀,避光,现用现配。
黄嘌呤 (Xan) 工作液取双蒸水配制黄嘌呤储备液 (100 mmol·L-1),避光4 ℃保存; 将黄嘌呤储备液稀释为梯度浓度为30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.1 mmol·L-1的工作液。
黄嘌呤氧化酶工作液将母液 (7.2 U·mL-1) 稀释至浓度为100、30、10、3、1、0.3、0.1和0.01 mU·mL-1的工作液。
阳性药黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇 (10 mmol·L-1); 超氧阴离子清除剂丹酚酸A (1 mmol·L-1)。
反应体系的优化 黄嘌呤氧化酶浓度的确定黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸,伴随着超氧阴离子的产生。WST-1与超氧阴离子反应生成水溶性的染料甲臜,该反应步骤可以被黄嘌呤氧化酶抑制剂抑制,也可被超氧阴离子清除剂抑制。通过在450 nm处检测甲臜的光吸收可以定量反映体系中超氧阴离子的含量,从而用于氧自由基清除剂的筛选。尿酸是黄嘌呤氧化酶的终产物,在295 nm处有特异性光吸收,可以通过定量检测尿酸含量,评价黄嘌呤氧化酶的活性,用于筛选样品对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。黄嘌呤氧化酶 设置工作浓度梯度分别为100、30、10、3、1、0.3、0.1 mU·mL-1,Xan浓度为1 mmol·L-1,WST-1为400 μmol·L-1。各组分体积见表 1的标准孔,M5酶标仪双波长检测吸光度 (OD295,OD450),以OD295的动态变化斜率 (k295) 来表示XO的酶反应速率 (v)。绘制反应曲线,选取酶反应速率动态曲线为直线部分的酶浓度为反应最佳酶浓度。
底物黄嘌呤浓度的确定底物黄嘌呤设置工作浓度梯度分别为30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 mmol·L-1,XO浓度10 mU·mL-1,WST-1 400 μmol·L-1。各组分体积见表 1的标准孔,M5酶标仪双波长检测OD295和OD450,以k295来表示XO的酶反应速率,连续测定15 min。绘制反应曲线,选取在15 min内产物生成曲线进入平台期之前的浓度为反应最佳底物浓度。
体系Z 'factor与信噪比计算分别建立黄嘌呤氧化酶反应孔和不加黄嘌呤氧化酶的对照孔各100个,各组分见表 1的标准孔和对照孔。同时进行反应,反应孔的测定值为信号值,对照孔的信号值为体系检测背景值,检测反应体系的Z ' factor和信噪比S/N。
Z ' factor = 1 - 3 × (SD信号 - SD背景) / |M信号 - M背景|
S/N = M信号 / M背景
其中SD为样本标准差; M为平均值。
阳性药确证取384孔酶标板,以黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇和超氧阴离子清除剂丹酚酸A为阳性药。双蒸水稀释别嘌呤醇成梯度浓度为10 000、3 000、1 000、300、100、30、10、3、1、0.3、0.1和0.03 μmol·L-1; 双蒸水稀释丹酚酸A成梯度浓度为300、100、30、10、3、1、0.3、0.1和0.03 μmol·L-1,将阳性药物加入到体系中进行反应,计算其黄嘌呤氧化酶抑制作用和自由基清除作用。反应体系见表 1。
黄嘌呤氧化酶活性用OD295在15 min内的动态变化斜率k295表示: I (%) = (k标准 - k检测) / (k标准 - k空白) × 100%; 自由基清除能力用反应15 min后产物的OD450表示: I (%) = (OD标准 - OD检测) / (OD标准 - OD空白) × 100%。
结果 1 反应体系的优化 1.1 黄嘌呤氧化酶浓度优化50 μL体系中底物Xan工作浓度为1 mmol·L-1,WST-1工作浓度400 μmol·L-1,不同梯度浓度XO反应15 min,在0.01~30 mU·mL-1内,反应速率随XO浓度升高而升高; 当酶浓度达到100 mU·mL-1时反应速率下降,产物不再增加,形成S形曲线 (图 1),表明反应15 min时,此浓度下XO已将体系中的底物 (1 mmol·L-1) 全部耗竭。XO浓度达到30 mU·mL-1时反应速率最大 (图 1A),底物被完全消耗 (图 1B)。选取S形曲线线性部分的中点即10 mU·mL-1为体系最佳酶浓度。
50 μL体系中底物黄嘌呤氧化酶工作浓度为10 mU·mL-1,WST-1工作浓度400 μmol·L-1,加入梯度浓度底物黄嘌呤,动态监测反应产物尿酸和超氧阴离子的产量。Xan浓度小于1 mmol时,反应速率 (图 2A) 和产物 (图 2B) 均随底物浓度增加而迅速增加,当底物浓度大于1 mmol时,反应速率 (图 2A) 和产物 (图 2B) 增速减慢,进入平台期。故50 μL反应体系中,10 mU·mL-1 XO反应15 min,Xan的最佳浓度为1 mmol·L-1。
参照优化条件,建立黄嘌呤氧化酶反应孔 (XO 10 mU·L-1,Xan 1 mmol·L-1) 以及对照孔 (Xan 1 mmol·L-1) 各100个,检测反应体系的Z '-因子和信噪比S/N。黄嘌呤氧化酶活性检测体系的指标k295的Z '-因子为0.537 4 > 0.4,S/N为47.519 9 > 3.5; 指标OD450的Z '-因子为0.507 4 > 0.4,S/N为5.388 9 > 3.5,表明模型稳定可靠 (图 3)。
别嘌醇对反应速率和反应产物自由基的产生均表现出良好的抑制作用; 丹酚酸A只对自由基产生浓度依赖性抑制作用。别嘌醇抑制XO活性的IC50为 (3.28 ± 1.15) μmol·L-1,同时减少氧自由基的生成,其IC50为 (3.31 ± 1.20) μmol·L-1 (图 4A-1,A-2); 丹酚酸A对黄嘌呤氧化酶反应速率没有抑制作用,但可以清除反应产生的氧自由基,其对氧自由基清除的IC50为 (1.44 ± 0.32) μmol·L-1 (图 4B-1,B-2)。说明该体系可以反映黄嘌呤氧化酶抑制剂的活性以及自由基清除剂的清除情况,用于XO抑制剂和自由基清除剂的筛选。
高尿酸血症和痛风的生化基础是体液中尿酸浓度过高,而体内黄嘌呤氧化酶活性异常增高是主要机制,因此黄嘌呤氧化酶是高尿酸血症和痛风的良好治疗靶点。并且,黄嘌呤氧化酶活性异常增高会引起超氧阴离子等一些活性氧的大量产生,进而引起一些并发症的出现。故研发黄嘌呤氧化酶抑制剂以及超氧阴离子清除剂具有很大的临床应用价值。
黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选通过直接检测化合物对XO的抑制活性,评价其对XO的抑制活性。黄嘌呤氧化酶反应产生的氧自由基,与WST-1反应生成的产物甲臜在450 nm处有最大光吸收,这是一个常规的评价自由基清除剂的体系。而XO催化生成的产物尿酸,则在295 nm有最大光吸收。化合物作用在该反应体系后,双波长检测OD295和OD450,可以同时检测化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性和氧自由基清除能力,一个反应检测两个指标,极大节省了资源,具有经济高效的特点。根据此特点,本研究建立黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂复合筛选模型,并对反应条件进行摸索。
在本实验的黄嘌呤氧化酶反应体系中,反应速率用单位时间内产生的尿酸 (检测波长295 nm) 的变化来反映,即OD295在一定时间内变化的斜率k295。在一定温度和pH下 (本实验中体系温度为37 ℃,pH为8.3),当体系中底物浓度大大超过酶浓度时,酶反应速率与酶浓度成正比,作用曲线呈线性。而随着时间延长,体系中底物的消耗导致反应速率逐渐减慢。因此酶反应初速度的测定应该控制在反应初期,以反应速率-酶浓度作图,可以准确反映酶反应速率的点在该曲线的线性部分。XO浓度在3~30 mU·mL-1内反应速率曲线表现为线性,在此浓度区间内酶反应速率可以真实反映酶活性的大小,选取较低的酶浓度10 mU·mL-1,足以保证反应体系结果的准确性,同时避免高浓度酶的浪费。同时,在酶浓度过高、短时间内即将体系中底物耗竭,由于尿酸不再增加,表现出反应速率随着时间延长而下降。因此,当XO浓度达到100 mU·mL-1时,反应速率反而下降。
确定酶浓度后需要确定酶反应所需最佳底物浓度。在酶浓度不变的情况下,当底物浓度很低时,反应速率随底物浓度增加迅速增加; 当底物浓度超过一定范围、反应速率的增幅逐渐下降至底物将酶完全饱和时,反应速率不再加快。因此在反应速率-底物浓度曲线图上,选择反应速率进入平台期前的拐点,作为底物浓度即保证了底物量充足,又避免了浪费。
在反应体系中,WST-1为超氧阴离子生成量的探针,反应体系中标识性产物尿酸为黄嘌呤氧化酶活性指示剂。在正常的酶促反应中,尿酸的生成与超氧阴离子的生成具有一致性。如果化合物具有酶抑制 活性没有超氧阴离子清除活性,则表现为尿酸的减少量与超氧阴离子的减少量一致,在反应指标上体现为酶活性抑制的IC50与超氧阴离子清除的IC50一致; 如果化合物既具有酶抑制活性又具有超氧阴离子清除活性,则尿酸减少量少于超氧阴离子减少量,在反应指标上体现为酶活性抑制的IC50大于超氧阴离子清除的IC50; 如果化合物只具有超氧阴离子清除活性,则只能计算出超氧阴离子清除的IC50; 如果化合物只具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,则只能计算出酶活性抑制的IC50。综上,本模型可以实现化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性以及超氧阴离子清除活性的双重评价。
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