药学学报  2015, Vol. 50 Issue (3): 305-311   PDF    
MDCKII/MDCKII-BCRP细胞模型用于治疗胎儿快速性心律失常系列药物的跨胎盘转运机制的研究
王微, 赵佳佳, 王婷, 王凌, 蒋学华     
四川大学华西药学院, 四川 成都 610041
摘要:研究治疗胎儿快速性心律失常的一系列药物在过表达乳腺癌耐药蛋白 (breast cancer resistance protein, BCRP) 的马丁达比犬肾上皮细胞系MDCKII-BCRP单层细胞模型中的跨膜转运机制, 筛选BCRP底物。利用MDCKII-BCRP和MDCKII单层细胞模型研究索他洛尔 (sotalol)、普萘洛尔 (propranolol)、普罗帕酮 (propafenone)、普鲁卡因胺 (procainamide) 及氟卡尼 (flecainide) 的双向转运特性, 采用HPLC或化学发光仪测定药物含量, 计算其表观渗透系数 (Papp)、外排率 (RE) 和净外排率 (Rnet), 将Rnet > 1.5的药物进行细胞蓄积实验, 考察药物浓度和BCRP抑制剂槲皮素对该药细胞内蓄积的影响。所选择的药物中, 索他洛尔、普萘洛尔、普罗帕酮和普鲁卡因胺在两种细胞单层顶侧 (apical, A) → 基底侧 (basolateral, B) 的转运与B→A的转运之间无显著性差异, Rnet均小于1.5; 氟卡尼浓度为20和5 μmol·L-1时, Rnet分别为1.6和1.9。细胞蓄积实验证实氟卡尼在MDCKII、MDCKII- BCRP细胞内蓄积具有浓度依赖性, 且MDCKII-BCRP细胞内的蓄积量明显低于MDCKII细胞; 当同时在MDCKII-BCRP细胞内加入50 μmol·L-1槲皮素时, 氟卡尼在细胞中的蓄积量显著增加 (P < 0.05)。结果初步提示, 索他洛尔、普萘洛尔、普罗帕酮和普鲁卡因胺可能不是BCRP底物; 而氟卡尼可能是BCRP底物, 因此母体用该药治疗胎儿快速性心律失常时, 母体胎盘滋养层细胞膜上表达的BCRP极有可能会介导其外排, 从而显著影响治疗效果。
关键词胎儿快速性心率失常     乳腺癌耐药蛋白     MDCKII-BCRP细胞     MDCKII细胞     转运机制     氟卡尼    
Transplacental transport mechanisms of drugs for transplacental treatment of fetal tachyarrhythmia of MDCKII/MDCKII-BCRP cell line
WANG Wei, ZHAO Jia-jia, WANG Ting, WANG Ling, JIANG Xue-hua     
West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract: To study the transport mechanisms of drugs for transplacental treatment of fetal tachyarrhythmia, MDCKII-BCRP and MDCKII cell models was used. MDCKII-BCRP and MDCKII cell monolayer model was used to investigate the bi-direction transport of sotalol, propranolol, propafenone, procainamide and flecainide. Drug concentrations were measured by HPLC-UV or chemiluminescence. The apparent permeability coefficient (Papp), efflux rate (RE) and net efflux rate (Rnet) were calculated. Drugs with Rnet greater than 1.5 were further investigated using cellular accumulation experiments with or without a BCRP inhibitor. The Rnet of sotalol, propranolol, propafenone and procainamide were less than 1.5, while Rnet of flecainide with concentrations of 20 and 5 μmol·L-1 were 1.6 and 1.9, respectively. The results showed that the transport of flecainide on MDCKII- BCRP cell monolayer could be mediated by BCRP; and the affinity increased when the concentration of flecainide decreased. Cellular accumulation experiments further suggested that accumulation of flecainide in MDCKII-BCRP cells was significantly lower than that in MDCKII cells in a concentration-dependent manner. BCRP inhibitor quercetin (50 μmol·L-1) significantly increased the accumulation of flecainide in MDCKII- BCRP cells (P < 0.05). Our preliminary data showed that flecainide but not sotalol, propranolol, propafenone or procainamide can be a substrate of BCRP. Thus the effect of flecainide may be affected by the BCRP in the maternal placental trophoblast membrane layer when treating fetal tachyarrhythmia.
Key words: fetal tachyarrhythmia     breast cancer resistance protein     MDCKII-BCRP cell     MDCKII cell     transport mechanism     flecainide    

乳腺癌耐药蛋白 (breast cancer resistance protein,BCRP) 是1998年Doyle等[1]首次从乳腺癌细胞系MCF-7中发现的一种转运体,属于ABC转运体 (ATP- binding cassette transporters) 家族的一员; 主要表达于胎盘合包体滋养层细胞刷状缘膜、小肠结肠上皮细胞、肝小管细胞和大脑微血管内皮细胞上; 在胎盘合包体滋养层细胞刷状缘膜上表达最丰富[2,3],表达量几乎是其他部位的100 倍[4]。这表明BCRP对某些 药物及其代谢物在胎儿体内分布发挥着重要作用。BCRP底物分布广泛,包括化疗药物、抗病毒药、抗生素类、钙离子通道阻断剂、抗癌药和黄酮类等药物[5]。马丁达比犬肾上皮细胞系MDCKII (Madin-Darby canine kidney) 是一种细胞间连接非常紧密的细胞 系,MDCKII-BCRP细胞系是以人BCRP基因转染MDCKII细胞而成,可用于研究BCRP介导的药物转运实验[6],这类细胞生长分化速度快,3~5天即可形成具有紧密连接的细胞单层,因此MDCKII-BCRP细胞模型可用于快速筛选BCRP底物。

胎儿快速性心律失常是引起胎儿发病率和病死率显著增加的重要因素之一,主要发生在妊娠中晚期,目前国际上无明确的治疗指南。主要的治疗措施包括母体给药经胎盘治疗和羊膜腔穿刺直接进行胎儿给药治疗,前者为优先考虑的治疗方法[7]。跨胎盘治疗的药物包括地高辛、索他洛尔、氟卡尼、胺碘酮、普萘洛尔、维拉帕米、普罗帕酮和普鲁卡因胺等,大量回顾性研究表明,地高辛、氟卡尼、索他洛尔和胺碘酮等用于治疗胎儿快速性心律失常疗效较好[8,9,10,11,12,13,14,15],其中地高辛常作为首选药物[11,12,13]。但是胎儿快速性心律失常往往会伴随胎儿水肿,当出现胎儿水肿时,地高辛的疗效显著下降,需改用或联合上述其他药物治疗[9,10,11,12,13,14,15]。上述药物从母体循环进入胎儿体内要经过胎盘合包体滋养层细胞,从而可能受到BCRP的外排作用而影响其进入胎儿体内的量,进而导致治疗失效。此前已有研究报道地高辛[16]和维拉帕米[17]不是BCRP的底物,本实验将采用MDCKII、MDCKII-BCRP细胞模型系统地探讨这些治疗胎儿快速性心律失常的药物 (地高辛、维拉帕米除外) 是否为BCRP的底物,为临床合理用药提供依据。 材料与方法 仪器与试药

PCR扩增仪、Tocan凝胶成像系 统 (上海领成生物科技有限公司); LC-20A仪和紫 外检测器 (日本岛津公司); 化学发光仪、Multiskan MK3酶标仪、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (美国Thermo公司); Millicell-ERS电阻仪 (美国Millipore公司); Transwell® 6孔板系统 (美国Costar公司); MDCKII、MDCKII-BCRP细胞系 (荷兰癌症研究所)。PCR Amplification Kit with TaKaRa Taq、RNAiso Reagent (宝生物工程有限公司); BCA试剂盒 (碧云天生物技术研究所); 盐酸米托蒽醌、盐酸索他洛尔、盐酸普罗帕酮、盐酸普萘洛尔、槲皮素 (中国食品药品检定研究院); 氟卡尼 (加拿大TRC公司); 盐酸普鲁卡因胺 (北京百灵威科技有限公司); 黄酰罗丹明B (SRB)、甲醇、乙腈 (色谱纯,美国Sigma公司); 水为超纯水 (实验室自制); 其他试剂均为分析纯。 MDCKII-BCRP细胞系中BCRP表达及其功能的验证

RT-PCR检测BCRP mRNA的表达 MDCKII、MDCKII-BCRP细胞复苏接种于培养皿,使用含10%胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS) 的达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM),在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养; 培养基隔天换液,待细胞生长至融合程度达80%~90%,用RNAiso Reagent提取总RNA; 并用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录生成cDNA; PCR反应体系 (20 µL): DEPC灭菌水11.9 μL、10X reaction buffer 2 μL、25 mmol·L-1 MgCl2 2 μL、dNTP mixture 1 μL、5' Primer (Forward) 1 μL、3' Primer (Reverse) 1 μL、cDNA 1 μL、Taq DNA polymerase (5 U·μL-1) 0.1 μL; PCR反应条件: 94 ℃初次变性 5 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环; 70 ℃,7 min终止反应。其中5'-Primer: 5'- ggCTTCAgTACTTCAgCATTCCA-3',3'-Primer: 5'-Ag TCCTgggCAgAAgTTTTgTC-3'。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统鉴定。

米托蒽醌在细胞中的转运研究     为进一步考察MDCKII-BCRP细胞系中BCRP功能是否正常,选择BCRP的标志性底物米托蒽醌进行双向转运实验。将处于对数生长期的MDCKII、MDCKII-BCRP细胞以细胞数3×105/孔接种于Transwell® 6孔板中。每个孔由聚碳脂膜分隔成上下两室,即顶侧(apical,A) 和基底侧 (basolateral,B)。将Transwell® 6孔板置37 ℃、5% CO2孵箱中静置培养,隔天更换培养液至细胞形成完整致密的单层 (约4~5天)。采用电位仪监测细胞在不同生长天数时的跨上皮细胞膜电阻 (trans- epithelium electrical resistance,TEER) 值。当TEER ≥ 200 Ω·cm2时,单层细胞模型构建成功,可用于转运实验[18]。去掉培养基,用改良PBS (含Ca2+、Mg2+) 将单层细胞清洗两次,并用改良PBS预孵育20 min,在B侧或A侧加入以改良PBS配制的盐酸米托蒽醌 (20 μmol·L-1),另一侧加入改良PBS,在30、60、90、120、150、180和240 min时从接收室收取样品100 μL,同时立刻加入100 μL改良PBS补足。实验在37 ℃摇床中进行 (40 r·min-1)。用已建立的HPLC-UV法测定接收室的盐酸米托蒽醌浓度[18],计算转运药量dQ、表观渗透系数Papp (公式1)、外排率RE(MDCKII)RE(MDCKII-BCRP)(公式2) 和净外排率Rnet (公式3)。计算公式如下:

Papp = (dQ/dt)/(A*C0) (1)

其中dQ/dt为单位时间药物的转运量,A为聚碳酸酯膜面积,C0为初始浓度。

RE = Papp(B-A)/Papp(A-B) (2)
Rnet = RE(MDCKII-BCRP)/RE(MDCKII) (3)
SRB测定各药物对细胞的毒性

精密称取盐酸索他洛尔、盐酸普鲁卡因胺、盐酸普萘洛尔、盐酸普罗帕酮和氟卡尼适量,用DMSO完全溶解,再用含1% FBS的DMEM培养基稀释,浓度分别为10、25、50、75和100 µmol·L-1,最终DMSO浓度小于0.5%。

以细胞数2×103/孔接种至96孔板,于37 ℃、 5% CO2孵箱中培养24 h后,吸除培养液; 给药孔加入上述药物溶液,对照孔不加药,调零孔不加细胞,只加入空白培养基,每个实验组设3个复孔; 培养

4 h后,在每孔表面轻轻加入50 μL预冷的50% 三氯醋酸 (TCA) 固定,静置5 min,再将培养板移至4 ℃放置1 h; 去除固定液,每孔用去离子水洗5遍,甩干,空气干燥; 每孔加入0.4% SRB液100 μL,在室温放置30 min,用1% 醋酸洗5遍,空气干燥; 10 mmol·L-1 Tris碱液 (pH 10.5) 150 μL振荡溶解5 min; 选择检 测波长562 nm,以调零孔调零,测定各孔光吸收度 (A) 值; 计算抑制率 [抑制率 (%) = (A对照组 - A实验组) / A对照组 × 100%]。 候选药物在MDCKII及MDCKII-BCRP细胞单层上的转运研究

5种药物分别用改良PBS配制成20和5 µmol·L-1溶液,然后按“米托蒽醌在细胞中的转运研究”项下操作,将盐酸米托蒽醌分别换成5种药物,浓度设为20、5 µmol·L-1样品前处理及测定方法

盐酸索他洛尔、盐酸普鲁卡因胺、盐酸普萘洛 尔和盐酸普罗帕酮 采用HPLC-UV法测定,除盐 酸普罗帕酮需采用1.5倍样品体积的乙腈涡旋3 min外,均在进样前12 000 r·min-1离心5 min。色谱条件: Diamonil C18 (250 mm × 4.6 mm,5.0 μm),柱温30 ℃,流速1 mL·min-1,进样量20 μL。4种药物的流动相和检测波长分别为: 0.01 mol·L-1 KH2PO4溶液(磷酸调pH 3.26)∶乙腈∶甲醇= 86∶7∶7,λ = 228 nm; 0.01 mol·L-1 KH2PO4溶液 (磷酸调pH 3.26)∶乙腈= 85∶15,λ = 228 nm; 0.01 mol·L-1 KH2PO4溶液(磷酸调pH 3.26)∶甲醇= 45∶55,λ = 290 nm; 0.01 mol·L-1 (NH4) H2PO4溶液 (磷酸调pH 3.80)∶甲醇 = 45∶55,λ = 250 nm。 氟卡尼

样品12 000 r·min-1离心5 min后,取90 μL于黑色96孔板上,用化学发光仪测定,选择激发波长300 nm,发射波长370 nm,检测样品的荧光值。 细胞蓄积实验验证氟卡尼可能是BCRP的底物 浓度对氟卡尼蓄积量的影响

将对数生长期的MDCKII、MDCKII-BCRP细胞用培养基稀释,以6×105/孔接种于6孔板中,待细胞密度约为80%~90% 时进行蓄积实验。将DMSO溶解的氟卡尼用改良PBS稀释成 5、20、50、75和100 µmol·L-1 5个浓度,其中DMSO含量均小于0.5%; 每个浓度设3个复孔,不含药的培养基为空白孔; 将含药溶液加入6孔板中,反应90 min后,用4 ℃ PBS轻轻洗涤两次以终止反应; 每孔加0.5 mL超纯水用超声破碎仪破碎细胞,含药细胞悬液在4 ℃、12 000×g离心15 min,取上清液用化学发光仪 (同转运实验测定方法) 测定每孔细胞药物含量,同时用BCA法测定每孔总蛋白浓度从而使结果均一化,药物蓄积量用每毫克蛋白所含药量表示。 抑制剂对氟卡尼蓄积量的影响

槲皮素属于黄酮类化合物,能增加BCRP底物米托蒽醌和荧光素-哌唑嗪在MCF/MR和K562/BCRP细胞中蓄积[19]。因 此,本实验考察了槲皮素对氟卡尼在MDCKII-BCRP、MDCKII细胞内蓄积量的影响,在浓度为5、20、50、75和100 µmol·L-1 氟卡尼溶液中分别加入终浓度为50 µmol·L-1槲皮素,求得药物蓄积量。 数据处理与统计分析

每组实验数据以x± s表示。使用SPSS 19.0软件进行数据处理,组间比较采用One-Way ANOVA检验。 结果 1 MDCKII-BCRP细胞系中BCRP表达及其功能的验证

RT-PCR结果表明 (图 1),MDCKII细胞中没有 或检测不到BCRP mRNA的表达,而MDCKII-BCRP细胞中BCRP mRNA表达丰富。BCRP的经典底物 米托蒽醌在上述两种细胞单层的各项参数值见表 1,Rnet为2.2,在MDCKII-BCRP细胞单层上Papp (A-B) 为6.3×10-6 cm·s-1,与文献[20,21]报道一致,表明MDCKII- BCRP细胞系中BCRP功能正常,可作为筛选BCRP底物的细胞模型。

Figure 1 RT-PCR detection of breast cancer resistance protein (BCRP). A: MDCKII cell; B: MDCKII-BCRP cell

Table 1 Papp values of compounds by transwell transport across MDCKII-BCRP and MDCKII cell monolayers. n = 3,x± s. **P < 0.01 vs A-B. A: Apical; B: Basolateral; RE: Efflux rate; Rnet: Net efflux rate
2 SRB测定各药物对细胞的毒性

在浓度为10~100 μmol·L-1下,盐酸索他洛尔 对MDCKII-BCRP和MDCKII细胞的抑制率分别为0~4.35% 和3.29%~6.26%; 盐酸普鲁卡因胺为0~12.17% 和0~5.73%; 盐酸普萘洛尔为0~12.55% 和0~9.81%; 盐酸普罗帕酮为0~10.50% 和0~12.04%; 氟卡尼为2.81%~4.30% 和1.21%~5.63%。结果显示,各孔细胞增殖抑制率均小于15%,提示当浓度低于100 µmol·L-1时,上述5种药物在双向转运过程中对细胞生长的毒性可以忽略。 3 方法学建立 3.1 专属性与线性范围

在选定的色谱条件下,索他洛尔、普鲁卡因胺、普萘洛尔和普罗帕酮的色谱图见图 2,转运液不干扰各药物的测定。以测定的峰面积 (A) 为纵坐标,药物浓度 (C) 为横坐标进行线性回归,得直线方程。 索他洛尔: A = 14 083.405 C + 185.417,r = 0.999,线性范围为0.2~100 µmol·L-1; 普鲁卡因胺: A = 9 263.853 C + 36.774,r = 1.000,线性范围为0.5~25 µmol·L-1; 普萘洛尔: A = 3 469.685 C + 23.369,r = 1.000,线性范围为0.5~50 µmol·L-1; 普罗帕酮: A = 2 461.183 C + 55.043,r = 0.999,线性范围为1~25 µmol·L-1。氟卡尼用化学发光仪测定荧光值,空白转运液PBS为调零孔调零后,药物荧光度值 (A) 为纵坐标,药物浓度 (C) 为横坐标进行线性回归,得直线方程A = 2.279 C + 0.020,r = 1.000,线性范围为1~25 µmol·L-1

Figure 2 HPLC-UV chromatograms for determination of sotalol,procainamide,propranolol and propafenone. A: PBS; B: PBS spiked with sotalol 5 µmol·L-1; procainamide 5 µmol·L-1; propranolol 2.5 µmol·L-1; propafenone 1 µmol·L-1; C: Samples collected from basolateral after a concentration of 20 µmol·L-1 inthe apical
3.2 精密度和回收率

配制极低、低、中、高浓度5种药物溶液,连续3天重复操作,考察方法的日间精密度; 同一天连续5次考察方法的日内精密度。同样配制4种浓度的5种药物溶液,进样后获得峰面积,代入回归方程求得测定值,测定值与加入量之比为方法回收率。结果表明,5种药物的日内和日间RSD值均小于5%,回收率范围为96.74%~103.32%,均满足要求。 3.3 稳定性考察

上述5种药物分别配制低、高浓度的溶液,每个浓度3个样品,置于37 ℃的水浴中,分别于0、4 h取样测定,求得放置4 h的浓度相对0 h的偏差值均小于5%。表明 这5种药物在37 ℃下转运4 h内是稳定的。 4 候选药物在MDCKIIMDCKII-BCRP细胞单层上的转运研究

索他洛尔、普鲁卡因胺、普萘洛尔和普罗帕酮的Rnet均小于1.5,提示这些药物都不是BCRP的底物,而氟卡尼在MDCKII-BCRP细胞模型中,B-A方向的Papp明显大于A-B方向的Papp,即外排的速率明显大于吸收的速率 (P < 0.01),20和5 µmol·L-1两种浓度的Rnet分别为1.6和1.9。当浓度降低时,Rnet增加 (表 1),提示BCRP对低浓度的氟卡尼亲和力更大。在MDCKII细胞模型中,则不存在此差异。因此,推测氟卡尼可能是BCRP的底物。 5 细胞蓄积实验验证氟卡尼可能是BCRP的底物

为了进一步验证氟卡尼可能为BCRP底物,依 次考察了浓度与抑制剂对氟卡尼蓄积量的影响,结果见图 3。由图 3A可知,在不同浓度下,氟卡尼蓄 积量在两种细胞中均随浓度的增加而增加,且在 MDCKII-BCRP细胞中的蓄积量明显低于MDCKII细胞,提示氟卡尼受到BCRP的外排作用,且具有浓度依赖性。由图 3B可知,BCRP抑制剂槲皮素阻断 了BCRP对氟卡尼进入MDCKII-BCRP细胞的外排作用,从而使氟卡尼在MDCKII-BCRP、MDCKII细胞中的蓄积量相当,没有显著性差异。加入槲皮素后,氟卡尼在MDCKII-BCRP细胞内的蓄积量显著高于不加槲皮素的实验组 (P < 0.01,图 2C),也表明槲皮素阻断了BCRP对氟卡尼的外排作用。

Figure 3 Concentration-dependent accumulation of flecainide into MDCKII-BCRP and MDCKII (A). Accumulation of flecainide into MDCKII-BCRP and MDCKII in the presence of the BCRP inhibitor quercetin (50 µmol·L-1) (B). Accumulation of flecainide into MDCKII-BCRP in the absence and presence of the BCRP inhibitor quercetin (50 µmol·L-1) (C). **P < 0.01,***P < 0.001 vs MDCKII-BCRP; △△P < 0.0,△△△P < 0.001 vs flecainide. n = 3
讨论

本研究主要通过测定Transwell膜两侧的跨膜电阻值 (TEER值),以检测细胞单分子的完整性,再利用RT-PCR技术和BCRP经典底物米托蒽醌的双向转运实验分别验证了MDCKII-BCRP细胞中BCRP mRNA表达丰富,而且其外排功能正常,说明此模型用于 后续研究的可靠性。在此基础上,运用MDCKII、MDCKII-BCRP单层细胞模型对5种治疗胎儿快速 性心律失常的药物 (索他洛尔、普鲁卡因胺、普萘洛尔、普罗帕酮和氟卡尼) 进行了BCRP底物的筛选,由于胺碘酮 (PBS配制) 在37 ℃环境下非常不稳定[22],1、5、20 µmol·L-1三种溶液在37 ℃水浴中放置4 h后分别降解至原来的0、44%、72% (结果未给出),避光和加入抗氧化剂也不能得到改善,故本实验未考察。索他洛尔、普鲁卡因胺、普萘洛尔和普罗帕酮的Rnet均小于1.5,提示这些药物转运可能以被动转运为主[23],不受BCRP的介导或受BCRP的影响很小,而氟卡尼的Rnet大于1.5,且浓度降低时,Rnet增加,提示氟卡尼在MDCKII-BCRP细胞模型中转运可能受到BCRP外排影响,即氟卡尼极有可能是BCRP的底物。在细胞蓄积实验中,氟卡尼在MDCKII-BCRP细胞中的蓄积量明显低于MDCKII细胞,且具有浓度依赖性,提 示氟卡尼蓄积过程中极有可能受到了外排转运体的影 响; 加入BCRP抑制剂槲皮素后,氟卡尼在MDCKII-BCRP细胞中的蓄积量明显增加,进一步证明BCRP介导了氟卡尼的外排。氟卡尼在人体内的治疗浓度为0.48~2.41 µmol·L-1 [24],明显低于本实验中所用最低转运浓度 (5 µmol·L-1),所以在母体给药治疗胎儿快速性心律失常时,氟卡尼很可能会受到胎盘上表达丰富的BCRP介导,影响其进入胎儿体内的量,从而影响其药效的发挥,但此推测有待体内实验进一步证实。

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